Summary
Faaliyet nöronal sistemler genellikle belirli bir nüfus içinde nöron senkron aksiyon potansiyeli deşarj gerektirir. Örneğin, bakliyat gonadotropin salgılatıcı hormon (GnRH) muhtemelen GnRH nöronları arasındaki koordine aktiviteyi gerektirir. Biz diffüz dağıtılan GnRH nöron eşzamanlı elektrofizyolojik kayıtlar elde etmek için güvenilir bir metodolojik yaklaşım sunuyoruz.
Abstract
Gonadotropin-releasing hormon (GnRH), luteinizan hormon (LH) ve folikül uyarıcı hormon (FSH) hipofiz salınımını regüle eden küçük bir nöropeptid. Bu gonadotropinler üreme fonksiyonu düzenlenmesi için esastır. Hypophysiotropic portal sistemi (1) içine akson terminallerinin GnRH serbest GnRH içeren nöronlar medyan eminens hipotalamus ve proje boyunca diffüz dağıtılır. Portal kılcal damarlar, GnRH sistemik dolaşıma gonadotropinlerin salgılama ön hipofiz bezi gitti. GnRH salını sürekli değildir ama çok epizodik darbeleri oluşur. GnRH serbest aralıklı şekilde üreme için gereklidir (2, 3) olduğunu kurulmuştur.
Muhtemelen birden fazla GnRH nöron temelini GnRH bakliyat faaliyet Koordinasyon. GnRH nöron Toplam peptid içeriği yaklaşık 1.0 pg /% 30 olasılıkla açıklanmaması bir havuz oluşan hücre (4),. Bir darbe sırasında GnRH (5, 6) düzeyleri, birden fazla GnRH nöron muhtemelen neurosecretion katılan öneririz. Aynı şekilde, tek bir birim faaliyeti birden fazla nöron aktivitesi (7) değişiklikler gösterir LH salıverilmesi süresince hipotalamik çoklu birim kayıtları ayıklanır. LH darbeler sırasında kaydedilen aktivite ile elektrotlar GnRH somata veya liflerini (8) ile ilişkilidir. Bu nedenle, en azından bu faaliyetin bazı GnRH nöron kaynaklanmaktadır.
Mekanizmaları hipotalamik GnRH nöron senkronize ateş sonucu bilinmemektedir. GnRH nöron ateş koordine mekanizmaları nedenlerine açıklık karmaşık bir sorundur. İlk olarak, GnRH nöron sayısı nispeten az. Kemirgenler, 800-2500 GnRH nöron vardır. GnRH nöron epizodik GnRH sürümde yer olduğu açık değildir. Ayrıca, GnRH nöron diffüz (1) dağıtılmıştır. Bu ateş koordinasyon anlayışımızı karmaşık ve birçok teknik yaklaşımlar inatçı yaptı. Biz aksiyon potansiyelleri doğrudan saptanması için geçerli kelepçe modunda gevşek hücre bağlı kayıtları optimize edilmiş ve GnRH nöron çiftleri aynı anda kayıtları için izin veren bir kayıt bir yaklaşım geliştirdik.
Protocol
- Hipotalamik beyin dilimleri, hazırlanan inkübe olan GnRH nöron GnRH peptid organizatörü (10) kontrolü altında yeşil floresan proteininin (GFP) ifade hayvanların daha önce ayrıntılı olarak kayıt odası (9) aktarılır. Hayvan beyin çıkarıldıktan sonra, beynin ilgi bölgelerde ortadan kaldırmak için bir jilet kullanılarak engellendi. Hipotalamus görüntülenmiştir böylece kaldırmak bölgeleri belirlemek için, beyin, dorsal yüzey üzerine yerleştirilir. Koronal ve sagital dilim yönelimleri, beyincik çıkarılır. Koronal kesit hazırlanması için, korteks rostral kısmı kaldırılır. Bu dilim oryantasyon, lateral korteks bölgelerinde beyin dilimleme için destek sağlamak ve beyin kayıt odasında beyin güvenli gümüş tellerin yerleştirilmesi için yeterli alan sağlar. Sagittal kesit hazırlanması için, beynin lateral bölgelerde kaldırılır ve korteksin rostral kısımları dilimleme beyin ve gümüş teller kayıt beyin güvenli yerleşim için destek sağlar. Engelleme işlemi boyunca, beyin sürekli bir cam pipet kullanarak soğuk yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF) ile nemlendirilmiş.
- Superglue küçük bir miktar kesme platformu üzerine yerleştirilir. Beyin bir spatula ile kaldırdı. Aşırı ACSF spatula yüzeye Kimwipe getirmek ve beyin uzak fazla ACSF çizim tarafından kaldırılır. Beyin tutkal üzerine hafifçe öne doğru kaydırılabilir. Güvence altına almak için beyin dokunmayın veya aşağı itmek için çok önemlidir. Beyin kendisi ağırlığı genellikle güvenli olduğundan emin olmak için yeterli.
- Beyin ve kesme platformu sonra titreşimli mikrotom güvenli ve kesme soğuk ACSF ile doludur. Soğuk çözüm her iki firma beyin ve kesim işlemi esnasında hasara karşı korumak olabilir. Farklı beyin bölgeleri kalite dilim optimize soğukluk derecesi değişir. Hipotalamik dilim hazırlanması için ACSF sıcaklığı genellikle 0 ° C'dir.
- Dilimler yavaş yavaş kesilmesi gerekir ve her bir dilim beyin uzak serbestçe yüzen gerekir. Dilimleri kesme işlemi sırasında kıvrılabilir başlarsanız, bıçak ilerlemektedir hızını yavaşlattı olmalıdır. Bir küçük bir boya fırça açılma dilim ama bu risk dilimleri zarar ve böylece kaçınılmalıdır kullanabilirsiniz. Yavaş yavaş bıçak ilerleme hızı, bir boya fırçası kullanarak tercih edilir.
- Olarak beynin her dilim kesilerek, kesim odasından geri ve bir dilim, bir sıcak su banyosu (yaklaşık 32 ° C) kuluçka odasına yerleştirilir. Dilim inkübatör sürekli oksijen ile% 95 O 2 ve% 5 CO 2 karışımı kullanılarak verilir. Genellikle, ön kayıt, 30 dakika ila 2 saat dilim inkübasyon aralıkları.
- Cam pipet (M 3-6), daha önce açıklandığı gibi dikey bir çektirmenin kullanarak (9) imal edilir. Çekerek sıcaklık ve süresi pipet çektirmesi birini kullanır, cam birini kullanır ve ömür boyu çektirmenin ısıtma filament türü türüne göre değişir. Pipet ucu şekli de, kullanıcının tercihine bağlı olarak değişebilir. Biz, 0,1 mm bir açılış ile düzgün konik ucu ile iyi bir başarı elde ettik. Pipet daha büyük açıklıklar ise küçük açıklıklar uzun süre kayıtları neden başarısız nöronların zarar eğilimindedir.
- Pipetler kapasitans azaltmak için Sylgard ile kaplı. Çekti pipet uçları hafifçe ikinci bir pipet kullanarak Sylgard 184 ile kaplanmıştır. Sylgarded ipuçları sonra bir ısı tabancası kullanarak ısı kurutulmuş. Bu pipetler sonra banyo perfüzat ile doldurulur. Pipet uçları görselleştirme artırmak için, Alexa-568 küçük bir miktar, pipetler doldurmadan önce, pipet çözüm olarak kullanılmak üzere banyo çözüm kısmına eklenir. Biz Alexa-568 tartmak değil, çözüm pembe göz açmak için yeterli değilsiniz. Pipet uçları daha sonra Texas kırmızı filtre altında görüntülenebilir.
- Biz düşük direnç mühürler kullanarak (Tartışma) aksiyon potansiyelleri tespit kelepçe akım kayıtları elde etmek için bir yaklaşım geliştirdik. Kayıtlar hücrenin endojen dinlenme potansiyeli uygulanan mevcut kullanarak Axon Enstrüman 2B Axoclamp yapılmaktadır. Ancak, düşük direnç mühür nedeniyle, sadece 2B amplifikatör ile aksiyon potansiyelleri tespit olamazdı. Sinyal artırmak için ikinci bir amplifikatör (AM Sistemleri 3000) serisi ile Axoclamp 2B kullanılır. Bu yaklaşım, uzun vadeli kayıtları gevşek mühürler ve hizmet kolaylığı vardır. Teknik olarak, doğrudan, böylece voltaj kelepçe kayıt modunda yaklaşımı ile sorunları engellemeyi (Tartışma) aksiyon potansiyelleri ölçebilirsiniz.
- Bir yaklaşım olarak tüm hücre kayıt yapılandırma için benzer bir biçimde, aynı zamanda daha önce seçilen iki nöron yüzeyine iki pipetler alır. Ne hem Yaklaşıyoraynı zamanda urons çifti, her nöron bağımsız denemeden daha çift kayıtları elde daha başarılı olmuştur. Bu süre zarfında tüm hücre kayıtları için yaklaşım sırasında yapıldığı gibi, mevcut enjeksiyon bakliyat 2B amplifikatör geçirilir.
- Pozitif basınç ucu tıkanmasını önlemek için her iki pipetler sağlanmalıdır. Pozitif basınç çift kayıtları için en iyi tüp parçasının uzunluğu ile pipet sahibine bağlı bir doldurulmamış 3 ml boş şırınga kullanılarak oluşturulur. Şırınga kullanmak hem pipetler üzerindeki baskıyı sürdürmek için bir olanak sağlar. Pozitif basınç pipet kayıt odasının banyo çözümü yerleştirilmiş olarak en kısa sürede uygulanmalıdır. Bir sırayla pipetler ile seçilen nöronlar yaklaşır. Nöronun büyük yüzey üzerinde doğrudan ilk pipet yerleştirdikten sonra, bir şırınga yerinde bırakarak pozitif korur ve bu pozisyonda pipet bırakır. Bir sonra kayıt odasının üst döner ve pozisyona ikinci kayıt pipet düşürür. Seçilen nöronlar dilim farklı düzeylerde sık sık. Ilk pipet, daha yüzeysel nöron dilim ve pozisyon ikinci pipet derin nöron üzerine yerleştirilmiş olmalıdır. Bu konumlandırma, pipetler, dilim girerken dilim dikey düzlemde hafifçe hareket olarak ikinci pipet konumlandırma değişen ikinci pipet engeller.
- Gevşek contaları (M 18-30) kullanılır. Pozitif basınç, her hücrenin yüzeyinde küçük bir gamzesi neden olacaktır. Bir pozitif basınç serbest ve çok hafif bir negatif basınç uygulayarak ilk nöron sızdırmazlık için çalışır. Pozitif basınç şırıngayı çıkararak piyasaya çıktı. Ağız yoluyla Emme boru serbest sonuna kadar uygulanır. Sağlıklı bir nöron membranı pozitif basıncı serbest bırakmak için hızlı bir şekilde cevap vermek ve pipet uyacaktır. Hafif emiş sağlıklı bir nöron uygun bir direnç ile bir mühür formu.
- Membranlar sadece cam çok temiz mühür beri bir nöron ve başarısız bir mühür çalıştığında, pipet yeniden kullanılabilir değildir. Bunun yerine, iyi perfüzyon üst dilim yüzey uzak pipet (ve mikroskop objektif) yükseltir banyo pipet kaldırır, temiz bir pipet değişiklik ve ardından başka bir hücreye mühür girişimi için dilim döner . Bu nedenle, kayıtlar için birden fazla potansiyel nöronlar seçmek için önemlidir. Hangi seçim için daha az 4-6 kayıt kalitesi nöronlar dilimleri için, çift kayıtları elde edilmesinde başarı sınırlıdır.
- Direnç dayalı gevşek bir mühür kurduktan sonra, 2B amplifikatör mevcut enjeksiyon bakliyat sonlandırılır. 2B amplifer 3000 serisi amplifer ile seri yerleştirilir. Bu yapılandırmada, 2B amplifer 3000 serisi amplifer için giriş çıkış olarak hizmet vermektedir. İkincisi amplifer veri toplama için sinyal sağlar.
- Mühür (adım 4) ve yükselteçlerin yeniden yapılandırılması (5 adım) daha sonra ikinci bir nöron için tekrarlanır.
Şekil 1 A dönemde sagital bir dilim hazırlık gevşek mühür bağlı kayıt yapılandırma kullanarak iki GnRH nöron ateşleme arttı. Dilim bir kısır erkek elde edildi. Her bir aksiyon potansiyeli yukarı doğru sapma gösterir. Ikinci GnRH nöron aralıklı patlamaları sergileyen bir GnRH nöron (üst izleri) neredeyse sürekli ateş sergiler. Bu desen tek GnRH nöron aktivitesi in vivo (7) hormon salgılanması sırasında çok birim kayıtları çıkarılan tek birimlerinin benzer. Lütfen Şekil 1'de bir büyük halini görmek için buraya tıklayınız .
Discussion
GnRH nöron (hormon salgılama dayalı) dahil olmak üzere bazı nöronlar ilgi etkinlik saat zaman ölçeklerinde (5-7) oluşur. Bu nedenle, tüm hücre yapılandırması, tüm hücre kayıt modunda intrasellüler haberciler diyaliz nedeniyle bazı deneysel hedefleri için en iyi seçenek değildir. İkincil olarak, tüm hücre kayıtları genellikle, yaş 120 gün daha az olan hayvanların ile sınırlıdır. Yaş, nöronal membranlar pekiştirmek için, yüksek direnç mühürleri elde etmek zor görünüyor. Ayrıca, yama, pipet ve membran arasında bir delik bırakarak, mührü bozan çatlaması, yüksek direnç sızdırmazlık alır. Bu kullanışsız bir kayıt ve hızlı bir şekilde iyonik dengesizlikler nedeniyle ölecek bir nöron yol açar. Çağın ötesinde, bir makul zaman tüm hücre kayıtları elde tahmin Düzenli over döngüleri, ve böylece, GnRH darbe jeneratörü istikrarlı aktivite (11, 12 C57Bl6 kadınlarda yaş 7-10 ay) yaşlarına kadar meydana gelmez güvenilir. Son olarak, tüm hücre kayıtları, iç ve dış iyon yoğunluğunun endojen oranları yok. Tüm hücre kayıtları ile, herhangi bir iyon konsantrasyonu iç pipet çözüm iyon konsantrasyonu eşittir . / Hücrenin görece küçük bir endojen hacmi yerine pipet çözüm nispeten daha büyük hacimli hızla dengeye ulaşır çünkü.
Gevşek hücre bağlı yaklaşım, tüm hücre kayıtları birçok sınırlamaları circumvents. Birincisi, düşük dirençli bir mühür (M 15-30) kullanılabilir. Bunlar, yaşlı hayvanlarda nöronların bile oluşturmak için nispeten kolay. İkincisi, bir membran rüptürü mühürlü yama değildir. Bu nedenle, gevşek hücre bağlı kayıtları tüm hücre kayıtları daha teknik olarak çok daha kolay. Ayrıca, hücre zarı sağlam olduğundan, hücre içi bileşenleri diyaliz meydana gelmez ve endojen iyonik oranları korunur. Bir sinaptik akımları inceleyerek gevşek hücre bağlı yaklaşım olamaz ama nispeten non-invaziv bir şekilde nöronların uzun vadeli kayıtları için idealdir. Hücre bağlı kayıtları da herhangi bir standart hücre içi çözüm pipet kullanılarak yapılabilir. Bu, uzun süreli kayıt tamamlandığında, membran yama çatlaması ve hücre içi bir işaretleyici ile nöron etiketleme ek bir avantaj sunmaktadır.
Voltaj-klemp kayıt modunda gevşek hücre bağlı yaklaşım kullanılmıştır. Ancak, gevşek hücre bağlı yapılandırma voltaj-klemp kayıt çeşitli metodolojik sorunları vardır. İlk olarak, kaydedilen sinyal faaliyet dolaylı bir ölçütüdür. (Sözde eylem akımı gibi) ölçülen sinyal membran (13) şarj kapasitif akım. Bu son derece önemli metodolojik bir konudur. Bir kayıt pipet kapasitans ve direnç kaydedilen sinyal filtre edebilirsiniz. Bu küçük eylem akımları headstage yüksek direnci nedeniyle çoğu yükselteçler, doğru ile telafi edilemez, pipet kapasitans şarj kayıp olduğunu kuvvetle muhtemeldir. Bu sinyalleri tespit edilmemiş gittiğinizde, nöronun belirgin ateş desen doğru ateş deseni yansıtmamaktadır. Aynı şekilde, eylem akımları ifade edilir (13) sırasında, kompanse pipet ve mühür dirençleri ölçümlerinde önemli hatalara yol açar. Bazı yükselteçler, kapasitans ve direnç için sinyal kaybı sınırlar pipet ve mühür, "tazminat" sağlar, ancak, en yükselteçlerin yüksek direnç baş aşamalarında optimal tazminat engel. İkincisi, yapay bir durum hücre cezası uygulanır. Bu çalışmalar, 0 mV gerilim-klemp modunda, hücre zarının etrafındaki alan, sabit bir potansiyel tutulur. Bu hücre zarı uygulanan hiçbir akım yoktur anlamına gelmez. Voltaj kelepçe ölçülen sinyal aslında sabit potansiyelini korumak için membran uygulanan akım miktarıdır. Bu nedenle, bu uygulanan akım hücre aktivitesini değiştirebilir.
GnRH sistemi Çift kayıtları özellikle GnRH nöron ve yaygın dağılım sınırlı sayıda nedeniyle karşı karşıya olduğu zorluklardır. Çift kayıtları başarılı olması için, manipülatör, son derece kararlı olmalıdır. Elektrot bile hafif bir hareket nöron kayarak Kayıt işlemini bitirmek için pipet neden olabilir. Ayrıca, hücre pipet hareket (örneğin, hareketi telafi etmek için yeniden konumlandırma) ateş desen değiştirebilir. Bazı iyon kanalları N-tipi kalsiyum kanalları gibi mekanik hassas zarı streç tüm hücre ve hücre-bağlı kayıt yapılandırmaları (14) tekrarlanan aktiviteler neden olur. Son olarak, manipülatör sistemi son derece ince ve düzgün hareket yeteneğine sahip olmalıdır. Çift kayıtları ile, yukarıda da belirtildiği gibi, bir iki pipetler alır, aynı zamanda ve mühür girişimleri önceden seçilen iki nöron yüzeyineBir nörondan. Sonra bir girişimleri başarılı olursa, ikinci hücre mühür. Genellikle, her girişimi ile yüksek kaliteli kayıt mühür ve bekleyemezsiniz. Ancak, bu ikili kayıtları belirli bir sorun oluşturur. Bir ilk nöron ile başarılı olur, ancak ikinci başarısız olursa, bir pipet değiştirmek ve farklı bir hücre denemek gerekir. Bu nedenle, başarılı bir şekilde kapalı bir nöron bozmadan iyi perfüzyon (pipet değiştirmek için) en üst mikroskop daldırma objektif ve pipet hareket edebilmek olmalıdır.
Çift kayıtları için gevşek hücre bağlı bir yaklaşım geliştirilmesi ve kullanımı GnRH nöronları inceleyen önemli bir teknik ilerlemedir. Mekanizmaları koordineli faaliyet altında yatan kritik soru bağlamında alanında ileriye taşımak pulsatil hormon salgılanması ile sonuçlanır. Yardımcı olacak faydalı sonuçlar üretmek için muhtemeldir.
Acknowledgments
Ronald L. Calabrese, Dieter Jaeger (Emory Üniversitesi) ve kullanışlı teknik tartışmalar için Ward Yuhas (Axon Instruments) minnettarım.
References
- Silverman, A. J. The gonadotropin releasing-hormone (GnRH) neuronal systems: immunocytochemistry. The Physiology of Reproduction. Knobil, E., Neill, J. D. , Raven Press. New York. (1994).
- Freeman, M. E. The neuroendocrine control of the ovarian cycle of the rat. In: The physiology of reproduction. The Physiology of Reproduction. Knobil, E., Neill, J. D. , Raven Press. New York. (1994).
- Belchetz, P. E., Plant, T. M., Nakai, Y., Keogh, E. J., Knobil, E. Hypophysial responses to continuous and intermittent delivery of hypopthalamic gonadotropin-releasing hormone. Science. 202, 631-633 (1978).
- Maurer, J. A., Wray, S. Luteinizing hormone-releasing hormone quantified in tissues and slice explant cultures of postnatal rat hypothalami. Endocrinology. 140, 791-799 (1999).
- Harris, G. C., Levine, J. E. Pubertal acceleration of pulsatile gonadotropin-releasing hormone release in male rats as revealed by microdialysis. Endocrinology. 14, 163-171 (2003).
- Sisk, C. L., Richardson, H. N., Chappell, P. E., Levine, J. E. In vivo gonadotropin-releasing hormone secretion in female rats during peripubertal development and on proestrus. Endocrinology. 142, 2929-2936 (2001).
- Cardenas, H., Ordog, T., O'Byrne, K. T., Knobil, E. Single unit components of the hypothalamic multiunit electrical activity associated with the central signal generator that directs the pulsatile secretion of gonadotropic hormones. Proc Natl Acad Sci U S A. 90, 9630-9634 (1993).
- Silverman, A. J., Wilson, R., Kesner, J. S., Knobil, E. Hypothalamic localization of multiunit electrical activity associated with pulsatile LH release in the rhesus monkey. Neuroendocrinology. 44, 168-171 (1986).
- Roberts, C. B., O'Boyle, M. P., Suter, K. J. Dendrites determine the contribution of after depolarization potentials (ADPs) to generation of repetitive action potentials in hypothalamic gonadotropin releasing-hormone (GnRH) neurons. J Comput Neurosci. 26, 39-53 (2009).
- Spergel, D. J., Kruth, U., Hanley, D. F., Sprengel, R., Seeburg, P. H. GABA- and glutamate-activated channels in green fluorescent protein-tagged gonadotropin-releasing hormone neurons in transgenic mice. J Neurosci. 19, 2037-2050 (1999).
- Nelson, J. F., Felicio, L. S., Randall, P. K., Sims, C., Finch, C. E. A longitudinal study of estrous cyclicity in aging C57BL/6J mice: I. Cycle frequency, length and vaginal cytology. Biol Reprod. 27, 327-339 (1982).
- Gee, D. M., Flurkey, K., Finch, C. E. Aging and the regulation of luteinizing hormone in C57BL/6J mice: impaired elevations after ovariectomy and spontaneous elevations at advanced ages. Biol Reprod. 28, 598-607 (1983).
- Anson, B. D., Roberts, W. M. Loose-patch voltage-clamp technique. Neuromethods, Patch-clamp analysis: Advanced techniques. Walz, W., Boulton, A. A., Baker, G. B. 35, Humana Press. Place Unknown. 265-286 (2002).
- Calabrese, B., Tabarean, T., Juranka, P., Morris, C. E. Mechanosensitivity of N-type calcium channel currents. Biophys J. 83, 2560-2574 (2002).
- Higure, Y., Katayama, Y., Takeuchi, K., Ohtubo, Y., Yoshii, K. Rapid killing of single neurons by irradiation of intracellularly injected dye. Science. 206, 702-704 (1979).
- Higure, Y., Katayama, Y., Takeuchi, K., Ohtubo, Y., Yoshii, K. Lucifer Yellow slows voltage-gated Na+ current inactivation in a light-dependent manner in mice. J Physiol. 550, 159-167 (2003).
