Dubbla Somatisk Inspelningar från gonadotropinfrisättande hormon (GnRH) Nervceller Märkt med grönt fluorescerande protein (GFP) i hypotalamus Slices

Summary

Aktiviteten i neuronala system kräver ofta synkrona aktionspotentialens utsläpp från nervceller inom en viss population. Till exempel pulser av gonadotropinfrisättande hormon (GnRH) sannolikt kräver samordnad verksamhet mellan GnRH nervceller. Vi presenterar vår metod för att tillförlitligt få samtidiga elektrofysiologiska inspelningar från diffust fördelade GnRH nervceller.

Abstract

Gonadotropinfrisättande hormon (GnRH) är en liten neuropeptid som reglerar hypofysen frisättning av luteiniserande hormon (LH) och follikelstimulerande hormon (FSH). Dessa gonadotropiner är viktiga för regleringen av fortplantningsförmågan. Den GnRH-innehållande nervceller distribueras diffust över hela hypotalamus och projektet till medianvärdet eminens där de släpper GnRH från sina axon terminaler i hypophysiotropic portalen systemet (1). I portalen kapillärerna, reser GnRH till främre hypofysen för att stimulera frisättning av gonadotropiner i kretsloppet. GnRH-utgåvan är inte kontinuerlig utan sker i episodisk pulser. Det är väl etablerat att den intermittenta sätt GnRH-release är viktigt för reproduktion (2, 3).

Samordning av verksamheten i flera GnRH nervceller antagligen ligger bakom pulser GnRH. Totalt peptid innehåll i GnRH-neuron är cirka 1,0 pg / cell (4), varav 30% sannolikt består av öppningsbara poolen. Nivåer av GnRH under en puls (5, 6) föreslår flera GnRH nervceller förmodligen är involverade i neurosecretion. Likaså enhet aktivitet ur hypotalamus flera enheter inspelningar under LH släppa visar förändringar i aktiviteten av flera nervceller (7). Elektroderna med inspelade aktivitet under LH pulser är förknippade med antingen GnRH somata eller fibrer (8). Därför åtminstone en del av denna verksamhet härrör från GnRH nervceller.

De mekanismer som resulterar i synkroniserade bränning i hypothalamus GnRH nervceller är okänd. Belysa de mekanismer som samordnar eldning i GnRH nervceller är ett komplext problem. För det första GnRH nervceller är relativt få till antalet. Hos gnagare är det 800-2500 GnRH nervceller. Det är inte klart att alla GnRH nervceller är inblandade i episodisk GnRH-release. Dessutom är GnRH nervceller diffust ut (1). Detta har komplicerat vår förståelse av samordning av bränning och har gjort många tekniska metoder svårlösta. Vi har optimerat lös cell-anslutna inspelningar i nuvarande-clamp läge för direkt detektion av aktionspotentialer och utvecklat en inspelning metod som möjliggör samtidig inspelningar från par GnRH nervceller.

Protocol

1. Hypotalamisk hjärnan skivor är beredda, inkuberas och överförs till inspelningen kammaren som tidigare detaljerade (9) i djur vars GnRH nervceller uttrycka grönt fluorescerande protein (GFP) under kontroll av den GnRH-peptid promotor (10). Efter avlägsnande av hjärnan från djuret, är hjärnan blockeras med hjälp av ett rakblad för att eliminera regioner som inte är av intresse. För att fastställa regionerna att ta bort, är hjärnan placerad på sitt rygg-yta så att hypotalamus kan visualiseras. För både koronalt och sagittal skiva riktlinjer, är lillhjärnan bort. För koronalt skiva förberedelser är rostralt delen av hjärnbarken bort. I den här slice inriktning i sidled regioner i hjärnbarken ge stöd för att skiva hjärnan och ge tillräcklig område av hjärnan för placering av silver trådar att säkra hjärnan i inspelningen kammaren. För sagittala skiva beredning, den laterala regioner av hjärnan bort och rostralt delar av hjärnbarken ger stöd för hjärnan skivning och för placering av silver trådar att säkra hjärnan i inspelningen väl. Under hela blockering förfarande, är hjärnan ständigt fuktad med kallt artificiellt cerebrospinalvätska (ACSF) med ett glas pipett.
2. En liten mängd Superlim placeras på skär-plattformen. Hjärnan lyfts med en spatel. Överskott ACSF avlägsnas genom föra en Kimwipe till ytan av spateln och dra överskott ACSF bort från hjärnan. Hjärnan är försiktigt gled framåt på limmet. Det är viktigt att inte röra i hjärnan eller trycka ner det för att säkra det. Vikten av hjärnan själv är oftast tillräckligt för att säkerställa att den är säker.
3. Hjärnan och styckning plattformen är då säkrad till den vibrerande mikrotomen och styckning är väl fylld med kallt ACSF. Den kalla lösningen både företag hjärnan och kan skydda från skador vid kapning förfarandet. Olika delar av hjärnan varierar i graden av kyla som optimerar kvalitet skivor. Temperaturen på ACSF för beredning av hypotalamus skivor är generellt 0 ° C.
4. Skivor borde sänkas långsamt och varje skiva ska flyta fritt från hjärnan. Om skivor börjar krypa under bearbetning, bör den hastighet med vilken bladet framskrider långsammare. Man kan använda en liten pensel för att uncurl skivor men detta riskerar att skada skivorna och därmed bör undvikas. Långsamt hastigheten på förhand av bladet är att föredra framför att använda en pensel.
5. Eftersom varje skiva är skuren från hjärnan, är det tillbaka från klippkammare och placeras i en skiva inkubation kammare i ett varmt vattenbad (ca 32 ° C). Segmentet inkubatorn tillförs kontinuerligt med syre med hjälp av en blandning av 95% O ₂ och 5% CO _2. Generellt före inspelning skiva inkubation varierar från 30 minuter till 2 timmar.
6. Glaspipetter (3-6 Mohm) tillverkas som tidigare beskrivits (9) med hjälp av en vertikal avdragare. Temperaturen och varaktighet dra varierar beroende på vilken typ av pipett avdragare man använder, typ av glas man använder och livslängd uppvärmning glödtråden av avdragare. Formen på pipettspetsen kan också variera beroende på användarens önskemål. Vi har uppnått goda resultat med en likformigt avsmalnande spets med en öppning på 0,1 mm. Större öppningar i pipetten har en tendens att skada nervceller medan mindre öppningar inte leder till långvarig inspelningar.
7. Pipetter belagda med Sylgard att minska kapacitans. Drog pipettspetsar är lätt belagda med Sylgard 184 med en andra pipett. Sylgarded tips är då värme botas med hjälp av en värmepistol. Dessa pipetter sedan fylls med badet perfusatet. För att öka visualisering av pipettspetsar, är en liten mängd Alexa-568 läggs till den del av badet lösning som skall användas som pipetten lösning innan fyller pipetter. Vi väger inte Alexa-568, utan snarare använda tillräckligt för att vända den lösning rosa med ögat. Den pipettspetsar kan sedan visualiseras enligt Texas rött filter.
8. Vi har utvecklat en metod för att få ström-klämma inspelningar för detektion av aktionspotentialer med låg resistans sälar (se diskussion). Inspelningar sker vid cellens endogena vilopotential utan tillämpade aktuella med Axon Instruments 2B Axoclamp. Men på grund av det låga motståndet sigill, kunde man inte upptäcka aktionspotentialer med bara 2B förstärkaren. För att öka signalen, en andra förstärkare (AM System 3000) som används i serie med Axoclamp 2B. Detta tillvägagångssätt har den enkla lösa tätningar och nyttan av långsiktig inspelningar. Tekniskt sett kan man mäta direkt aktionspotentialer och därmed kringgå problemen med strategin i spänningen-clamp inspelningsläge (se diskussion).
9. Man tar två pipetter till ytan av de två tidigare valda nervceller på samma gång, på ett liknande sätt som den metod för hela cellen inspelningen konfiguration. Närmar både neurons samtidigt har varit mer framgångsrika i att få den dubbla inspelningar än att försöka varje neuron i paret självständigt. Under denna tid är aktuella injektion pulser överförs från 2B förstärkare som sker under inflygningen för helcells-inspelningar.
10. Positivt tryck måste upprätthållas på båda pipetter för att förhindra igensättning spetsen. Positivt tryck för dubbla inspelningar är bäst skapas genom att använda en ofylld 3 ml tomma sprutan fäst vid pipetten innehavaren av en lång slang. Använda sprutor gör att man kan upprätthålla trycket på båda pipetter. Positivt tryck bör tillämpas så snart pipetten har placerats i badet lösningen av inspelningen kammaren. Man närmar sig den utvalda nervceller med pipetter sekventiellt. När du har placerat den första pipetten direkt över den största ytan av neuron, upprätthåller en positiv genom att lämna sprutan på plats och lämnar pipetten i detta läge. Man återvänder sedan till toppen av inspelningen kammaren och sänker den andra inspelningen pipetten på plats. Valda nervceller är ofta på olika nivåer i segmentet. Den första pipett bör placeras över neuron som är djupast i segmentet och placera den andra pipett med en mer ytlig neuron. Detta förhindrar att placeringen av den andra pipetten från att ändra placeringen av den andra pipetten som slice kommer att flyttas något i det vertikala plan som pipetter in i segmentet.
11. Lösa packningar (18-30 Mohm) kommer att användas. Det positiva trycket kommer att framkalla en liten grop på ytan av varje cell. Ett försök att täta den första neuron genom att släppa positivt tryck och tillämpa mycket lätt undertryck. Det positiva trycket frigörs genom att ta bort sprutan. Sug genom munnen tillämpas sedan den fria änden av slangen. En frisk neuron membran kommer snabbt reagera på frisläppandet av övertryck och följa pipett. Svagt sug kommer att utgöra en tätning med lämpligt motstånd i en frisk neuron.


12. När ett försök att täta en neuron och misslyckas kan pipetten inte återanvändas eftersom membran bara tätningen till mycket rent glas. Istället höjer ett pipetten (och mikroskop mål) från ytan av slice till toppen av perfusionen väl, tar bort pipett ur badet, ändras till en ren pipett och sedan återvänder till slice att försöka täta en annan cell . Av dessa skäl är det viktigt att välja flera potentiella nervceller för inspelningar. För skivor med mindre än 4-6 nervceller inspelningskvalitet att välja mellan, är det framgång i att skaffa dubbla inspelningar begränsad.
13. Efter att ha utarbetat en lös tätning baserad på motstånd, är de aktuella insprutningspulser från 2B förstärkaren avslutas. Den 2B förstärkare placeras i serie med 3000-serien förstärkare. I denna konfiguration fungerar utdata från 2B förstärkare som ingång för 3000-serien förstärkare. Den senare förstärkare ger signal för datainsamling.
14. Tätningen (steg 4) och konfigurera om amplifers (steg 5) upprepas sedan för andra neuron.

Figur 1. En period av ökad bränning i två GnRH nervceller med hjälp av den lösa tätningen bifogade inspelning konfigurationen i ett sagittalt skiva beredning. Segmentet var hämtad från en kastrerad hane. Varje uppåt nedböjning indikerar en aktionspotential. Observera att en GnRH-neuron (överst spår) uppvisar nästan kontinuerlig eldning medan den andra GnRH-neuron utställningar intermittent spricker. Detta mönster av aktivitet från enstaka GnRH nervceller är liknande till det av enskilda enheter ur flera enheter inspelningar under insöndring in vivo (7). Vänligen klicka här för att se en större version av figur 1.

Discussion

Aktiviteten av intresse i vissa nervceller inklusive GnRH nervceller (baserat på hormon) sker på tidsskalor timmar (5-7). Därför är hela cellen konfiguration inte det bästa valet för några experimentella mål på grund av dialys av intracellulära budbärare i hela cellen inspelningsläge. I andra hand är helcells-inspelningar i allmänhet begränsad till djur yngre än ca 120 dagars ålder. Med åldern neuronala membran tycks stelna, vilket gör hög motståndskraft tätningar svårt att uppnå. Dessutom erhåller om en hög motståndskraft sigill, spricker plåstret stör tätningen och lämnar ett hål mellan pipetten och membranet. Detta leder till en oanvändbar inspelningen och en neuron som snabbt kommer att dö på grund av joniska obalanser. Regelbunden äggstockarna cykler, och därmed en stabil verksamhet GnRH pulsgenerator inte sker förrän senare i livet (7-10 månaders ålder i C57Bl6 kvinnor, 11, 12), efter den ålder då man rimligen kan förutse att få helcells-inspelningar tillförlitligt sätt. Slutligen helcells-inspelningar förstöra den endogena förhållandet mellan interna och externa jon koncentrationer. Med hela cellen inspelningar, lika med interna koncentrationen av alla jon koncentrationen av jon i pipetten lösningen. Detta beror på att pipetten lösningen relativt stor volym snabbt når jämvikt med / ersätter den relativt lilla endogena volym cellen.

Den lösa cellen bifogade tillvägagångssätt kringgår många av de begränsningar helcells-inspelningar. Dels kan ett lågt motstånd tätning (15-30 Mohm) användas. Dessa är relativt lätt att forma även i nervceller från äldre djur. För det andra gör man inte spräcka förseglade fläck membran. Därför, lös cell bifogade inspelningar är tekniskt mycket lättare än helcells-inspelningar. Dessutom, eftersom cellmembranet är intakt, sker dialys av intracellulära komponenter inte och endogena joniska nyckeltal bevaras. Man kan inte använda den lösa cellen bifogade metod för att studera synaptisk strömmar men det är idealiskt för långa inspelningar från nervceller i en relativt icke-invasiv sätt. Cellen-anslutna inspelningar kan också utföras med hjälp av en vanlig intracellulära lösning i pipetten. Detta ger den extra fördelen av spricker membranet patchen när den långsiktiga inspelningen är klar och märkning neuron med en intracellulär markör.

Den lösa cellen bifogade tillvägagångssätt har använts i spännings-clamp inspelningsläge. Dock har spänning-klämma in i den lösa cellen bifogade konfiguration flera metodologiska problem. För det första är inspelade signalen ett indirekt mått på aktivitet. Den signal som mäts (som den så kallade åtgärder ström) är den kapacitiva ström som laddar membranet (13). Detta är en mycket viktig metodologisk fråga. Kapacitans och motstånd av en inspelning pipett kan filtrera den inspelade signalen. Det är mycket troligt att de små åtgärder strömmar försvinner i laddning av kapacitans av pipetten som, inte kan väl kompenseras med de flesta förstärkare, på grund av det höga motstånd headstage. När dessa signaler inte upptäcks, återspeglar den uppenbara bränning mönster av neuron inte den sanna bränning mönster. Likaså okompenserad pipett och motstånd tätning orsaka betydande fel i mätningar under förändringar såsom när åtgärder strömmar uttrycks (13). Vissa förstärkare ger kapacitans och motstånd "ersättning" för pipett och sigill, vilket begränsar signal förlust, men hög motståndskraft chef stadier av de flesta förstärkare hindra optimal ersättning. För det andra är en artificiell situation som ställs på cellen. I spännings-clamp läge är området runt cellmembranet höll en fast potential i dessa studier, 0 mV. Detta betyder inte att det inte finns någon ström som appliceras på cellmembranet. Signalen mäts i spänning-clamp är faktiskt hur mycket ström som appliceras på membranet för att upprätthålla den fasta potential. Därför kan detta tillämpas aktuell förändrar cellernas aktivitet.

Dubbla inspelningar i GnRH-systemet är särskilt utmanande på grund av det begränsade antalet GnRH nervceller och deras diffusa distribution. För dubbla inspelningar ska lyckas, måste roboten vara ytterst stabil. Även liten rörelse av elektroden kan orsaka pipetten för att halka av neuron och avsluta inspelningen. Dessutom kan rörelser av pipetten på cellen (t.ex. omplacering för att kompensera för rörelser) ändra bränning mönster. Vissa jonkanaler t.ex. N-typ kalciumkanaler är mekaniskt känsliga: membran sträcka orsakar återkommande aktivitet i både hel-cell och cell-anslutna inspelning konfigurationer (14). Slutligen måste Manipulator System kunna ytterst fina och mjuka rörelser. Som nämnts ovan, med dubbla inspelningar, tar en två pipetter till ytan av de två tidigare valda nervceller samtidigt och försöker att tätaen neuron. Om det lyckas, då ett försök att försegla den andra cellen. Generellt kan man inte förvänta sig att täta och har en högkvalitativ inspelning med varje försök. Detta är dock skapar ett särskilt problem med dubbla inspelningar. Om man lyckas med de första neuron men misslyckas med andra, måste man ändra pipett och prova en annan cell. Därför måste man kunna flytta både nedsänkning målet för mikroskop och pipetten till toppen av perfusion väl (för att ändra pipett) utan att störa framgångsrikt förseglade neuron.

Vår utveckling och användning av den lösa cell-ansluten tillvägagångssätt för dubbla inspelningar är ett stort tekniskt framsteg i att studera GnRH nervceller. Det är troligt att producera användbara resultat som kommer att hjälpa att flytta fältet framåt i samband med den kritiska frågan om vilka mekanismer som ligger bakom samordnad verksamhet som resulterar i pulserande hormon.