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15.14: PCR
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PCR
 
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15.14: PCR

15.14: PCR

Overview

The polymerase chain reaction, or PCR, is a widely used technique for copying segments of DNA. Due to exponential amplification, PCR can produce millions or billions of DNA copies within just a few hours. In a PCR reaction, a heat-resistant DNA polymerase enzyme amplifies the original DNA through a series of temperature changes inside an automated machine called a thermocycler.

PCR is a Versatile Method that Revolutionized Molecular Biology

Kary Mullis developed PCR in 1983, for which he was awarded the 1993 Nobel Prize in Chemistry. Being a relatively fast, inexpensive, and precise way of copying a DNA sequence, PCR became an invaluable tool for numerous applications, including molecular cloning, gene mutagenesis, pathogen detection, gene expression analysis, DNA quantitation and sequencing, and genetic disease diagnosis.

The PCR Reaction Cycle

PCR mimics the natural DNA replication process that occurs in cells. The reaction mixture includes a template DNA sequence to be copied, a pair of short DNA molecules called primers, free DNA building blocks called deoxynucleotide triphosphates (dNTPs), and a specialized DNA polymerase enzyme.

PCR involves a series of steps at high temperatures, requiring a DNA polymerase enzyme that is functional at such temperatures. The most commonly used DNA polymerase is Taq polymerase, named after Thermus aquaticus, the bacterium from which the polymerase was initially isolated. DNA polymerase is unable to synthesize a DNA molecule from scratch, or de novo. Instead, DNA polymerase adds to short DNA molecules, called primers, which bind to the DNA template through complementary base pairing. The primers provide a free 3’ hydroxyl group to which DNA polymerase can attach new dNTPs. There are four types of dNTPs in a PCR, one for each nucleotide in the DNA molecule: dATP, dCTP, dGTP, and dTTP.

Each PCR cycle consists of three steps: Denaturation, Annealing, and DNA Synthesis.

  1. Denaturation. The PCR cycle is initiated by heating the reaction mixture to a high temperature, causing separation of the DNA double helix into two strands. This “melting” process usually occurs at a temperature of 90°C­­–100°C.
  2. Annealing. The reaction mixture is quickly cooled (usually to 50°C–65°C), allowing the two primers to bind to their complementary sequences on the template DNA strands.
  3. DNA Synthesis (Primer Extension). The reaction mixture is heated again, this time to a temperature (usually 60°C–75°C) that allows DNA polymerase to extend the primers by adding dNTPs that pair with the bases in the template strand.

A typical PCR involves 20-40 repeated cycles of these three steps, occurring in the thermocycler. Since the number of DNA molecules is doubled in each cycle, the DNA is amplified exponentially.

Limitations of PCR

If the scientist wants to amplify a specific stretch of the genome, the scientist must know at least part of the target DNA sequence to design appropriate primers. Another potential issue is the nonspecific annealing of primers to partially similar DNA sequences, leading to amplification of non-target DNA. This issue can be controlled by optimizing the reaction conditions. Being a highly sensitive detection method, PCR is also vulnerable to contamination, and even trace amounts of contaminating DNA can cause misleading results. The DNA polymerases used in PCR can be prone to errors. If a mutation happens within the first few cycles, most of the amplified DNA will carry the mutation.

Visão Geral

A reação em cadeia da polimerase, ou PCR, é uma técnica amplamente utilizada para copiar segmentos de DNA. Devido a amplificação exponencial, o PCR pode produzir milhões ou biliões de cópias de DNA em apenas algumas horas. Em uma reação de PCR, uma enzima DNA polimerase resistente ao calor amplifica o DNA original através de uma série de alterações de temperatura dentro de uma máquina automatizada chamada termociclador.

O PCR é um Método Versátil que Revolucionou a Biologia Molecular

Kary Mullis desenvolveu o PCR em 1983, pelo qual recebeu o Prémio Nobel da Química em 1993. Sendo uma maneira relativamente rápida, barata e precisa de copiar uma sequência de DNA, o PCR tornou-se uma ferramenta inestimável para inúmeras aplicações, incluindo clonagem molecular, mutagénese genética, detecção de angentes patogénicos, análise de expressão genética, quantificação e sequenciamento de DNA e diagnóstico de doenças genéticas.

O Ciclo de Reação do PCR

O PCR imita o processo natural de replicação do DNA que ocorre nas células. A mistura da reação inclui uma sequência de DNA molde a ser copiada, um par de moléculas de DNA curtas chamadas primers, blocos de construção de DNA livres chamados deoxinucleótidos trifosfato (dNTPs), e uma enzima DNA polimerase especializada.

O PCR envolve uma série de passos a altas temperaturas, exigindo uma enzima DNA polimerase que seja funcional a tais temperaturas. A DNA polimerase mais usada é a Taq polimerase, nomeada em homenagem a Thermus aquaticus, a bactéria da qual a polimerase foi inicialmente isolada. A DNA polimerase é incapaz de sintetizar uma molécula de DNA do zero, ou de novo. Em vez disso, a DNA polimerase complementa moléculas de DNA curtas, chamadas primers, que se ligam ao molde de DNA através do emparelhamento complementar de bases. Os primers fornecem um grupo hidroxilo 3’ livre ao qual a DNA polimerase pode anexar novos dNTPs. Existem quatro tipos de dNTPs em um PCR, um para cada nucleótido na molécula de DNA: dATP, dCTP, dGTP e dTTP.

Cada ciclo de PCR consiste em três passos: Desnaturação, Anelamento e Síntese de DNA.

  1. Desnaturação. O ciclo de PCR é iniciado aquecendo a mistura de reação a uma alta temperatura, causando a separação da dupla hélice do DNA em duas cadeias. Este processo de “fusão” geralmente ocorre a uma temperatura de 90°C­­–100°C.
  2. Anelamento. A mistura de reação é rapidamente arrefecida (geralmente para 50°C–65°C), permitindo que os dois primers se liguem às suas sequências complementares nas cadeias de DNA do molde.
  3. Síntese de DNA (Extensão de Primers). A mistura de reação é aquecida novamente, desta vez a uma temperatura (geralmente 60°C–75°C) que permite que a DNA polimerase estenda os primers adicionando dNTPs que emparelham com as bases da cadeia molde.

Um PCR típico envolve 20-40 ciclos repetidos desses três passos, que ocorrem no termociclador. Como o número de moléculas de DNA é duplicado em cada ciclo, o DNA é amplificado exponencialmente.

Limitações do PCR

Se o cientista quiser amplificar uma porção específica do genoma, o cientista deve saber pelo menos parte da sequência de DNA alvo para criar primers apropriados. Outro problema potencial é o anelamento não específico de primers a sequências de DNA parcialmente semelhantes, levando à amplificação de DNA não alvo. Este problema pode ser controlado optimizando as condições da reação. Sendo um método de detecção altamente sensível, o PCR também é vulnerável a contaminação, e até mesmo vestígios de DNA contaminante podem originar resultados enganadores. As DNA polimerases usados no PCR podem ser propensas a erros. Se uma mutação acontecer nos primeiros ciclos, a maior parte do DNA amplificado carregará a mutação.


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