Summary
의 연결 시스템의 활동은 종종 특정 인구 내에서 뉴런에서 동기 조치 가능성 배출이 필요합니다. 예를 들어,의 펄스 호르몬 (GnRH)를 생식 샘 자극 호르몬은 - 발표하는 것은 가능성이 GnRH 뉴런 사이의 조정 활동을 필요로합니다. 우리는 안정 diffusely 배포 GnRH 뉴런에서 동시 electrophysiological 레코딩을 얻기위한 우리의 방법론 접근법을 제시한다.
Abstract
생식 샘 자극 호르몬 - 방출 호르몬 (GnRH)는 luteinizing 호르몬 (LH)과 소낭 자극 호르몬 - (FSH)의 뇌하수체 릴리스를 조절 작은 neuropeptide입니다. 이러한 gonadotropins은 생식 기능의 조절에 필수입니다. 그들이 hypophysiotropic 포털 시스템 (1)에 자신의 축삭 터미널에서 GnRH을 해제 어디 GnRH 함유 뉴런은 평균 예하에 시상 하부 및 프로젝트 전반에 걸쳐 diffusely 배포됩니다. 포털 모세 혈관에서 GnRH은 조직의 순환에 gonadotropins의 릴리스를 자극하기 위해 앞쪽에 뇌하수체에 여행. GnRH 릴리스는 지속적인 것은 아니지만 오히려 에피소드 펄스에서 발생합니다. 그것은 잘 GnRH 릴리스의 간헐적인 방식으로 재생산 (2, 3)을 위해 필수적임을 설정됩니다.
여러 아마도 GnRH 뉴런의 underlies의 GnRH 펄스의 활동을 조정. GnRH 뉴런의 총 펩타이드 내용은 약 1.0 PG / 30 % 가능성 releasable 수영장 구성되어있는 셀 (4).입니다 펄스 동안 GnRH (5, 6)의 수준은 여러 GnRH 뉴런은 아마도 neurosecretion에 참여하시기 바랍니다. 마찬가지로 하나의 단위 활동 여러 뉴런 (7)의 활동의 변화를 나타냅니다 LH 릴리스 중 hypothalamic 멀티 유닛 녹음에서 추출한. LH 펄스 동안에 기록된 활동 전극은 GnRH somata 또는 섬유 (8) 중 하나와 연결됩니다. 따라서, 적어도이 활동 중 일부는 GnRH 뉴런에서 발생한다.
메커니즘은 hypothalamic GnRH의 뉴런의 동기화 해고의 결과는 알 수있다. GnRH 뉴런의 해고 조정 메커니즘을 Elucidating하는 것은 복잡한 문제입니다. 첫째, GnRH 뉴런은 수가 상대적으로 적은 수 있습니다. 설치류에서 800-2500 GnRH 뉴런가 없습니다. 다 GnRH 뉴런이 에피소드 GnRH 릴리스에 관련된 것이 분명하지 않습니다. 또한, GnRH의 뉴런은 diffusely (1) 배포됩니다. 이것은 사격의 조정에 대한 우리의 이해를 복잡하고 많은 기술 접근이 어려운되었다. 우리는 행동 잠재력의 직접 검출을위한 전류 클램프 모드에서 느슨한 세포 연결된 녹음을 최적화하고 GnRH 뉴런의 쌍의 동시 녹음을 허용 녹음 방식을 개발했습니다.
Protocol
- Hypothalamic 뇌 슬라이스는 준비 incubated 및 그의 GnRH 뉴런 GnRH 펩티드 발기인 (10)의 통제하에 녹색 형광 단백질 (GFP)을 표현하는 동물 이전에 세부로 기록 챔버 (9)으로 전송됩니다. 동물의 두뇌의 제거 후, 두뇌는 관심이없는 영역을 제거하기 위해 면도날을 사용하여 차단됩니다. 시상 하부는 시각 수 있도록 제거하는 영역을 결정하기 위해서는 두뇌가 그 등의 표면에 위치합니다. 코로나와 화살 슬라이스 방향 모두에 대해, 소뇌가 제거됩니다. 코로나 슬라이스 준비, 피질의 주동이의 부분이 제거됩니다. 이 슬라이스 방향에서 피질의 측면 지역은 머리를 깔끔히에 대한 지원을 제공하고 녹음 챔버의 뇌를 보호하는 실버 와이어의 위치에 대한 두뇌의 충분한 공간을 제공합니다. 화살 슬라이스 준비, 두뇌의 측면 영역이 제거되고 피질의 주동이의 부분이 깔끔히 뇌를 잘 녹음의 뇌를 보호하는 실버 와이어의 배치에 대한 지원을 제공하고 있습니다. 차단 절차를 통해, 두뇌가 지속적으로 유리 피펫을 사용하여 차가운 인공 뇌척수 (ACSF)와 moistened 있습니다.
- Superglue의 작은 금액은 절삭 플랫폼에 배치됩니다. 두뇌는 주걱과 함께 해제됩니다. 초과 ACSF는 주걱의 표면에 Kimwipe 가지고와 뇌의 가까이 초과 ACSF를 그림으로써 제거됩니다. 머리가 부드럽게 접착제에 앞으로 하락이다. 그것을 확보하기 위해 머리를 만지거나 그것에 아래로 밀어하지 않는 것이 중요합니다. 뇌 자체의 무게는 대개 안전 보장하기 위해 충분합니다.
- 두뇌와 절삭 플랫폼은 다음 진동 마이크로톰을 확보하고 절단 잘 감기 ACSF으로 가득합니다. 추위 솔루션은 두 회사 두뇌와 절단 절차를 수행하는 동안 손상으로부터 보호할 수 있습니다. 다른 뇌 영역은 품질 조각을 최적화 추위의 정도에 따라 다릅니다. hypothalamic 조각의 준비를위한 ACSF의 온도는 일반적으로 0 ° C.입니다
- 조각은 천천히 절단되어야하며 각각의 슬라이스는 두뇌에서 멀리 자유롭게 부유한다. 슬라이스가 절단하는 동안 침묵 시작하면 날개가 발전하는 속도가 느려해야합니다. 하나는 작은 페인트 조각을 펴다 브러시 그러나 이것은 위험 조각 손상 않으며 따라서 피해야한다을 사용할 수 있습니다. 천천히 블레이드 사전의 속도는 페인트 브러쉬를 사용하여보다 선호됩니다.
- 각 슬라이스는 두뇌에서 해고되면서, 그것은 절단 챔버에서 철회하고 온수 욕조 (약 32 ° C)에서 슬라이스 배양 챔버에 배치됩니다. 슬라이스 인큐베이터는 지속적으로 95% O 2 5% CO 2의 혼합물을 사용하여 산소와 함께 제공됩니다. 30 분 거리에 2 시간 일반적으로, 사전 녹화 슬라이스 배양 범위.
- 앞에서 설명한 것처럼 유리 pipettes (MΩ 3-6)은 세로 풀러를 사용하여 (9) 가공하고 있습니다. 당기의 온도와 기간은 피펫 끌어당기는 한 사용, 유리 하나 사용하고 풀러의 가열 필라멘트의 수명의 종류의 유형에 따라 다릅니다. 피펫 팁의 모양도 사용자의 취향에 따라 달라질 수 있습니다. 우리는 0.1 mm의 개방과 균일하게 테이퍼 팁 잘 성공을 달성했습니다. 피펫에 큰 구멍이 작아 채용 오랜 기간 녹음의 결과에 실패하면서 신경을 손상하는 경향이 있습니다.
- Pipettes은 용량을 줄이기 위해 Sylgard와 코팅. 아이고, 피펫 팁은 가볍게 Sylgard 184 두 번째 피펫을 이용하여 코팅하고 있습니다. Sylgarded 팁 열 총을 사용하여 열 치료 후 수 있습니다. 이러한 pipettes은 다음 목욕탕 perfusate 가득합니다. 피펫 팁의 시각화를 향상시키기 위해 알렉사 - 568의 작은 금액은 pipettes를 작성하기 전에 피펫 솔루션으로 사용할 목욕 솔루션의 부분에 추가됩니다. 우리는 알렉사 - 568의 무게가 아니라 눈으로 솔루션 분홍색을 설정하는 정도로 사용하지 마십시오. 피펫 팁 다음 텍사스 빨간색 필터 시각하실 수 있습니다.
- 우리는 낮은 저항 바다표범을 (토론 참조)를 사용하여 액션 잠재력의 감지 전류 클램프 녹음을 얻는 방법을 개발했습니다. 녹음없이 적용 현재 사용 액슨 악기의 2B Axoclamp와 세포의 내생적인 휴식 가능성에서 수행됩니다. 그러나, 때문에 낮은 저항 도장을 한 단지 2B 앰프와 행동 잠재력을 감지하지 못했습니다. 신호를 높이려면 두 번째 앰프 (AM 시스템 3000) Axoclamp의 2B와 시리즈에서 사용됩니다. 이 방법은 장기 레코딩 느슨한 바다표범과 유틸리티의 용이성이 있습니다. 기술적으로, 하나는 직접함으로써 (토론 참조) 전압 - 클램프 녹음 모드에서 접근의 문제점을 우회, 액션 잠재력을 측정할 수 있습니다.
- 하나는 전체 세포 기록 구성에 대한 접근 방식과 비슷한 방식으로, 동시에 두 사람 이전에 선택한 뉴런의 표면에 두 pipettes 걸립니다. NE 모두 접근동시에 urons 독자 쌍 각 뉴런을 시도보다 듀얼 레코딩을 얻기에 더 많은 성공을 거두었습니다. 전체 셀 레코딩을위한 접근하는 동안 수행으로이 기간 동안, 현재 분사 펄스는 2B 앰프에서 전달됩니다.
- 긍정적인 압력이 팁을 막히는 것을 방지하기 위해 두 pipettes에서 유지 관리해야합니다. 듀얼 레코딩에 대한 긍정적인 압력이 최고의 튜브의 조각의 길이로 피펫 홀더에 부착된 unfilled 3 ML 빈 주사기를 사용하여 생성됩니다. 주사기를 사용하면 한 두 pipettes 압력을 유지할 수 있습니다. 긍정적인 압력이 즉시 피펫이 녹화 챔버의 목욕 솔루션에 배치되었습니다으로 적용되어야합니다. 하나는 순차적으로 pipettes로 선택한 뉴런 접근. 신경 세포의 가장 큰 표면에 직접 첫 번째 피펫을 위치하면, 한 장소에서 주사기를 떠나하여 긍정적인 유지하고이 위치에 피펫을 떠납니다. 하나는 다음 녹화 챔버의 상단에 반환하고 위치로 두 번째 녹화 피펫을 절감. 선택된 뉴런은 조각의 다른 수준에서 종종 있습니다. 첫 번째 피펫은 더 많은 외면적인 신경 세포에서 슬라이스와 위치를 두 번째 피펫에 깊은하는 신경 세포를 통해 위치해야합니다. 이것은 pipettes은 슬라이스를 입력으로 슬라이스가 수직 비행기에서 약간 이동합니다 두번째 피펫의 위치를 이동에서 두 번째 피펫의 위치를 방지할 수 있습니다.
- 루쓰 물개 (MΩ 18-30)이 사용됩니다. 긍정적인 압력은 각 세포의 표면에 작은 보조개를 유도합니다. 하나는 긍정적인 압력을 해제하고 아주 약간의 부정적인 압력을 적용하여 최초의 신경 세포를 밀봉을 시도합니다. 긍정적인 압력은 주사기를 제거하여 발표합니다. 입으로 흡입은 다음 튜브의 끝에 자유에 적용됩니다. 건강한 신경 세포의 막이 신속하게 긍정적인 압력의 출시에 대응하고 피펫을 준수합니다. 약간 흡입은 건강한 신경 세포에 적절한 저항과 인감을 형성합니다.
- 점막은 매우 유리를 청소하기 위해 인감 이후 하나는 신경 세포와 실패를 봉인하려고 시도하면, 피펫은 다시 사용할 수 없습니다. 대신, 하나, 잘 재관류의 상단에 떨어진 조각의 표면에서 피펫 (그리고 현미경 목표)을 제기 목욕에서 피펫을 제거, 깨끗한 피펫을 변경하고 다른 전지를 밀봉을 시도할 수있는 조각으로 돌아갑니다 . 이러한 이유로, 레코딩에 대해 여러 가능성이 뉴런을 선택하는 것이 중요합니다. 선택할 수있는보다 4-6 녹화 품질 뉴런과 슬라이스 들어, 듀얼 레코딩을 얻기에있는 성공은 제한됩니다.
- 저항에 따라 느슨한 도장을 설립 후, 2B 앰프에서 현재 분사 펄스가 종료됩니다. 2B의 amplifer는 3000 시리즈 amplifer와 시리즈에 배치됩니다. 이 구성에서, 2B의 amplifer의 출력은 3000 시리즈 amplifer에 대한 입력으로 제공하고 있습니다. 후자 amplifer는 데이터 수집을위한 신호를 제공합니다.
- 인감 (4 단계)와 amplifers의 재구성 (5 단계)은 다음 두 번째 신경 세포에 대해 반복됩니다.
그림 1.의 기간은 화살 슬라이스 준비에 느슨한 인감 첨부 녹음 구성을 사용하여 두 GnRH 뉴런에서 발사 증가했습니다. 슬라이스는 거세 남성에서 파생되었다. 각각 상향 편향은 행동 잠재력을 나타냅니다. 두 번째 GnRH 신경 세포는 간헐적인 파열을 전시하면서 한 GnRH 신경 세포 (상단 흔적)이 거의 지속적인 시행을 전시합니다. 단일 GnRH 뉴런의 활동이 패턴은 생체내 (7)의 호르몬 분비 중에 멀티 유닛 녹음에서 추출된 단일 단위의 비슷합니다. 하시기 바랍니다 여기를 클릭 그림 1의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.
Discussion
GnRH 뉴런 (호르몬 분비에 따라)를 포함한 일부 뉴런에 대한 관심의 활동은 시간의 시간 단위 (5-7)에 발생합니다. 따라서, 전체 셀 구성은 전체 세포 녹음 모드에서 세포내 메신저의 투석으로 인해 일부 실험 목표를위한 최선의 선택이 아닐 것입니다. Secondarily, 전체 셀 녹음은 일반적으로 나이 약 120 일 이상 적은 동물로 제한됩니다. 나이, 세포막의 연결은 높은 저항 바다표범 달성하기 어려운 만들기, 등귀하다로 나타납니다. 또한, 경우 하나는 패치가 피펫과 막 사이에 구멍을 떠나, 인감 방해 rupturing, 높은 저항 인감을 얻습니다. 이것은 사용할 수 없게 녹화 빠르게 이온 불균형으로 인해 죽게 될 신경 세포로 안내합니다. 한 합리적인 전체 셀 녹음을 얻기 예상할 수있을 때 세 이상; 일반 난소주기, 그리고 따라서 GnRH 펄스 생성기의 안정적인 활동 (11, 12 C57Bl6 여성의 나이 70~10개월) 나중에까지 발생하지 않습니다 안정. 마지막으로, 전체 셀 녹음은 내부 및 외부 이온 농도의 내생적인 비율을 파괴. 전체 세포 기록과 함께, 어떤 이온의 내부 농도는 피펫 솔루션에있는 이온의 농도 같습니다. /이 세포의 비교적 적은 내생 볼륨을 대체와 피펫 솔루션의 비교적 큰 볼륨이 빠르게 평형에 도달하기 때문입니다.
느슨한 세포 부착 방법은 전체 세포 녹음의 한계 많은 circumvents. 첫째, 낮은 저항 인감 (MΩ 15-30)을 사용할 수 있습니다. 이들은 심지어 나이가 동물에서 뉴런의 형태로 상대적으로 쉽습니다. 둘째, 하나는 막 파열의 밀봉 패치를하지 않습니다. 따라서 느슨한 세포 부착 녹음은 전체 세포 녹음보다 기술적으로 훨씬 용이합니다. 또한 세포막은 그대로이기 때문에, 세포 내 구성 요소의 투석가 발생하지 않으며 내생 이온 비율은 보존되어 있습니다. 하나는 시냅스 전류를 공부에 대한 느슨한 세포 부착 방법을 사용할 수 있지만 그것은 상대적으로 비침습적인 방법으로 뉴런에서 장기 녹음에 이상적입니다. 셀 - 첨부된 녹음도 피펫으로 표준 세포 솔루션을 사용하여 수행할 수 있습니다. 이것은 장기적인 녹음이 완료되면 막 패치를 rupturing하고 세포 마커와 신경 세포를 라벨의 추가 혜택을 제공합니다.
느슨한 세포 부착 방식은 전압 클램프 녹음 모드에서 사용되고 있습니다. 그러나, 느슨하게 연결된 세포 구성에 전압 클램프 녹음이 몇 가지 방법론 문제가있다. 첫째, 녹음 신호가 활동의 간접적인 측정하기위한 한 방법입니다. (소위 동작 전류)를 측정 신호는 멤브레인 (13) 청구 용량성 전류입니다. 이것은 매우 중요한 방법 론적 문제입니다. 기록 피펫의 용량과 저항이 기록된 신호를 필터링할 수 있습니다. 그것은 작은 동작 전류가 제대로 headstage의 높은 저항으로 인해 대부분의 앰프와 보상 수 없습니다 피펫의 커패시턴스를 충전에 손실 가능성이 높습니다. 이러한 신호가 나오지 않을 때, 신경 세포의 명백한 해고 패턴은 진정한 발사 패턴을 반영하지 않습니다. 마찬가지로, uncompensated 피펫 및 인감 resistances는 동작 전류를 표현하는 경우로 변경 (13) 동안 측정에 큰 오류의 원인이됩니다. 어떤 앰프는 커패시턴스와 신호 손실을 제한 피펫 날인에 대한 저항 "보상"을 제공하고 있지만, 대부분의 앰프의 높은 저항 헤드 단계가 최적의 보상을 방해. 둘째, 인공 상황은 세포에 부과됩니다. 전압 클램프 모드에서 세포막 주변 이러한 연구, 0 뮤직 비디오에 고정 가능성에 개최됩니다. 이것은 세포막에 적용도 현재이 없다는 뜻은 아닙니다. 전압 클램프로 측정 신호는 실제로 고정 가능성을 유지하기 위해 막에 적용되는 현재의 금액입니다. 따라서이 적용된 현재는 세포 활동을 변경할 수 있습니다.
GnRH 시스템에 듀얼 레코딩 특히 GnRH 뉴런과 확산 유통의 수는 제한되어 있기 때문에 도전하고 있습니다. 듀얼 레코딩이 성공하기 위해서는, 조작하는 사람은 매우 안정되어야합니다. 전극의도 약간의 움직임 신경 세포를 실수로 녹음을 종료하기 위해 피펫가 발생할 수 있습니다. 또한, 세포에 피펫의 움직임 (예를 들어, 움직임 보상에 다시 위치)는 발사 패턴을 변경할 수 있습니다. 일부 이온 채널과 같은 N - 타입 칼슘 채널은 기계식 구분 : 멤브레인 스트레치는 전체 세포와 세포에 연결된 모두 녹음 구성 (14) 반복적인 활동을 발생합니다. 마지막으로, 조작하는 사람의 시스템은 매우 좋은 부드러운 모션 수 있어야합니다. 듀얼 레코딩과 함께, 위에서 바와 같이, 하나는 같은 시간과 인감 시도에서 두 이전에 선택한 뉴런의 표면에 두 pipettes 걸립니다한 신경 세포. 성공한다면, 시도가 두 번째 세포를 밀봉합니다. 일반적으로, 하나는 모든 시도와 고품질 레코딩을 밀봉하고이 기대 수 없습니다. 이것은, 그러나, 듀얼 레코딩과 함께 특정 문제를 만듭니다. 하나는 최초의 신경 세포로 성공하지만 두 번째로 실패하면, 하나는 피펫을 변경하고 다른 세포를 시도해야합니다. 따라서, 하나는 성공적으로 밀봉 신경을 방해하지 않고 잘 재관류의 상단 (피펫을 변경할 수)에 현미경의 침지 목적과 피펫을 모두 이동시킬 수 있어야합니다.
듀얼 레코딩에 대한 느슨한 세포 부착 방식 우리의 개발 및 사용 GnRH 뉴런을 연구의 주요 기술 발전이다. 이 메커니즘은 조정 활동을 기초 어떤 중요한 질문의 맥락에서 앞으로 필드를 이동 타악기 호르몬의 분비로 이어지는. 도움이 될 것입니다 유용한 결과를 얻을 가능성이
Acknowledgments
나는 로날드 L. 카라 브 레즈, 디터 예거 (에모리 대학)과 유용한 기술 토론 구청 Yuhas (액슨 인 스트 루먼트)에 감사드립니다.
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