双体录音从促性腺激素释放激素（GnRH）神经元下丘脑薄片鉴定绿色荧光蛋白（GFP）

Summary

在神经系统的活动往往需要在特定人群中的神经元的同步行动，从潜在的排放。例如，脉冲促性腺激素释放激素（GnRH）可能需要GnRH神经元之间的协调活动。我们提出我们的方法途径，可靠取得的弥漫性分布的GnRH神经元的同步电生理记录。

Abstract

促性腺激素释放激素（GnRH）是一个小的神经肽的调节垂体释放促黄体激素（LH）和促卵泡激素（FSH）。这些促性腺激素的生殖功能的调节重要。弥漫的地方，他们从轴突末端释放到hypophysiotropic门户系统（1）促性腺激素释放激素GnRH的含神经元分布，整个下丘脑和项目正中隆起。在门户毛细血管，GnRH的垂体前叶促性腺激素释放进入全身循环，以刺激。 GnRH的释放是不连续的，而是在发生偶发脉冲。这是公认GnRH的释放的间歇性地再现（2，3）是必不可少的。

多个GnRH神经元可能基础GnRH的脉冲活动的协调。 GnRH神经元的总肽含量约1.0皮克/细胞（4），其中30％可能包括释放的池。 GnRH的脉冲期间（5，6）的水平，建议多个GnRH神经元可能参与神经分泌。同样，单一单位的活动中提取LH释放期间从下丘脑多单元录音显示多个神经元的活动（7）的变化。要么GnRH的somata或纤维（8）与LH脉冲活动期间记录的电极。因此，这项活动至少部分来自GnRH神经元。

下丘脑GnRH神经元同步发射的机制不明。阐明GnRH神经元发射的机制，协调是一个复杂的问题。首先，GnRH神经元的数量相对较少。在啮齿类动物中，有800-2500 GnRH神经元。目前尚不清楚，情节GnRH的释放GnRH神经元。此外，GnRH神经元弥漫性分布（1）。这有复杂的射击协调的认识，并取得了许多技术方法棘手。我们已经优化了在电流钳模式动作电位的直接检测细胞连接松散的录音，并开发出了录音的方式，允许从对GnRH神经元的同步录音。

Protocol

1. 下丘脑脑片准备，培养和转移以前详细的录音室（9）在动物的GnRH神经元表达GnRH的肽子（10）控制下的绿色荧光蛋白（GFP）。从动物的大脑取出后，大脑是用刀片，以消除不感兴趣的地区封锁。为了确定删除的地区，大脑是放置在其背水面，使下丘脑可以可视化。对于这两种冠状​​面和矢状面片的方向，小脑被删除。冠状切片准备，皮层延髓部分将被删除。在这片取向，皮层外侧地区提供支持大脑切片和银线的位置，以确保在录音室的大脑，大脑提供足够的面积。矢状切片准备，大脑外侧地区和皮质延髓部分提供的脑切片和银线的位置，以确保在录音的大脑以及支持。整个阻断过程中，大脑是不断蘸冷人工脑脊液中使用的玻璃吸管（学联）。
2. 少量的强力胶放在切割平台上。大脑是用抹刀解除。超额学联带来一个Kimwipe锅铲表面和绘图过剩学联从大脑中删除。大脑是轻轻滑落到胶水。触摸大脑或推下来，以确保它是很重要的。大脑本身的重量通常是足够的，以确保它是安全的。
3. 大脑和切割平台上，然后固定在振动切片机和切割以及充满冷学联。寒冷的解决方案两家公司的大脑，并可能在切割过程中不受损坏保护。在寒冷的程度，优化质量片不同的大脑区域不同。编制下丘脑薄片学联温度一般在0 ° C
4. 应缓慢切割片，每个切片从大脑，应该自由浮动。如果片开始卷曲在切割过程中，刀片正在推进的速度应放慢。我们可以使用一个将其展平片的小油漆刷，但这样做风险损害的切片，因此，应尽量避免。慢慢刀片的前进速度优于使用油漆刷。
5. 由于每个切片切断从大脑，它是从切割室撤回，并放置在一个温水浴（约32 ° C）的片孵化室。切片孵化器不断提供与使用的95％O ₂和5％的_CO 2的氧气的混合物。一般情况下，预录片潜伏期从30分钟到2小时不等。
6. 玻璃吸管（3-6MΩ）制造如前所述（9）使用垂直拉拔。拉动的持续时间和温度变化的基础上的吸管拉马使用，玻璃使用的加热丝的拉拔寿命。枪头的形状可以根据用户的喜好也各不相同。一个0.1毫米的开放统一的锥形尖，我们已经取得了良好的成功。在吸管的开口更大，往往会损害神经元，而较小的开口失败导致持续时间长的录音。
7. 涂与Sylgard移液器，以减少电容。拉枪头轻轻涂抹Sylgard 184使用第二个吸管。 Sylgarded提示，然后用热风枪加热固化。这些移液器充满浴灌流。为了增加可视化的枪头，加入少量的Alexa - 568液用于灌装前的移液器移液器解决方案的一部分。我们不重量的Alexa - 568而是使用足以让眼睛的解决方案，粉红。枪头，然后可以根据得克萨斯州红色滤光片显示。
8. 我们已经开发出一种方法来获得电流钳检测使用低阻力密封件（见讨论）的行动潜力。内源性细胞的静息电位没有适用于目前使用的Axon仪器的2B Axoclamp录音。但是，由于低电阻密封，不能只用2B放大器检测动作电位。为了提高信号，第二个放大器（AM系统3000）是用于与Axoclamp 2B系列。这种方法有松动的密封和长期的唱片实用方便。从技术上讲，可以直接测量动作电位，从而规避在电压钳记录模式与方法的问题（见讨论）。
9. 一个需要两个移液器以前选定的两个神经元的表面在同一时间，在类​​似的方式作为对全细胞记录配置的方法。走近两个NE同时urons已比较成功的，在获得独立不是试图对每一个神经元的双唱片。在这段时间内，注入电流脉冲通过从2B放大器在全细胞记录的方法进行。
10. 都移液器必须保持正压，以防止堵塞尖。最好使用悬空3毫升空注射器连接管件的长度吸管​​持有人产生正压双录音。使用注射器，允许上都移液器保持压力。正压应尽快移液器一直在录音室的液放在应用。一种方法移液器顺序选定的神经元。定位后最大的神经元表面的第一个吸管直接，保持积极的留在注射器和叶子在这个位置上的吸管。然后返回到录音室的顶部和降低位置的第二个记录吸管。选择神经元往往是在不同层次的切片。第一移液器应定位在神经细胞最深的是在切片和更肤浅的神经元位置的第二个吸管。这可以防止转向第二吸管定位片将在垂直平面内移动略有移液器进入片的第二个吸管定位。
11. 松散密封（18-30MΩ）将被使用。正压力将促使每个细胞的表面上的一个小酒窝。人们试图释放正压和应用非常轻微的负压密封的第一个神经元。正压释放取出注射器。经口吸气，然后将其应用于油管的自由端。一个健康的神经元的膜将迅速做出反应释放的正压和坚持移液器。轻微的吸力将形成一个密封在一个健康的神经元的适当性。


12. 尝试当一个密封的神经元和失败，吸液管不能被重新使用，因为膜只密封非常干净的玻璃。相反，提高移液器（物镜）离片表面的灌注井的顶部，从浴缸中删除的吸管，干净的移液管的变化，然后返回到切片试图密封另一个单元格。基于这些原因，重要的是要选择多个录音潜在的神经元。对于片不少于4-6录音质量的神经细胞，从中选择，获得双录音的成功是有限的。
13. 建立一个松散的密封电阻后，从2B放大器的电流注入脉冲终止​​。 2B amplifer是摆在系列与3000系列amplifer。在此配置中，2B amplifer的输出作为输入为3000系列amplifer。后者amplifer提供数据采集的信号。
14. 然后重复密封（步骤4）amplifers的重新配置（步骤5）的第二个神经元。

图1。一个时期，增加射击两个GnRH神经元在矢状切片准备宽松的密封连接的记录配置。片是来自一个阉割的男性。每向上偏转表示动作电位。注意GnRH的神经元（顶部的痕迹）展品几乎连续发射，而第二GnRH的神经元具有间歇性的阵阵。这种模式从单一的GnRH神经元的活动期间（7）体内的激素分泌多单元录音中提取的单一单位。请点击这里看到图1的放大版本。

Discussion

活动发生在一些包括GnRH神经元的神经元（基础上激素分泌）的利息小时的时间尺度（5-7）。因此，整个单元的配置，是不是一些由于在细胞内的全细胞记录模式使者的透析的实验目标的最佳选择。其次，一般仅限于动物比大约120天的年龄的全细胞记录。随着年龄的增长，出现神经细胞膜变硬，使得难以实现的高抗密封。此外，如果获得了高抗封，破裂修补破坏密封，留下了一个洞，吸液管和膜之间。这将导致无法使用的录音和神经元离子不平衡，很快就会死于。正常卵巢周期，因此，GnRH脉冲发生器的稳定的活动不会发生，直到以后的生活中超越年龄（7-10个月的年龄在C57BL6女性; 11日，12），当一个人可以合理预期获得全细胞记录可靠。最后，全细胞记录销毁内部和外部的离子浓度的内源性的比率。全细胞记录，内部的任何离子浓度等于在吸液管溶液的离子浓度。这是因为液的量较大，迅速达到平衡，与/替换内源性细胞的体积相对较小。

松散的细胞连接的方法绕过全细胞记录的许多限制。首先，低阻力密封（15-30MΩ）都可以使用。这些都是比较容易形成，即使在老年动物的神经元。其次，不破裂的膜密封补丁。因此，松散的细胞附着录音技术上远远高于全细胞记录更容易。此外，由于细胞膜是完整的，细胞内的组成部分透析也不会发生内源性离子比率保留。不能用于研究突触电流松散的细胞连接的方法，但它是理想的神经元在一个相对非侵入性的方式，从长期的录音。细胞附着的录音也可以使用吸管在细胞内任何标准的解决方案。这提供了额外的好处膜修补破裂的长期录制完成时，与细胞内的标记和标签神经元。

松散的细胞连接的方法已被用于在电压钳记录模式。然而，电压钳记录在宽松的细胞连接的配置有几个方法论问题。首先，记录的信号是一个活动的间接测量。测量的信号（如所谓的动作电流） 的电容电流，收费膜（13） 。这是一个极其重要的方法论问题。电容和电阻的一个记录吸管可以过滤记录的信号。这是非常可能的，小的动作电流在充电，不能正常与大多数放大器，由于探头的高电阻补偿吸管的电容丢失。当这些信号不被发现的，明显的神经元放电模式并不能反映真实的射击模式。同样地，无偿吸管和密封电阻，在测量过程中的重大变化时，如动作电流表示（13）错误。有些放大器可提供电容和电阻“补偿”的吸管和密封，这限制了信号的损失，但大多数放大器的高阻抗头阶段阻碍了最佳补偿。其次，一个人造的情况是对细胞施加。在电压钳模式下，细胞膜周围地区举行一个定势，在这些研究中，0 mV时。这并不意味着有目前没有适用于细胞膜。在电压钳测得的信号实际上是适用于膜，以保持定势的电流量。因此，这种施加的电流可以改变细胞的活性。

GnRH的系统中的双唱片特别具有挑战性由于GnRH神经元和他们的弥漫性分布的数量有限。对于双录音是成功的，操纵者必须极其稳定。即使是轻微的电极运动，可以导致移液器滑落的神经元和停止录音。此外，移液器对细胞的运动（例如，重新定位，以弥补运动）可以改变射击模式。机械敏感的一些离子通道等N型钙通道是：拉伸膜原因重复性活动，在全细胞和细胞贴附记录配置（14）。最后，操纵系统必须能够极为细腻的动作。如上所述双录音，需要两个移液器以前选定的两个神经元的表面密封在同一时间，并尝试一个神经元。如果成功的话，那么人企图封第二个单元格。一般来说，人们不能指望密封，并与每一个尝试高品质录音。然而，这创建一个具有双重录制的特定问题。如果一个人成功的第一个神经元，但第二次失败，一个必须改变的吸管，并尝试不同的细胞。因此，人们必须能够移动而不破坏的成功密封的神经元都在显微镜的浸泡目标和吸液管灌注井的顶部（变化移液器）。

我们的发展和使用的松散的细胞贴附双录音的方法是研究GnRH神经元的一个重大的技术进步。这是可能产生有用的结果，这将有助于在什么样的机制协调活动背后的关键问题背景下，移动领域向前搏动性荷尔蒙分泌的结果。