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Cancer Research

रोगी-व्युत्पन्न अग्नाशय डक्टल एडेनोकार्सिनोमा ऑर्गेनॉइड मॉडल का अलगाव और लक्षण वर्णन

Published: January 14, 2020 doi: 10.3791/60364
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2
1Moores Cancer Center, University of California San Diego, 2Department of Surgery, Division of Surgical Oncology, University of California San Diego

Summary

अग्नाशय के डक्टल एडेनोकार्सिनोमा की रोगी-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड संस्कृतियां एक तेजी से स्थापित 3-आयामी मॉडल हैं जो उच्च निष्ठा के साथ एपिथेलियल ट्यूमर सेल डिब्बों का प्रतिनिधित्व करती हैं, जिससे इस घातक द्रोह में अनुवादात्मक अनुसंधान सक्षम होता है। यहां, हम इन मॉडलों का उपयोग करके प्रासंगिक जैविक परखों को स्थापित करने और प्रचारित करने के लिए विस्तृत तरीके प्रदान करते हैं।

Abstract

अग्नाशय के डक्टल एडेनोकार्सिनोमा (पीडीएसी) सबसे घातक घातक घातक में से एक है। हाल ही में, इस बीमारी के 3-आयामी (3 डी) मॉडलिंग को सक्षम करने वाली अगली पीढ़ी के ऑर्गेनॉइड संस्कृति विधियों का वर्णन किया गया है। रोगी-व्युत्पन्न ऑर्गेनॉइड (PDO) मॉडल को शल्य चिकित्सा नमूनों के साथ-साथ छोटी बायोप्सी और संस्कृति में तेजी से रूप से अलग किया जा सकता है। महत्वपूर्ण बात, ऑर्गेनॉइड मॉडल रोगी के ट्यूमर में पाए गए रोगजनक आनुवंशिक परिवर्तनों को संरक्षित करते हैं और रोगी के उपचार की प्रतिक्रिया के भविष्य कहनेवाला होते हैं, इस प्रकार अनुवादात्मक अध्ययन को सक्षम करते हैं। यहां, हम 3डी, मैट्रिक्स एम्बेडेड, ऑर्गेनॉइड मॉडल का अध्ययन करने के लिए ऊतक संस्कृति कार्यप्रवाह को अनुकूलित करने के लिए व्यापक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। हम प्राथमिक पीडीएसी ऑर्गेनॉइड को अलग-थलग करने और प्रचारित करने के तरीकों और विचारों का विस्तार करते हैं। इसके अलावा, हम वर्णन करते हैं कि प्रयोगशाला में बीस्पोक ऑर्गेनॉइड मीडिया कैसे तैयार किया जाता है और गुणवत्ता नियंत्रित होती है। अंत में, हम ऑर्गेनॉइड मॉडलजैसे न्यूक्लिक एसिड (डीएनए और आरएनए) के अलगाव और दवा परीक्षण के डाउनस्ट्रीम लक्षण वर्णन के लिए परखों का वर्णन करते हैं। महत्वपूर्ण बात यह है कि हम एक अनुसंधान प्रयोगशाला में ऑर्गनॉइड पद्धति को लागू करने के लिए महत्वपूर्ण विचार प्रदान करते हैं ।

Introduction

अग्नाशय के डक्टल एडेनोकार्सिनोमा (पीडीएसी) एक घातक बीमारी है जो ज्यादातर रोगियों में देर से निदान, प्रभावी उपचारों की कमी और परिणामी कम 5 साल की समग्र जीवित रहने की दर है जो 10% से कम1बनी हुई है। केवल 20% रोगियों को उपचारात्मक शल्य चिकित्सा हस्तक्षेप2,3के लिए उपयुक्त स्थानीयकृत रोग का निदान किया जाता है । शेष रोगियों का आमतौर पर कीमोथेरेपी एजेंटों के संयोजन से इलाज किया जाता है जो4,5रोगियों के अल्पसंख्यक में प्रभावी होते हैं । इन दबाने वाली नैदानिक जरूरतों को पूरा करने के लिए, शोधकर्ता सक्रिय रूप से जल्दी पता लगाने की रणनीतियों और अधिक प्रभावी उपचारों के विकास पर काम कर रहे हैं । महत्वपूर्ण खोजों के नैदानिक अनुवाद में तेजी लाने के लिए, वैज्ञानिक आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडल, रोगी व्युत्पन्न विद्वेष, मोनोलेयर कोशिकाओं लाइनों, और सबसे हाल ही में, ऑर्गेनॉइड मॉडल6को नियोजित कर रहे हैं ।

अबदलजनक जनक कोशिकाओं के प्रसार को प्रोत्साहित करने के लिए विकास कारक और Wnt-ligand समृद्ध परिस्थितियों का उपयोग करतीन आयामी एपिथेलियल ऑर्गेनोइड संस्कृति को पहले माउस आंत7 के लिए वर्णित किया गया था और जल्दी से सामान्य मानव अग्नाशय केऊतक8के अनुकूल थे। सामान्य डक्टल ऊतक के अलावा, ऑर्गेनॉइड पद्धति मानव पीडीएसी8के अलगाव, विस्तार और अध्ययन के लिए अनुमति देती है। महत्वपूर्ण बात यह है कि विधि शल्य नमूनों से ऑर्गेनॉइड की स्थापना के साथ-साथ ठीक और कोर सुई बायोप्सी का समर्थन करती है, जिससे शोधकर्ताओं को9,10रोग के सभी चरणों का अध्ययन करने की अनुमति मिल जाती है। दिलचस्प बात यह है कि रोगी-व्युत्पन्न ऑर्गेनॉइड अच्छी तरह से वर्णित ट्यूमर ट्रांसक्रिप्टोमिक उपप्रकारों को फिर से तैयार करते हैं और सटीक दवा प्लेटफार्मों9,11के विकास को सक्षम कर सकते हैं।

पीडीएसी के लिए वर्तमान ऑर्गेनोइड प्रोटोकॉल कीमो-भोली रोगियों से 70% से अधिक रोगी नमूनों के सफल विस्तार को सक्षम करते हैं9. यहां हम रोगी-व्युत्पन्न पीडीएसी ऑर्गेनॉइड को अलग करने, विस्तारित करने और चित्रित करने के लिए हमारी प्रयोगशाला द्वारा नियोजित मानक विधियों को प्रस्तुत करते हैं। अन्य पीडीएसी ऑर्गेनोइड पद्धतियों को12,13 वर्णित किया गया है लेकिन इन विधि की कोई तुलना पूरी तरह से नहीं की गई है। चूंकि यह तकनीक अपेक्षाकृत नई है और जल्दी से आगे बढ़ रही है, इसलिए हम उम्मीद करते हैं कि ये प्रोटोकॉल विकसित और सुधार जारी रखेंगे; हालांकि ऊतक हैंडलिंग और ऑर्गेनोइड संस्कृति के सिद्धांत उपयोगी बने रहेंगे।

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Protocol

अनुसंधान उपयोग के लिए सभी मानव ऊतक संग्रह की समीक्षा की और हमारे आंतरिक समीक्षा बोर्ड (आईआरबी) द्वारा अनुमोदित किया गया था । निम्नलिखित प्रोटोकॉल के सभी एक स्तनधारी ऊतक संस्कृति प्रयोगशाला वातावरण में aseptic शर्तों के तहत किया जाता है।

1. मीडिया की तैयारी

  1. वातानुकूलित मीडिया की तैयारी।
    नोट: मानव अग्नाशय ऑर्गेनॉइड मीडिया को ऑर्गेनोइड विस्तार के लिए पर्याप्त विकास उत्तेजना प्रदान करने के लिए प्रचुर मात्रा में विकास कारकों और पोषक तत्वों के साथ-साथ वातानुकूलित मीडिया पूरकता की आवश्यकता होती है। नीचे वर्णित दोनों वातानुकूलित माध्यमों को व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सेल लाइनों (सामग्री की तालिकादेखें) से तैयार किया जाता है। पूर्ण प्रोटोकॉल और सामग्री के लिए, कृपया निर्माताओं की वेबसाइटों का उल्लेख करें।
    1. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार आर-स्पॉन्डिन 1 वातानुकूलित मीडिया का उत्पादन करें।
      1. सबसे पहले, प्रचुर मात्रा में सीरम (10%) की उपस्थिति में उपयुक्त एंटीबायोटिक (Zeocin) चयन विधियों का उपयोग करआर-स्पॉन्डिन 1 व्यक्त करने वाली 293T कोशिकाओं का विस्तार करें। वातानुकूलित मीडिया का उत्पादन करते समय, एंटीबायोटिक चयन को वापस लें और धो लें और सीरम को धोदें जैसे कि अंतिम वातानुकूलित मीडिया में कोई एंटीबायोटिक और सीरम मौजूद न हो। महत्वपूर्ण बात, वातानुकूलित मीडिया को क्रॉस-संदूषण को रोकने के लिए संग्रह (0.2 माइक्रोन) के बाद स्टरलाइज्ड फ़िल्टर किया जाना चाहिए।
      2. शॉर्ट टर्म यूज के लिए 4 डिग्री सेल्सियस (6 महीने के भीतर) या लॉन्ग टर्म स्टोरेज (6 महीने से ज्यादा) के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें वातानुकूलित मीडिया को स्टोर करें। फ्रीज-गल चक्र से बचना चाहिए।
    2. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार एल-डब्ल्यूएनटी-3ए वातानुकूलित मीडिया का उत्पादन करें।
      1. सबसे पहले, प्रचुर मात्रा में सीरम (10%) की उपस्थिति में उचित एंटीबायोटिक (जी-418) चयन विधियों का उपयोग करएल-डब्ल्यूएनटी-3ए व्यक्त करने वाली एल-एम (टीके-) कोशिकाओं का विस्तार करें। वातानुकूलित मीडिया का उत्पादन करते समय, एंटीबायोटिक चयन को वापस लें और धो लें ताकि अंतिम वातानुकूलित मीडिया में कोई एंटीबायोटिक मौजूद न हो; हालांकि, पूरे कत्ल और कंडीशनिंग में सीरम बनाए रखें। महत्वपूर्ण बात यह है कि एकत्र वातानुकूलित मीडिया को क्रॉस संदूषण को रोकने के लिए निष्फल (0.2 माइक्रोन) फ़िल्टर किया जाना चाहिए।
      2. अल्पावधि उपयोग के लिए 4 डिग्री सेल्सियस या दीर्घकालिक भंडारण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर aliquoted वातानुकूलित मीडिया स्टोर करें। फ्रीज-गल चक्र से बचना चाहिए।
    3. गुणवत्ता नियंत्रण के लिए, आर-स्पॉन्डिन 1 की डब्ल्यूएनटी गतिविधि और एल-डब्ल्यूएनटी-3ए वातानुकूलित मीडिया को अकेले और संयोजन में पहले से प्रकाशित प्रोटोकॉल14के अनुसार परीक्षण करने के लिए एक TOPFLASH परख का प्रदर्शन करें।
  2. बेसल मीडिया की तैयारी: ऑर्गनॉइड काम के लिए पूर्ण ऑर्गेनॉइड मीडिया तैयार करने के साथ-साथ वाशिंग स्टेप्स के लिए बेसल मीडिया का उपयोग करें। 1x, हेप्स (10 एमएम) और पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन (१०० यू/एमएल) की अंतिम एकाग्रता पर ग्लूटामाइन के साथ उन्नत डीएमईएम/एफ-12 को पूरक करें । 4 डिग्री सेल्सियस पर बेसल मीडिया स्टोर करें।
  3. ऑर्गेनोइड पूर्ण मीडिया तैयारी: आर-स्पॉन्डिन 1 वातानुकूलित मीडिया के साथ बेसल मीडिया को 50% v/v की अंतिम एकाग्रता पर 10% v/v, एल-डब्ल्यूएनटी-3ए वातानुकूलित मीडिया की अंतिम एकाग्रता पर पूरक करें, मानव EGF (५० एनजी/mL), मानव FGF (१०० एनजी/mL), मानव गैस्ट्रिन मैं (10 एनएम), माउस नोगिन (१०० एनजी/mL), A83-01 (५०० एनएम), B27 पूरक (1x), निकोटीनामाइड (10 mM), एन-सिसिसिस्टीन (१.२५ mM), और प्राइमोसिन (100 gg/mL) ।
    1. प्राथमिक ऑर्गेनोइड अलगाव, गल ऑर्गेनोइड संस्कृतियों और एकल कोशिकाओं के साथ शुरू होने वाली संस्कृतियों के लिए, 10.5 माइक्रोन की अंतिम एकाग्रता पर Rho kinase अवरोधक Y-27632 शामिल हैं।
    2. एक महीने के भीतर उपयोग के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर बर्फ और स्टोर पर मानव ऑर्गनॉइड पूरा मीडिया तैयार करें। इस कारण से, हम मीडिया की ताजा साप्ताहिक तैयारी की सलाह देते हैं।

2. पीडीएसी ऑर्गेनॉइड का अलगाव

नोट: तहखाने झिल्ली निकालने (बीएमई) समाधान (विकास कारक कम; सामग्री की तालिकादेखें) बर्फ पर 4 डिग्री सेल्सियस वातावरण (फ्रिज या कोल्ड रूम) में कम से कम 12 घंटे के लिए उपयोग करने से पहले । उपयोग करने से पहले कम से कम 12 घंटे के लिए ऑर्गेनॉइड संस्कृति के लिए ऊतक संस्कृति प्लेटों को कम से कम 12 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।

  1. ऊतक की व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए एक बफर भंडारण समाधान में अनुसंधान के लिए शल्य चिकित्सा से हटादिया ट्यूमर नमूना इकट्ठा और परिवहन। बेसल मीडिया या व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ऊतक भंडारण समाधान का उपयोग करें।
  2. नमूना प्राप्त करने के बाद जितनी जल्दी हो सके ऑर्गेनॉइड को अलग करने के लिए आगे बढ़ें। ऊतक को 24 घंटे के बाद सर्जरी तक भंडारण समाधान में संग्रहीत किया जा सकता है और अभी भी ऑर्गेनॉइड उत्पन्न करता है।
  3. एक बार प्रयोगशाला में, ट्यूमर को 10 सेमी ऊतक संस्कृति पकवान में स्थानांतरित करें और भंडारण समाधान को हटा दें।
  4. धातु संदंश के साथ ऊतक को संभालते समय, ट्यूमर को #10 स्केलपेल के साथ 1 मिमी3 या छोटे के छोटे टुकड़ों में माँग ें। बड़े टुकड़ों को पचाने में अधिक समय लगेगा; इसलिए, समरूप ऊतक टुकड़ा आकार उत्पन्न करने का लक्ष्य रखते हैं। यदि ऊतक पहले से ही अलग या 1 मिमी3 टुकड़ों से छोटे में है, तो इस कदम को छोड़ दें।
  5. ऊतक के टुकड़ों को 15 mL शंकुीय ट्यूब पर स्थानांतरित करें जिसमें बेसल मीडिया का 10 एमएल हो। ट्यूब को कई बार उलटकर मिलाएं। 5 मिन के लिए 200 x ग्राम पर ट्यूब को सेंट्रलाइज करें। स्पिन के बाद, ऊतक के टुकड़े खोने से बचने के लिए बेसल मीडिया को ध्यान से हटा दें।
  6. ऊतक के टुकड़ों वाली ट्यूब के लिए बेसल मीडिया के 9 mL और 10x कोमल कोलेजेनेज/हायलुरोनिडेस समाधान के 1 mL जोड़ें । पाचन के दौरान कोशिकाओं के झुरमुट से बचने के लिए, 10 मिलीग्राम/mL DNAse I समाधान के 20 μL के साथ इस समाधान के पूरक । ट्यूब को कई बार उलटकर मिलाएं।
  7. एक न्यूएटर या रोटेटर पर 37 डिग्री सेल्सियस पर एंजाइमैटिक पाचन को इनक्यूबेट करते हैं। पाचन के दौरान पर्याप्त मिश्रण के लिए, ऊतक के टुकड़े लगातार समाधान के माध्यम से आगे बढ़ना चाहिए।
    नोट: ट्यूमर के इस एंजाइमैटिक वियोजन के लिए समय हर नमूने के लिए अनुभवजन्य निर्धारित किया जाना चाहिए । ट्यूमर का एक सफल पाचन ऊतक के टुकड़ों के आकार में कमी की विशेषता है जब तक कि वे नग्न आंखों के लिए स्पष्ट रूप से स्पष्ट नहीं हैं। सहवर्ती रूप से, सूक्ष्म ऊतक के टुकड़े जारी होने के साथ ही समाधान की अस्पष्टता में वृद्धि होगी।
  8. 30 किमी के बाद 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर से शंकुई ट्यूब निकालकर निरीक्षण करें। यदि ऊतक के टुकड़े अभी भी स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे हैं, लगातार मिश्रण के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर विसोशन जारी रखें। इस अवलोकन को हर 30 सीन तब तक दोहराएं जब तक कि अधिकांश या सभी ऊतक ों के टुकड़ों को विप्रेरित न कर दिया जाए। मिश्रण के साथ-साथ ट्यूमर के टुकड़ों के आकार और मात्रा के तार के आधार पर, यह कदम छोटे नमूनों के लिए 30 टिन के रूप में या बड़े ट्यूमर नमूनों के लिए 12 घंटे तक कम ले सकता है।
  9. एक बार एंजाइमैटिक विच्छेदन पूरा हो जाने के बाद, 5 मिन के लिए 200 x ग्राम पर ट्यूब को अपकेंद्रित करें। स्पिन के बाद, एक सेल गोली दिखाई जानी चाहिए और सुपरनेटेंट स्पष्ट होना चाहिए, यह दर्शाता है कि सभी कोशिकाओं को समाधान से बाहर घूमती है। अगर ऐसा नहीं है तो स्पिन को दोहराएं ।
  10. सेल पैलेट खोने से बचने के लिए ध्यान से अधिनायक को हटा दें। ट्यूबों को धीरे-धीरे उलटा के साथ मिलाकर कोशिकाओं को 10 मिलील बेसल मीडिया से धोएं। 5 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर ट्यूब को सेंट्रलाइज करें। कोशिकाओं को खोने से बचने के लिए बेसल मीडिया को ध्यान से हटा दें और कुल दो वॉश के लिए इस वाशिंग स्टेप को एक और बार दोहराएं।
  11. दूसरे धोने के बाद, बेसल मीडिया के सभी को ध्यान से हटा दें और ट्यूब को 5 मिनट के लिए बर्फ पर रखें।
  12. इस समय, ऑर्गेनोइड पूर्ण मीडिया का एक एलिकोट 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में पूर्व-गर्म करने के लिए रखें।
  13. बर्फ पर ट्यूब को बनाए रखते हुए बर्फ ठंड बीएमई के साथ सेल पैलेट मिलाएं। ऑर्गेनोइड आइसोलेशन के लिए सीडिंग घनत्व अधिक होना चाहिए। एक छोटी सी गोली (~ 50 माइक्रोन वॉल्यूम) के लिए बीएमई के 200 माइक्रोन का उपयोग करें, जबकि एक बड़ी गोली (~ 200 माइक्रोन वॉल्यूम) के लिए बीएमई के 800 माइक्रोन का उपयोग करें। समाधान में बुलबुले बनाने से बचने के दौरान समाधान समरूप दिखाई देने तक एक p200 पिपेट का उपयोग करके बर्फ पर कोशिकाओं और बीएमई को मिलाएं।
  14. एक पी 200 पिपेट का उपयोग करके पूर्व-गर्म 12 अच्छी प्लेट के एक कुएं के केंद्र में 100 माइक्रोन गुंबद को स्पॉट करें। इसे तब तक दोहराएं जब तक कि सभी बीएमई समाधान को तिरस्कृत न कर दिया जाए। ध्यान से 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर के लिए प्लेट हस्तांतरण करने के लिए BME जेल जमना करने के लिए अनुमति देते हैं।
  15. 10 min के बाद, प्लेट को पुनः प्राप्त करें और प्रति अच्छी तरह से पूर्व-गर्म ऑर्गेनोइड पूर्ण मीडिया के 1 मिलील जोड़ें। बीएमई गुंबद के व्यवधान से बचने के लिए कुएं के किनारे मीडिया को बांटें।
  16. ब्राइटफील्ड में 4x लेंस का उपयोग करके उल्टे ऊतक संस्कृति माइक्रोस्कोप का उपयोग करके सेल के टुकड़ों का निरीक्षण करें।
    नोट: एकल कोशिकाओं और सूक्ष्म ऊतक के टुकड़े स्पष्ट रूप से दिखाई देना चाहिए। एक सफल अलगाव 24-48 घंटे के बाद 10 से अधिक ऑर्गेनोइड की उपस्थिति की विशेषता है; संस्कृति एक सप्ताह के भीतर अनुकूल होनी चाहिए। चूंकि ट्यूमर के नमूने विषम होते हैं, इसलिए कुछ ऑर्गेनोइड आइसोलेशन अधिक चुनौतीपूर्ण होते हैं क्योंकि केवल कुछ ऑर्गेनोइड प्रति अच्छी तरह से बढ़ते हैं, जैसा कि चित्रा 1में दिखाया गया है। इस मामले में, संस्कृति को दो सप्ताह तक जारी रखने की अनुमति दें ताकि निष्क्रियता के लिए उपलब्ध कोशिकाओं की संख्या को अधिकतम किया जा सके। संस्कृति के दौरान मीडिया की खपत और वाष्पीकरण के लिए खाते में, हर 5 दिनों में पूर्व-गर्म ऑर्गेनॉइड पूर्ण मीडिया के 200 माइक्रोन के साथ संस्कृतियों को ऊपर करें।

3. पीडीएसी ऑर्गेनॉइड का पासिंग

  1. ऊतक संस्कृति इनक्यूबेटर से थाली पुनः प्राप्त करें। बाँझ सेल लिफ्टर के साथ, धीरे-धीरे बीएमई गुंबद को उठाएं जैसे कि यह पूर्ण मीडिया में तैर रहा है। अच्छी तरह से नीचे स्क्रैप करने से बचें ताकि प्लास्टिक से जुड़ी किसी भी मोनोलेयर कोशिकाओं को न हटाया जा सके, क्योंकि ये आमतौर पर फाइब्रोब्लास्ट होते हैं।
  2. एक p1000 पिपेट के साथ, ध्यान से बीएमई गुंबद और मीडिया को 15 mL शंकु ट्यूब पर स्थानांतरित करें। हर ऑर्गेनोइड युक्त अच्छी तरह से इस कदम को दोहराएं।
  3. धीरे-धीरे प्रत्येक कुएं को धोएं जिसे ठंडे बेसल मीडिया के 1 मिलील के साथ काटा गया था, और ऑर्गेनॉइड युक्त 15 मिलील ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  4. समाधान और ऑर्गेनॉइड को एक पी1000 पिपेट के साथ अच्छी तरह से मिलाएं और 5 मिन के लिए 200 x ग्राम पर स्पिन करें। कताई के बाद, एक बीएमई परत जिसमें निलंबन में ऑर्गेनोइड होता है और ट्यूब के नीचे एक ऑर्गेनोइड गोली दिखाई देगी। बीएमई/ऑर्गेनॉइड लेयर के नुकसान से बचते हुए, अलौकिक को सावधानी से हटा दें। ट्यूब को बर्फ पर रखें।
  5. ट्यूब में बर्फ-कोल्ड सेल रिकवरी सॉल्यूशन (सीआरएस) के 10 मिलील जोड़ें और उलटा करके अच्छी तरह से मिलाएं। इससे जेल्ड बीएमई के प्रोटीन मैट्रिस को 4 डिग्री सेल्सियस पर डिपॉलीमराइज किया जाएगा। 30 मिन के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट जबकि उलटा द्वारा हर 3 मिन मिश्रण । उपलब्ध होने पर ट्यूब को एक कोल्ड रूम में घुमाने वाले मिक्सर पर रखें या 30 मिन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस फ्रिज।
  6. 30 मिन ऊष्मायन के बाद, 5 मिन के लिए 200 x ग्राम पर स्पिन करें। ऑर्गेनोइड गोली स्पष्ट होनी चाहिए जबकि बीएमई परत चली जानी चाहिए। यदि बीएमई परत आकार में कमी आई है, लेकिन फिर भी दिखाई दे रही है, तो मिश्रण और दोहराने वाले स्पिन के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर अतिरिक्त 30 सीन के लिए इनक्यूबेट करें।
  7. एक बार बीएमई को डिपॉलीमरकिया गया है, तो ऑर्गेनोइड पैलेट के पीछे छोड़कर सीआरएस को हटा दें। विलोपन के साथ मिलाकर 10 मीटर बेसल मीडिया के साथ ऑर्गेनॉइड धोएं। 5 मिन के लिए 200 x ग्राम पर नीचे स्पिन और supernatant हटा दें। ट्यूब को कम से कम 5 मिन के लिए बर्फ पर ऑर्गेनोइड पैलेट के साथ रखें।
  8. वैकल्पिक रूप से, यदि एक एकल कोशिका तैयारी वांछित है, तो पाचन के दौरान कोशिकाओं के झुरमुट से बचने के लिए 3 एमएल ट्राइप्सिन के साथ ऑर्गेनॉइड को इनक्यूबेट करें।
    1. 37 डिग्री सेल्सियस पर एंजाइमैटिक प्रतिक्रिया को 10 00 तक के लिए हर 2 मिन को मिलाने वाली कोमल उलटा के साथ इन्क्यूबेट करें।
    2. एंजाइमैटिक प्रतिक्रिया को रोकने के लिए, बर्फ ठंड बेसल मीडिया के 10 mL जोड़ें और 5 मिन के लिए 200 x ग्राम पर नीचे स्पिन।
    3. कोमल उलटा के साथ मिश्रण करके 10 mL बेसल मीडिया के साथ कोशिकाओं को धोएं। 5 मिन के लिए 200 x ग्राम पर नीचे स्पिन और supernatant हटा दें और धोने एक और समय दोहराएं। ट्यूब को कम से कम 5 मिन के लिए बर्फ पर सेल पैलेट के साथ रखें।
      नोट: हम बड़ी संख्या में ऑर्गेनॉइड के साथ सजातीय संस्कृति उत्पन्न करने के लिए ऑर्गेनॉइड के नियमित रखरखाव के दौरान हर 3-5 मार्ग पर इस कदम को निष्पादित करने की सलाह देते हैं।
  9. सेल पैलेट में बर्फ ठंडा बीएमई जोड़ें और बर्फ पर धीरे-धीरे मिलाएं जब तक कि समाधान पी 200 पिपेट का उपयोग करके समरूप न हो जाए। मिश्रण में बुलबुले पैदा करने से बचते हुए, कम से कम 5-10x के ऊपर और नीचे पिपेट करें, पिपेट की नोक को ट्यूब के नीचे के करीब रखने से ऑर्गेनॉइड को यांत्रिक रूप से तोड़ने में मदद मिल सके। एक गाइड के रूप में, 4-6x बीएमई/सेल पैलेट की मात्रा का उपयोग करें ताकि बंटवारे का अनुपात एक मार्ग से दूसरे मार्ग तक 1:2 से अधिक न हो ।
  10. एक पी 200 पिपेट का उपयोग करके पूर्व-गर्म 12 अच्छी प्लेट के एक कुएं के केंद्र में 100 माइक्रोन गुंबद रखें; जब तक बीएमई समाधान के सभी तिरस्कृत किया गया है दोहराएं। ध्यान से 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर के लिए प्लेट हस्तांतरण करने के लिए BME जेल जमना करने के लिए अनुमति देते हैं। 10 min के बाद, प्लेट को पुनः प्राप्त करें और प्रति अच्छी तरह से पूर्व-गर्म ऑर्गेनोइड पूर्ण मीडिया के 1 मिलील जोड़ें। बीएमई गुंबद के व्यवधान से बचने के लिए कुएं के किनारे मीडिया को बांटें।
  11. ऑर्गेनॉइड में सुधार करना चाहिए और 24 घंटे के भीतर बढ़ना शुरू कर देना चाहिए । ऑर्गेनॉइड संस्कृतियों को आम तौर पर संस्कृति घनत्व और कोशिका प्रसार के आधार पर कभी 7-10 दिन बीत जाते हैं । यदि आवश्यक हो, तो विकास कारक की कमी और वाष्पीकरण की भरपाई के लिए हर 5 दिनों में पूर्व-गर्म ऑर्गेनॉइड पूर्ण मीडिया के 200 माइक्रोन के साथ संस्कृतियों को ऊपर करें।

4. पीडीएसी ऑर्गेनॉइड की ठंड और विगलन

  1. ऑर्गेनॉइड को फ्रीज करने के लिए, ऑर्गेनॉइड को काटने के लिए आगे बढ़ें और बीईई को 3.1-3.7 चरणों में वर्णित किया गया है।
  2. सेल पैलेट में, ठंड मीडिया के 1 मिलील जोड़ें, धीरे-धीरे मिलाएं, और मिश्रण को पूर्व-लेबल वाले क्रायोवियल में स्थानांतरित करें।
  3. एक सुरक्षित निरंतर तापमान में कमी बनाए रखने के लिए एक ठंड कंटेनर में क्रायोवियल रखें और एक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में जगह है। 24 से 48 घंटे के बाद, जमे हुए शीशियों को तरल नाइट्रोजन भंडारण में स्थानांतरित करें। ऑर्गेनॉइड इस विधि का उपयोग करके महीनों से वर्षों तक क्रायोपआरक्षित हो सकते हैं।
  4. ऑर्गेनॉइड को पिघलाने के लिए, तरल नाइट्रोजन भंडारण से जमे हुए क्रायोविशियल को पुनः प्राप्त करें। सूखी बर्फ पर जमे हुए शीशी को टिश्यू कल्चर रूम में परिवहन करें।
  5. 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में जमे हुए क्रायोवियल को तेजी से ऑर्गेनॉइड गल करने के लिए रखें और शीशी की सामग्री को 15 मिलील शंकुई ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें बेसल मीडिया के 9 मिलील कमरे के तापमान पर गर्म होता है।
  6. 5 मिन के लिए 200 x ग्राम पर नीचे स्पिन और supernatant हटा दें। ट्यूब को कम से कम 5 मिन के लिए बर्फ पर ऑर्गेनोइड पैलेट के साथ रखें।
  7. बीएमई में फिर से निलंबित करने के लिए आगे बढ़ें और 3.9-3.11 चरणों में वर्णित ऑर्गेनॉइड को प्लेट करें।
    नोट: ऑर्गेनॉइड संस्कृतियां फ्रीज/गल चक्र के बाद धीरे-धीरे ठीक हो जाती हैं, इसलिए संस्कृतियों को पासिंग से पहले दो सप्ताह तक के लिए उगाया जा सकता है।

5. पीडीएसी ऑर्गेनॉइड का लक्षण वर्णन

नोट: ऑर्गेनॉइड का लक्षण वर्णन कई मार्गों के बाद एक स्थापित संस्कृति पर किया जाना चाहिए ताकि फाइब्रोब्लास्ट और प्रतिरक्षा कोशिकाओं जैसे गैर-एपिथेलियल सेल प्रकारों से संदूषण के जोखिम को कम किया जा सके।

  1. पीडीएसी ऑर्गेनॉइड से न्यूक्लिक एसिड निकालना
    1. न्यूक्लिक एसिड निकालने के लिए समर्पित 12 अच्छी प्लेट पर प्लेट ऑर्गेनॉइड। प्लेट प्रति अच्छी तरह से बीएमई के 100 माइक्रोन से अधिक नहीं। पर्याप्त डीएनए/आरएनए उपज के लिए, प्रति संस्कृति कम से 2-4 कुओं की थाली। 5 दिनों तक ऑर्गेनॉइड बढ़ाएं जब तक कि संस्कृतियां जलधे हुए मलबे के करीब न हों लेकिन अत्यधिक कोशिका मलबे से रहित न हों जो लंबी अवधि की संस्कृतियों में जमा होता है।
    2. 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर से प्लेट को पुनः प्राप्त करें और ऑर्गेनोइड पूर्ण मीडिया के सभी ट्रेस को पूरी तरह से हटा दें, जिससे प्लेट पर ऑर्गेनॉइड युक्त केवल बीएमई गुंबद होता है।
    3. प्रत्येक कुएं में एसिड फिनॉल रिएजेंट (सामग्री की तालिकादेखें) के 900 माइक्रोन जोड़ें और समाधान सजातीय होने तक p1000 पिपेट का उपयोग करके अच्छी तरह से मिलाएं। बीएमई एसिड फिनॉल रिविटेशन में पूरी तरह से घुल जाएगा और ऑर्गनॉइड थोड़े से 5 मिन इन्विटेशन के बाद लायसे हो ंगे।
      सावधानी: एसिड फिनॉल एक खतरनाक रसायन है जो रासायनिक जलने का कारण बन सकता है। उचित सुरक्षा और तकनीक का उपयोग कर देखभाल के साथ संभालें।
    4. एक 2 mL ट्यूब के लिए समरूप समाधान हस्तांतरण और क्लोरोफॉर्म के 200 μL जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिन के लिए 12,000 x ग्राम पर इनक्यूबेट 5 मिन और अपकेंद्रित्र।
    5. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार आरएनए और डीएनए निष्कर्षण के लिए आगे बढ़ें। आरएनए को जलीय चरण से निकाला जा सकता है जबकि डीएनए को इंटरफेज और ऑर्गेनिक फेज से निकाला जा सकता है। एक बार शुद्ध और मात्रा निर्धारित, आरएनए और डीएनए एक ही संस्कृति के विभिंन कुओं से अलग उपज बढ़ाने के लिए पूल किया जा सकता है ।
      नोट: (1) जब हम आरएनए के लिए इस न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण विधि का उपयोग करने की दृढ़ता से सलाह देते हैं, तो सुसंस्कृत कोशिकाओं से डीएनए को अलग करने के लिए कई अच्छे तरीके हैं। (2) ऑर्गेनॉइड संस्कृति के भीतर ट्यूमर कोशिकाओं की उपस्थिति का पता लगाने के लिए, हम पीडीएसी हॉलमार्क जीन(KRAS, TP53, SMAD4, CDKN2A)के भीतर म्यूटेशन की पहचान करने के लिए अपनी पसंदीदा अगली पीढ़ी अनुक्रमण विधि का उपयोग करडीएनए अनुक्रमण की सलाह देते हैं ।
  2. पीडीएसी ऑर्गेनॉइड की फार्माकोटाइपिंग
    1. 3.1-3.8 चरणों में वर्णित ऑर्गेनॉइड से एकल कोशिकाओं को अलग करें। सेल संख्या को अधिकतम करने के लिए, एक 12 अच्छी प्लेट के कम से कम 10 अनुकूल कुओं फसल
    2. 1 mL ह्यूमन ऑर्गेनॉइड कंप्लीट मीडिया में सिंगल सेल्स को रीसस्पेंड करें। छोटे सेल झुरमुट (~ 2-10 कोशिकाओं) की उपस्थिति स्वीकार्य है, हालांकि बड़े सेल झुरमुट डाउनस्ट्रीम विश्लेषण को नकारात्मक रूप से प्रभावित करेंगे।
    3. एक स्वचालित सेल काउंटर और रिकॉर्ड सेल व्यवहार्यता का उपयोग कर कोशिकाओं की गणना करें। 1 एमएल निलंबन में मौजूद कोशिकाओं और व्यवहार्य कोशिकाओं की कुल संख्या की गणना करें।
    4. चिकित्सकीय परीक्षण के लिए, एक ३८४ अच्छी तरह से थाली के प्रति अच्छी तरह से थाली १,००० व्यवहार्य कोशिकाओं । एक 384 अच्छी तरह से थाली के लिए हमारा अनुमान है कि हम 400,000 व्यवहार्य कोशिकाओं (400 कुओं के लिए गणना) का उपयोग करेंगे।
    5. कोशिकाओं वाले ऑर्गेनोइड पूर्ण मीडिया के 7.2 मिलील के साथ बीएमई के बर्फ 800 माइक्रोन पर मिश्रण करके चढ़ाना के लिए कोशिकाओं को तैयार करें। एक 384 अच्छी तरह से प्लेट के प्रति अच्छी तरह से बर्फ और प्लेट 20 μL पर मिश्रण रखें। कोशिकाओं को कुशलतापूर्वक प्लेट करने के लिए बर्फ पर रखे गए 12 चैनल के पिपेट और जलाशय का उपयोग करें। थाली से अत्यधिक वाष्पीकरण से बचने के लिए, बाहरी कुओं को जलाशय (60 माइक्रोन पीबीएस या पानी प्रति कुएं) के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन इससे 76 प्रायोगिक कुओं का नुकसान होगा।
    6. एक स्विंग बाल्टी में 1 मिन के लिए 100 x ग्राम पर प्लेट नीचे स्पिन। यह छोटे 20 μL मात्रा और ऑर्गेनॉइड प्लेट के नीचे बसने की अनुमति देता है।
    7. ऑर्गेनॉइड बनाने की अनुमति देने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस टिश्यू कल्चर इनक्यूबेटर में प्लेट रखें। 24 घंटे के बाद, ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोप का उपयोग करके ऑर्गेनॉइड की उपस्थिति की जांच करें।
    8. दवा प्रिंटर या समकक्ष उपकरण का उपयोग करके प्लेट पर डीएमएसओ में भंग चिकित्सीय यौगिकों को खुराक देने के लिए आगे बढ़ें। प्रत्येक दवा की खुराक का परीक्षण कम से कम ट्रिपलिकेट कुओं में करें। एक प्रभावी खुराक-प्रतिक्रिया विश्लेषण करने के लिए, प्रत्येक दवा के लिए खुराक सीमा का निर्धारण अनुभवजन्य रूप से, कम, अप्रभावी, खुराक से शुरू होता है और उच्च खुराक के साथ समाप्त होता है जहां अधिकतम प्रभाव देखा जाता है। कीमोथेरेपी यौगिकों के लिए खुराक पर्वतमाला के उदाहरण हाल ही में9प्रकाशित किए गए हैं ।
    9. कोशिकाओं को 3-5 दिनों के लिए चिकित्सीय यौगिकों में बेनकाब करें।
    10. वैकल्पिक रूप से, परख के अंत में, ऑर्गेनोइड आकार, संख्या और आकृति विज्ञान पर चिकित्सीय प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए प्लेट को छवि दें।
    11. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार ल्यूमिनेसेंस सेल व्यवहार्यता अभिकर्ता (सामग्री की तालिकादेखें) के प्रति अच्छी तरह से 20 μL का उपयोग करव्यवहार्यता का आकलन करें। डेटा अधिग्रहण और डेटा विश्लेषण के लिए एक ग्राफिंग सॉफ्टवेयर के लिए एक ल्यूमिनोमीटर आवश्यक होगा।

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Representative Results

पीडीएसी से ऑर्गेनॉइड को अलग करने से जुड़ी चुनौतियों को समझाने के लिए, हम एक छोटे हाइपोसेलुलर ट्यूमर नमूने से एक रोगी व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड संस्कृति की स्थापना दिखाते हैं। प्रारंभिक चढ़ाना के बाद, केवल कुछ ऑर्गेनोइड प्रति अच्छी तरह से दिखाई दे रहे थे, जैसा कि चित्र 1में दिखाया गया है। ऑर्गेनॉइड को 2 सप्ताह की अवधि में बड़ा बढ़ने की अनुमति दी गई थी और अधिक मजबूत संस्कृति स्थापित करने के लिए हमारे प्रोटोकॉल के अनुसार पारित किया गया था, जैसा कि शुरुआती और देर से पारित होने वाले 1 प्रतिनिधि चित्रों(चित्र 1)में दिखाया गया है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि देर से प्राथमिक अलग में देखे गए बड़े सिस्टिक ऑर्गेनॉइड को बर्फ-ठंडे बीएमई के साथ ऑर्गेनॉइड के मिश्रण के दौरान आसानी से छोटे टुकड़ों में तोड़ दिया गया था, जैसा कि चरण 2.13 में वर्णित है।

फार्माकोटाइपिंग प्रोटोकॉल के परिणाम को प्रदर्शित करने के लिए, हमने इस प्रोटोकॉल में वर्णित एक स्थापित और तेजी से बढ़ते प्रतिनिधि पीडीएसी ऑर्गेनॉइड से एकल कोशिकाओं को तैयार किया। 1,000 व्यवहार्य कोशिकाओं को प्रति अच्छी तरह से चढ़ाया गया था और साइटोटॉक्सिक कीमोथेरेपी एजेंटों, जेसिटाबिन और पैलिटैक्सेल से पहले 24 घंटे से अधिक की वसूली करने की अनुमति दी गई थी। हमने 100 पीएम की कम खुराक के साथ शुरू होने वाली ट्रिपलिकेट में 9-पॉइंट खुराक प्रतिक्रिया परख का प्रदर्शन किया और 2 माइक्रोन की उच्च खुराक के साथ समाप्त किया। 5 दिन के उपचार के बाद, प्रतिनिधि चित्र वाहन (DMSO), 2 μM Gemcitabine, और 2 μM Paclitaxel इलाज कुओं(चित्र ा 2)के लिए लिया गया । चित्र लेने के तुरंत बाद, ल्यूमिनेसेंस सेल व्यवहार्यता अभिकर्ता का उपयोग करके सेल व्यवहार्यता का आकलन किया गया और ग्राफिंग सॉफ्टवेयर(चित्रा 2)का उपयोग करके साजिश रची गई।

Figure 1
चित्र 1: प्रतिनिधि चित्रों को पीडीएसी ऑर्गेनोइड अलगाव के साथ-साथ पहले मार्ग के बाद दिखाया गया है। दोनों जल्दी (1-3 दिन) और देर से (7-10 दिन) समय अंक समय के साथ ऑर्गनॉइड विकास वर्णन करने के लिए दिखाया गया है । स्केल बार = 200 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: खुराक प्रतिक्रिया विश्लेषण। (बाएं) एक स्थापित पीडीएसी ऑर्गेनॉइड संस्कृति का उपयोग करके प्राप्त प्रतिनिधि खुराक प्रतिक्रिया विश्लेषण, त्रुटि सलाखों के रूप में दिखाए गए ट्रिपलिकेट्स के मानक विचलन के साथ। (दाएं) वाहन (DMSO) उपचार के परख के अंत में प्रभाव के साथ ही 2 μM Gemcitabine और 2 μM Paclitaxel चित्रण चित्र । स्केल बार = 100 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

यहां, हम रोगी-व्युत्पन्न पीडीएसी ऑर्गेनॉइड को अलग करने, विस्तार करने और चित्रित करने के लिए वर्तमान प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। ऑर्गेनोइड संस्कृति की स्थापना की हमारी वर्तमान सफलता दर 70% से अधिक है; इसलिए, इन तरीकों को अभी तक सिद्ध नहीं किया गया है और समय के साथ सुधार और विकसित होने की उम्मीद है। नमूना आकार पर महत्वपूर्ण विचार किया जाना चाहिए, क्योंकि पीडीएसी में कम नियोप्लास्टिक सेलुलरिटी होती है। नतीजतन, छोटे नमूनों में कुछ ट्यूमर कोशिकाएं होंगी, और केवल मुट्ठी भर ऑर्गोनॉइड उत्पन्न होंगी। इसके अतिरिक्त, कई रोगियों को शल्य चिकित्सा हस्तक्षेप15से पहले कीमोथेरेपी और/या कीमोडिएशन आधारित neoadjuvant उपचार प्राप्त करते हैं । यदि उपचार किसी विशेष रोगी के लिए प्रभावी है, तो ट्यूमर ऊतक व्यवहार्य कोशिकाओं से रहित हो सकता है। कीमो-भोली रोगी नमूनों का अधिग्रहण इन तरीकों के प्रारंभिक अनुकूलन के लिए पसंद किया जाता है, लेकिन यह हमेशा संभव नहीं होता है। दिलचस्प बात यह है कि हमने पाया है कि ट्यूमर ऊतक के शल्य चिकित्सा हटाने के बाद इस्केमिया समय सफल ऑर्गेनोइड अलगाव के लिए एक प्रमुख कसौटी नहीं है, जब तक कि नमूना 24 घंटे के भीतर संसाधित होता है।

अग्नाशय के डक्टल एडेनोकार्सिनोमा एक बीमारी है जो एक मजबूत डेमोप्लास्टिक प्रतिक्रिया और घने स्ट्रोमल मैट्रिक्स के जमाव की विशेषता है। जबकि ऑर्गेनोइडएस एपिथेलियल डिब्बे के तेजी से अलगाव और विस्तार के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण है, मॉडल पीडीएसी के जटिल स्ट्रोमा को फिर से तैयार नहीं करता है। रोगी व्युत्पन्न विद्वेष16 या एयर लिक्विड इंटरफेस संस्कृति17 जैसे अन्य तरीके एक स्ट्रोमल डिब्बे के लिए अनुमति देते हैं, हालांकि वे जल्दी से विस्तार करना चुनौतीपूर्ण हो सकते हैं। मॉडल प्रणाली चुनते समय, शोधकर्ता को प्रत्येक6की ताकत और कमजोरियों पर सावधानीपूर्वक विचार करना चाहिए।

इस रोग का विषम जीव विज्ञान ऑर्गेनॉइड स्थापना को प्रभावित करता है क्योंकि कुछ रोगी-व्युत्पन्न ऑर्गेनॉइड हमारी स्थितियों में बहुत अच्छी तरह से बढ़ते हैं जबकि अन्य तुलना से बहुत धीमे होते हैं। ऊपर दिए गए प्रोटोकॉल सभी रोगी-व्युत्पन्न ऑर्गेनॉइड को अलग करने और विस्तारित करने के लिए एक WNt लिगांड समृद्ध स्थिति का वर्णन करते हैं, फिर भी अन्य लोगों ने दिखाया है कि कुछ रोगी के ट्यूमर Wnt वातानुकूलित मीडिया11,12की अनुपस्थिति में विकसित करने में सक्षम हैं। आगे परीक्षण के लिए निर्धारित करने के लिए अगर मीडिया की स्थिति की एक श्रृंखला का उपयोग ऑर्गेनोइड की सफल स्थापना को बढ़ाता है, के रूप में हाल ही में अंडाशय कैंसर ऑर्गेनॉइड18के लिए प्रदर्शन किया गया था की आवश्यकता होगी । यह मल्टीप्लेक्स दृष्टिकोण हालांकि ट्यूमर कोशिकाओं की कम संख्या से सीमित है जिसे छोटे रोगी के नमूनों से अलग किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, सामान्य अबदल्ड डक्टल ऑर्गेनॉइड ऑर्गेनोइड अलगाव से उत्पन्न हो सकते हैं, खासकर यदि ट्यूमर ऊतक सामान्य ऊतक9से सटा हुआ है। सामान्य ऑर्गेनोइड संदूषण के जोखिम को कम करने के लिए, बड़े ऊतक नमूनों को अच्छी तरह से संवहनी (रक्त दिखाई देता है) बनाम हाइपोवैस्कुलर क्षेत्रों, और नरम ऊतक बनाम कठिन नोड्यूल का उपयोग करके छोटे स्वतंत्र टुकड़ों में विभाजित किया जा सकता है।

यहां वर्णित विधियां और प्रोटोकॉल ऑर्गेनोइड अलगाव के लिए हमारी प्रयोगशाला में उपयोग किए जाने वाले वर्तमान मानक दृष्टिकोण हैं और उन्हें प्रत्येक प्रयोगशाला वातावरण के लिए परीक्षण और अनुकूलित किया जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, ट्यूमर ऊतक का एंजाइमैटिक विच्छेदन (चरण 2.6 से 2.9) अनुकूलित करने के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। छोटे उपकरण अंतर (न्यूट्राटर बनाम रोटेटर मिक्सर) इस कदम के लिए काफी अलग समय के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । इसके अलावा, कोलेजेनेज/हायलुरोनिडेस मिश्रण की एकाग्रता को बढ़ाने या कम करके ऊतक विच्छेदन को ठीक-ठाक किया जा सकता है। सभी नमूनों का एक ही तरीके से इलाज नहीं करने के लिए देखभाल की जानी चाहिए । उदाहरण के लिए, कुछ मामलों में ऑर्गेनॉइड को यांत्रिक या एंजाइमैटिक विसोजन के बिना उन्नत पीडीएसी रोगियों से उत्तेजित तरल पदार्थ से अलग किया जा सकता है।

डीएनए अनुक्रमण वर्तमान सोने के मानक के लिए उपस्थिति या ट्यूमर ऑर्गेनॉइड की अनुपस्थिति का निर्धारण के रूप में पीडीएसी KRAS, TP53, SMAD4 और CDKN2A में लगातार उत्परिवर्तन से प्रेरित है । ट्रांसक्रिप्टोमिक विश्लेषण विभिन्न ट्यूमर उपप्रकारों को प्रकट कर सकता है जबकि फार्माकोटाइपिंग रोगी-विशिष्ट चिकित्सीय कमजोरियों को उजागर कर सकता है9। ये प्रोटोकॉल पीडीएसी शोधकर्ताओं को रोगी-व्युत्पन्न ऑर्गेनॉइड की अपनी लाइब्रेरी विकसित करने और इन मॉडलों के जीव विज्ञान को प्रोफाइल करने में सक्षम बनाता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम यूसी सैन डिएगो मूर्स कैंसर सेंटर बायोरेपोसिटररी और टिश्यू टेक्नोलॉजी साझा संसाधन, लोवी प्रयोगशाला के सदस्यों और यूसी सैन डिएगो सर्जरी विभाग, सर्जिकल ऑन्कोलॉजी के प्रभाग के समर्थन के लिए आभारी हैं। एएमएल उदारता से NIH CA155620, एक SU2C CRUK Lustgarten फाउंडेशन अग्नाशय के कैंसर ड्रीम टीम पुरस्कार (SU2C-AACR-DT-20-16), और निधि के लिए दानदाताओं अग्नाशय के कैंसर का इलाज द्वारा समर्थित है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12 channel pipette (p20, p100, or p200) with tips
12 well plates Olympus 25-106
15 ml LoBind conical tubes Eppendorf EP0030122208
15 ml tube Rotator and/or nutator
37 °C CO2 incubator
37 °C water bath
384 well plates Corning 4588 Ultra low attachment, black and optically clear
A 83-01 TOCRIS 2939
ADV DMEM ThermoFisher 12634010
Animal-Free Recombinant Human EGF Peprotech AF-100-15
Automated cell counter
B27 supplement ThermoFisher 17504044
Cell Recovery Solution Corning 354253 Reagent that depolymerizes the Basement Membrane Extract at 4 °C
CellTiterGlow Promega G7570 Luminescence cell viability reagent
Chloroform Sigma C2432
Computer
CryoStor CS10 StemCELL Tech 07930 Cell Freezing Solution
Cultrex R-spondin1 (Rspo1) Cells Trevigen 3710-001-K
DMEM ATCC 30-2002
DNase I Sigma D5025
Drug printer Tecan D300e This is the drug printer we use in our laboratory
Excel For data analysis
Extra Fine Graefe Forceps Fine Science Tools 11150-10
FBS ThermoFisher 16000044
G-418 ThermoFisher 10131035
Gastrin I (human) TOCRIS 3006
Gentle Collagenase/hyaluronidase STEMCELL Tech 7919
GlutaMAX ThermoFisher 35050061 Glutamine solution
GraphPad Prism For data analysis
HEPES ThermoFisher 15140122
Laminar flow tissue culture hood
Luminometer
L-Wnt-3A expressing cells ATCC CRL-2647
MACS Tissue Storage Solution Miltenyi biotec 130-100-008
Matrigel Matrix Corning 356230 Basement Membrane Extract (BME), growth factor reduced
Mr. Frosty Freezing Container ThermoFisher 5100-0001
N-Acetylcysteine Sigma A9165
Nicotinamide Sigma N0636
p1000 pipette with tips
p200 pipette with tips
PBS ThermoFisher 10010049
Penicillin/Streptomycin ThermoFisher 15630080
primocin InvivoGen ant-pm-2
Rapid-Flow Filter Units (0.2 µm) ThermoFisher 121-0020
Recombinant Human FGF-10 Peprotech 100-26
Recombinant Murine Noggin Peprotech 250-38
Sterile Disposable Scalpels, #10 Blade VWR 89176-380
Tissue culture centrifuge
Tissue Culture Dishes 10 cm Olympus 25-202
TRIZol ThermoFisher 15596018 Acid Phenol solution
TrypLE Express ThermoFisher 12605010
Y-27632 Sigma Y0503
Zeocin ThermoFisher R25001

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References

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कैंसर अनुसंधान अंक 155 ऑर्गेनॉइड अग्नाशय के कैंसर पीडीए पीडीएसी रोगी-व्युत्पन्न मॉडल सटीक दवा
रोगी-व्युत्पन्न अग्नाशय डक्टल एडेनोकार्सिनोमा ऑर्गेनॉइड मॉडल का अलगाव और लक्षण वर्णन
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Tiriac, H., French, R., Lowy, A. M.… More

Tiriac, H., French, R., Lowy, A. M. Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models. J. Vis. Exp. (155), e60364, doi:10.3791/60364 (2020).

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