Summary
Neuronal सिस्टम में गतिविधि अक्सर एक विशिष्ट जनसंख्या के भीतर न्यूरॉन्स से तुल्यकालिक कार्रवाई संभावित निर्वहन की आवश्यकता है. उदाहरण के लिए, दालों के हार्मोन (GnRH) gonadotropin रिहा संभावना GnRH न्यूरॉन्स के बीच समन्वित गतिविधि की आवश्यकता है. हम मज़बूती से diffusely वितरित GnRH न्यूरॉन्स से युगपत electrophysiological रिकॉर्डिंग प्राप्त करने के लिए हमारी methodological दृष्टिकोण प्रस्तुत करते हैं.
Abstract
Gonadotropin - विमोचन हार्मोन (GnRH) एक छोटे से neuropeptide कि luteinizing हार्मोन (LH) और कूप उत्तेजक हार्मोन (FSH) के पिट्यूटरी रिलीज को नियंत्रित करता है. ये गोनैडोट्रॉपिंस प्रजनन समारोह के विनियमन के लिए आवश्यक हैं. GnRH युक्त न्यूरॉन्स diffusely hypothalamus और मंझला श्रेष्ठता के लिए परियोजना भर में वितरित कर रहे हैं जहां वे अपने अक्षतंतु टर्मिनलों से hypophysiotropic पोर्टल प्रणाली (1) में GnRH रिहाई. पोर्टल capillaries में GnRH पूर्वकाल पिट्यूटरी ग्रंथि के लिए यात्रा करने के लिए प्रणालीगत संचलन में गोनैडोट्रॉपिंस की रिहाई को प्रोत्साहित. GnRH रिलीज निरंतर है, लेकिन नहीं है, बल्कि प्रासंगिक दालों में होता है. यह अच्छी तरह से स्थापित है कि GnRH रिलीज के आंतरायिक तरीके प्रजनन (2, 3) के लिए आवश्यक है.
एकाधिक GnRH शायद न्यूरॉन्स underlies GnRH दालों की गतिविधि का समन्वय. GnRH न्यूरॉन्स में कुल पेप्टाइड सामग्री 1.0 लगभग स्नातकोत्तर / (4) सेल, जिसमें से 30% की संभावना Releasable पूल शामिल हैं. एक पल्स के दौरान GnRH (5, 6) के स्तर का सुझाव है, कई GnRH न्यूरॉन्स शायद neurosecretion में शामिल हैं. इसी तरह, एकल इकाई गतिविधि LH रिलीज के दौरान hypothalamic बहु इकाई रिकॉर्डिंग से निकाले इंगित करता है कई न्यूरॉन्स (7) की गतिविधि में परिवर्तन. LH दालों के दौरान दर्ज की गतिविधि के साथ इलेक्ट्रोड या तो GnRH somata या फाइबर (8) के साथ जुड़े रहे हैं. इसलिए, इस गतिविधि के कम से कम कुछ GnRH न्यूरॉन्स से उठता है.
तंत्र है कि hypothalamic GnRH न्यूरॉन्स में सिंक्रनाइज़ फायरिंग में परिणाम अज्ञात है. Elucidating कि GnRH न्यूरॉन्स में फायरिंग समन्वय तंत्र एक जटिल समस्या है. सबसे पहले, GnRH न्यूरॉन्स अपेक्षाकृत संख्या में कुछ कर रहे हैं. कृन्तकों में, वहाँ 800-2500 GnRH न्यूरॉन्स हैं. यह स्पष्ट नहीं है कि सभी GnRH न्यूरॉन्स प्रासंगिक GnRH रिलीज में शामिल हैं. इसके अलावा, GnRH न्यूरॉन्स diffusely (1) वितरित कर रहे हैं. इस फायरिंग के समन्वय की हमारी समझ जटिल है और कई तकनीकी दृष्टिकोण असभ्य बनाया. हम कार्रवाई क्षमता के प्रत्यक्ष पता लगाने के लिए वर्तमान दबाना मोड में ढीला सेल संलग्न रिकॉर्डिंग अनुकूलित है और एक रिकॉर्डिंग दृष्टिकोण है कि GnRH न्यूरॉन्स के जोड़े से युगपत रिकॉर्डिंग के लिए अनुमति देता है विकसित.
Protocol
- Hypothalamic मस्तिष्क स्लाइसें तैयार incubated हैं और रिकॉर्डिंग कक्ष (9) के रूप में पहले विस्तृत पशुओं में जिसका GnRH न्यूरॉन्स GnRH पेप्टाइड प्रमोटर (10) के नियंत्रण के तहत हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) व्यक्त करने के लिए स्थानांतरित. जानवर से मस्तिष्क को हटाने के बाद, मस्तिष्क क्षेत्रों है कि ब्याज की नहीं कर रहे हैं को खत्म करने के लिए एक धार का उपयोग करने के लिए अवरुद्ध है. हटायें क्षेत्रों का निर्धारण करने के लिए आदेश में, मस्तिष्क अपनी पृष्ठीय सतह पर रखा गया है इतना है कि hypothalamus visualized किया जा सकता है. दोनों राज्याभिषेक और बाण के समान टुकड़ा झुकाव के लिए, सेरिबैलम निकाल दिया जाता है. राज्याभिषेक टुकड़ा तैयार करने के लिए, प्रांतस्था का व्याख्यान चबूतरे वाला भाग निकाल दिया जाता है. इस टुकड़ा अभिविन्यास में, प्रांतस्था के पार्श्व क्षेत्रों मस्तिष्क टुकड़ा करने की क्रिया के लिए समर्थन प्रदान करते हैं और चांदी के तारों के स्थान रिकॉर्डिंग कक्ष में मस्तिष्क सुरक्षित के लिए मस्तिष्क के लिए पर्याप्त क्षेत्र प्रदान करते हैं. बाण के समान टुकड़ा तैयार करने के लिए, मस्तिष्क के पार्श्व क्षेत्रों को हटा रहे हैं प्रांतस्था का व्याख्यान चबूतरे वाला भाग टुकड़ा करने की क्रिया मस्तिष्क के लिए और चांदी के तारों के स्थान रिकॉर्डिंग मस्तिष्क में अच्छी तरह से सुरक्षित के लिए समर्थन प्रदान करते हैं. अवरुद्ध प्रक्रिया के दौरान, मस्तिष्क लगातार ठंड कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (ACSF) एक गिलास पिपेट का उपयोग कर के साथ सिक्त है.
- Superglue की एक छोटी राशि काटने के मंच पर रखा गया है. मस्तिष्क एक रंग के साथ उठाया है. अतिरिक्त ACSF रंग की सतह के लिए एक Kimwipe लाने के लिए और अतिरिक्त ACSF मस्तिष्क से दूर ड्राइंग द्वारा हटा दिया जाता है. मस्तिष्क धीरे गोंद पर आगे गिरावट. यह महत्वपूर्ण है को छूने के लिए नहीं मस्तिष्क या उस पर नीचे धक्का क्रम में यह सुरक्षित है. ही मस्तिष्क के वजन आमतौर पर यह सुरक्षित है सुनिश्चित करने के लिए पर्याप्त है.
- मस्तिष्क और काटने मंच तो हिल सूक्ष्म तक्षणी के लिए सुरक्षित है और काटने अच्छी तरह से ठंड ACSF से भरा है. ठंड समाधान दोनों मस्तिष्क फर्मों और काटने की प्रक्रिया के दौरान नुकसान से बचाने के सकता है. अलग मस्तिष्क क्षेत्रों शीतलता की डिग्री है कि गुणवत्ता स्लाइस का अनुकूलन में बदलती हैं. hypothalamic स्लाइस की तैयारी के लिए ACSF का तापमान आम तौर पर 0 डिग्री सेल्सियस
- स्लाइसें धीरे कटौती की जानी चाहिए और प्रत्येक टुकड़ा स्वतंत्र रूप से मस्तिष्क से दूर नाव चाहिए. यदि स्लाइसें काटने के दौरान कर्ल शुरू, गति, जिस पर ब्लेड से आगे बढ़ रहा है धीमा होना चाहिए. एक छोटा सा रंग लहराना स्लाइस करने के लिए ब्रश, लेकिन इस जोखिम स्लाइस हानिकारक करता है और इस तरह बचा जाना चाहिए, का उपयोग कर सकते हैं. धीरे धीरे ब्लेड के अग्रिम की गति एक पेंट ब्रश का उपयोग कर अधिक पसंद है.
- प्रत्येक टुकड़ा के रूप में मस्तिष्क से कट जाता है, यह काटने के कक्ष से वापस ले लिया है और एक गर्म पानी से स्नान (लगभग 32 डिग्री सेल्सियस) में एक टुकड़ा ऊष्मायन कक्ष में रखा. टुकड़ा इनक्यूबेटर लगातार 95% 2 हे और 5% सीओ 2 के एक मिश्रण का उपयोग कर ऑक्सीजन के साथ आपूर्ति की है. आम तौर पर, पूर्व रिकॉर्डिंग टुकड़ा के 30 मिनट से 2 घंटे के लिए ऊष्मायन पर्वतमाला.
- ग्लास pipettes (3-6 MΩ) के रूप में पहले वर्णित गढ़े हैं (9) एक ऊर्ध्वाधर खींचने का उपयोग. तापमान और खींच की अवधि विंदुक खेनेवाला एक का उपयोग करता है, कांच का उपयोग करता है और खींचने के हीटिंग फिलामेंट के जीवनकाल के प्रकार के प्रकार के आधार पर भिन्न होता है. विंदुक टिप के आकार भी उपयोगकर्ता वरीयता के आधार पर भिन्न हो सकते हैं. हम 0.1 मिमी की एक खोलने के साथ एक समान पतला टिप के साथ अच्छी सफलता हासिल की है. पिपेट में बड़ा उद्घाटन न्यूरॉन्स नुकसान जबकि छोटे के उद्घाटन के लिए लंबी अवधि के रिकॉर्डिंग में परिणाम में विफल होते हैं.
- Pipettes Sylgard के साथ लेपित समाई को कम करने के लिए. खींच विंदुक युक्तियाँ हल्के से 184 Sylgard एक दूसरे विंदुक का उपयोग के साथ लेपित हैं. Sylgarded सुझावों तो गर्मी एक गर्मी बंदूक का उपयोग कर ठीक कर रहे हैं. ये pipettes तो स्नान perfusate से भर रहे हैं. विंदुक युक्तियाँ के दृश्य में वृद्धि करने के लिए, Alexa की एक छोटी राशि - 568 विंदुक समाधान के रूप में pipettes भरने से पहले इस्तेमाल किया स्नान समाधान के हिस्से के लिए जोड़ा जाता है. हम Alexa 568 वज़न नहीं है, लेकिन बल्कि का उपयोग करने के लिए पर्याप्त आंख से समाधान गुलाबी बारी. विंदुक युक्तियाँ तब टेक्सास लाल फिल्टर के तहत visualized किया जा सकता है.
- हम एक कार्रवाई कम प्रतिरोध मुहरों (चर्चा देखें) का उपयोग क्षमता का पता लगाने के के लिए वर्तमान दबाना रिकॉर्डिंग प्राप्त दृष्टिकोण विकसित किया है . रिकॉर्डिंग सेल अंतर्जात आराम क्षमता पर नहीं लागू वर्तमान का उपयोग Axon साधन 2B Axoclamp के साथ प्रदर्शन कर रहे हैं. हालांकि, कम प्रतिरोध मुहर के कारण, एक कार्रवाई क्षमता सिर्फ 2B प्रवर्धक के साथ पता नहीं लगा सकता. संकेत वृद्धि करने के लिए, एक दूसरे प्रवर्धक (AM सिस्टम 3000) Axoclamp 2B के साथ श्रृंखला में प्रयोग किया जाता है. इस दृष्टिकोण ढीली लंबी अवधि के रिकॉर्डिंग के जवानों और उपयोगिता की आसानी है. तकनीकी तौर पर, एक सीधे कार्रवाई क्षमता को मापने कर सकते हैं, जिससे वोल्टेज क्लैंप रिकॉर्डिंग मोड में दृष्टिकोण के साथ समस्याओं circumventing (चर्चा देखें).
- एक पूरे सेल रिकॉर्डिंग विन्यास के लिए दृष्टिकोण के रूप में एक समान फैशन में एक ही समय में दो पहले से चयनित न्यूरॉन्स की सतह के लिए दो pipettes, लेता है. दोनों ने निकटएक ही समय में urons अधिक सफल जोड़ी के प्रत्येक न्यूरॉन को स्वतंत्र करने का प्रयास से दोहरी रिकॉर्डिंग प्राप्त करने में किया गया है. इस समय के दौरान, वर्तमान इंजेक्शन दालों 2B एम्पलीफायर से पारित कर रहे हैं के रूप में पूरे सेल रिकॉर्डिंग के लिए दृष्टिकोण के दौरान किया जाता है.
- टिप clogging रोकने सकारात्मक दोनों pipettes पर दबाव बनाए रखा जाना चाहिए. दोहरी रिकॉर्डिंग के लिए सकारात्मक दबाव सर्वश्रेष्ठ unfilled 3 मिलीलीटर खाली टयूबिंग का टुकड़ा की एक लंबाई के द्वारा विंदुक धारक से जुड़ी सिरिंज का उपयोग करके उत्पन्न होता है. सीरिंज का प्रयोग एक दोनों pipettes पर दबाव बनाए रखने के लिए अनुमति देता है. सकारात्मक दबाव के रूप में जल्द ही के रूप में पिपेट रिकॉर्डिंग चैम्बर के स्नान समाधान में रखा गया है लागू किया जाना चाहिए. Sequentially pipettes के साथ चयनित न्यूरॉन्स दृष्टिकोण. पहली विंदुक न्यूरॉन का सबसे बड़ा सतह पर सीधे स्थिति के बाद, एक जगह में सिरिंज छोड़ने के द्वारा सकारात्मक बनाए रखता है और इस स्थिति में पिपेट पत्ते. एक तो रिकार्डिंग कक्ष के शीर्ष करने के लिए देता है और स्थिति में दूसरी रिकॉर्डिंग विंदुक कम करती है. चयनित न्यूरॉन्स टुकड़ा के विभिन्न स्तरों पर अक्सर रहे हैं. पहली विंदुक न्यूरॉन है कि टुकड़ा और अधिक सतही न्यूरॉन में दूसरा पिपेट की स्थिति में गहरी है पर तैनात किया जाना चाहिए. यह दूसरा पिपेट की स्थिति बदलने के रूप में टुकड़ा थोड़ा ऊर्ध्वाधर विमान में स्थानांतरित रूप pipettes टुकड़ा दर्ज करने से दूसरे पिपेट की स्थिति रोकता है.
- ढीले जवानों (18-30 MΩ) का उपयोग किया जाएगा. सकारात्मक दबाव प्रत्येक कोशिका की सतह पर एक छोटी सी हिलकोरे प्रेरित करेगा. एक सकारात्मक दबाव जारी है और बहुत मामूली नकारात्मक दबाव लागू करने से पहले न्यूरॉन सील करने का प्रयास. सकारात्मक दबाव सिरिंज को हटाने के द्वारा जारी है. मुंह से सक्शन तो टयूबिंग के मुक्त अंत करने के लिए लागू किया जाता है. एक स्वस्थ न्यूरॉन झिल्ली जल्दी सकारात्मक दबाव की रिहाई के लिए जवाब विंदुक के लिए पालन. थोड़ा सा चूषण एक स्वस्थ न्यूरॉन में उपयुक्त प्रतिरोध के साथ एक सील के रूप में होगा.
- जब एक के लिए एक न्यूरॉन और विफल रहता है सील करने का प्रयास, पिपेट नहीं किया जा के बाद से झिल्ली केवल बहुत कांच साफ मुहर फिर से इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके बजाय, एक विंदुक (और खुर्दबीन उद्देश्य) टुकड़ा की सतह से दूर उठाती अच्छी तरह छिड़काव के शीर्ष स्नान से विंदुक निकालता है, एक साफ विंदुक परिवर्तन और फिर टुकड़ा करने के लिए अन्य कक्ष को सील करने का प्रयास . इन कारण के लिए, यह महत्वपूर्ण है रिकॉर्डिंग के लिए कई संभावित न्यूरॉन्स का चयन करें. 4-6 रिकॉर्डिंग गुणवत्ता न्यूरॉन्स कम से कम जो से चुनने के साथ स्लाइस के लिए, दोहरी रिकॉर्डिंग प्राप्त करने में सफलता सीमित है.
- एक ढीला प्रतिरोध पर आधारित सील की स्थापना के बाद, 2B एम्पलीफायर से वर्तमान इंजेक्शन दालों समाप्त कर रहे हैं. 2B amplifer 3000 श्रृंखला amplifer के साथ श्रृंखला में रखा गया है. इस विन्यास में, 2B amplifer के उत्पादन में 3000 श्रृंखला amplifer के लिए इनपुट के रूप में में कार्य करता है. उत्तरार्द्ध amplifer डाटा अधिग्रहण के लिए संकेत प्रदान करता है.
- मुहर (4 कदम) और amplifers पुनर्विन्यासन (कदम 5) तो दूसरा न्यूरॉन के लिए दोहराया है.
चित्रा 1 की अवधि दो GnRH एक बाण के समान टुकड़ा तैयारी में ढीली मुहर संलग्न रिकॉर्डिंग विन्यास का उपयोग न्यूरॉन्स में फायरिंग में वृद्धि हुई. टुकड़ा एक बधिया पुरुष से निकाली थी. प्रत्येक उर्ध्व विक्षेपन एक संभावित कार्रवाई इंगित करता है. नोट है कि एक GnRH न्यूरॉन (शीर्ष निशान) लगभग लगातार फायरिंग दर्शाती है जबकि दूसरा GnRH न्यूरॉन आंतरायिक फटने दर्शाती है. एकल GnRH न्यूरॉन्स से गतिविधि के इस पैटर्न vivo (7) में हार्मोन स्राव के दौरान एक बहु इकाई रिकॉर्डिंग से निकाले इकाइयों के समान है. कृपया यहाँ क्लिक करें संख्या 1 के एक बड़ा संस्करण देख.
Discussion
GnRH न्यूरॉन्स (हार्मोन स्राव के आधार पर) सहित कुछ न्यूरॉन्स में ब्याज की गतिविधि घंटे का समय तराजू (5-7) पर होता है. इसलिए, पूरे सेल विन्यास कुछ प्रयोगात्मक पूरे सेल रिकॉर्डिंग मोड में intracellular दूत के डायलिसिस की वजह से लक्ष्य के लिए सबसे अच्छा विकल्प नहीं है. Secondarily, पूरे सेल रिकॉर्डिंग आम तौर पर कम उम्र के बारे में 120 दिनों की तुलना में पशुओं के लिए सीमित कर रहे हैं. उम्र के साथ, neuronal झिल्ली के लिए ठोस बनाना, उच्च प्रतिरोध मुश्किल से हासिल जवानों बनाने दिखाई देते हैं. इसके अतिरिक्त, एक अगर एक उच्च प्रतिरोध मुहर प्राप्त है, rupturing पैच मुहर बाधित, पिपेट और झिल्ली के बीच एक छेद छोड़ने. यह एक व्यर्थ रिकॉर्डिंग और एक न्यूरॉन है कि जल्दी से ईओण असंतुलन के कारण मर जाएगा की ओर जाता है है. नियमित रूप से डिम्बग्रंथि के चक्र और इस प्रकार, GnRH पल्स जनरेटर के स्थिर गतिविधि के बाद के जीवन में जब तक नहीं होती (C57Bl6 महिलाओं में उम्र के 7-10 महीने, 11, 12), उम्र के परे जब एक यथोचित पूरे सेल रिकॉर्डिंग प्राप्त करने की आशा कर सकते हैं मज़बूती से. अंत में, पूरे सेल रिकॉर्डिंग आंतरिक और बाह्य आयन सांद्रता के अंतर्जात अनुपात को नष्ट. पूरे सेल रिकॉर्डिंग के साथ, किसी भी आयन एकाग्रता आंतरिक विंदुक समाधान में आयन की एकाग्रता के बराबर होती है . यह है क्योंकि विंदुक समाधान है अपेक्षाकृत बड़ी मात्रा में तेजी से संतुलन तक पहुँच के साथ / अपेक्षाकृत छोटे सेल के अंतर्जात मात्रा की जगह है.
ढीले सेल संलग्न दृष्टिकोण पूरे सेल रिकॉर्डिंग की सीमाओं के कई circumvents. सबसे पहले, एक कम प्रतिरोध मुहर (15-30 MΩ) इस्तेमाल किया जा सकता है. ये अपेक्षाकृत आसान बड़े जानवरों से न्यूरॉन्स में भी फार्म कर रहे हैं. दूसरे, एक झिल्ली टूटना सील पैच नहीं करता है. इसलिए, ढीला सेल संलग्न रिकॉर्डिंग तकनीकी पूरे सेल रिकॉर्डिंग की तुलना में आसान हैं. इसके अतिरिक्त, के बाद से कोशिका झिल्ली बरकरार है, intracellular घटकों का डायलिसिस हो और अंतर्जात ईओण का अनुपात संरक्षित कर रहे हैं नहीं करता है. एक ढीला सेल संलग्न दृष्टिकोण synaptic धाराओं के अध्ययन के लिए नहीं का उपयोग करें, लेकिन यह एक अपेक्षाकृत गैर इनवेसिव तरीके से न्यूरॉन्स से लंबी अवधि के रिकॉर्डिंग के लिए आदर्श है. सेल संलग्न रिकॉर्डिंग भी पिपेट में किसी भी मानक intracellular समाधान का उपयोग किया जा सकता है. यह झिल्ली पैच rupturing जब लंबे समय तक रिकॉर्डिंग पूरा हो गया है और एक intracellular मार्कर के साथ न्यूरॉन लेबलिंग का अतिरिक्त लाभ प्रदान करता है.
ढीला सेल संलग्न दृष्टिकोण वोल्टेज क्लैंप रिकॉर्डिंग मोड में प्रयोग किया गया है. हालांकि, ढीला सेल संलग्न विन्यास में वोल्टेज क्लैंप रिकॉर्डिंग कई methodological समस्याओं है. सबसे पहले, संकेत दर्ज गतिविधि के एक अप्रत्यक्ष उपाय है. संकेत है कि (के रूप में मौजूदा कार्रवाई तथाकथित) मापा जाता है capacitive वर्तमान है कि झिल्ली (13) का प्रभार है. यह एक अत्यंत महत्वपूर्ण methodological मुद्दा है. समाई और एक रिकॉर्डिंग विंदुक के प्रतिरोध दर्ज संकेत फ़िल्टर कर सकते हैं. यह बहुत संभावना है कि छोटे कार्रवाई धाराओं विंदुक है, जो ठीक से अधिकांश एम्पलीफायरों, headstage के उच्च प्रतिरोध के कारण के साथ मुआवजा नहीं किया जा सकता है की समाई चार्ज में खो रहे हैं. जब इन संकेतों को नहीं चल पाता जाना, न्यूरॉन के स्पष्ट फायरिंग पैटर्न सच फायरिंग पैटर्न को प्रतिबिंबित नहीं करता. इसी तरह, uncompensated विंदुक और सील resistances जब कार्रवाई धाराओं को व्यक्त कर रहे हैं जैसे परिवर्तन (13) के दौरान मापन में महत्वपूर्ण त्रुटियों के कारण. कुछ एम्पलीफायरों समाई और प्रतिरोध विंदुक और सील, जो संकेत हानि की सीमा के लिए "मुआवजा" प्रदान करते हैं, लेकिन सबसे एम्पलीफायरों उच्च प्रतिरोध सिर चरणों इष्टतम मुआवजा बाधा. दूसरे, एक कृत्रिम स्थिति सेल पर लगाया है. वोल्टेज दबाना मोड में, कोशिका झिल्ली के आसपास के क्षेत्र में एक निश्चित क्षमता के लिए आयोजित किया जाता है, इन अध्ययनों, 0 एम वी में. इसका मतलब यह नहीं है वहाँ नहीं चालू है कोशिका झिल्ली को लागू. वोल्टेज दबाना में मापा संकेत वास्तव में झिल्ली के लिए तय की क्षमता बनाए रखने के लिए लागू वर्तमान की राशि है. इसलिए, यह लागू मौजूदा सेल गतिविधि में परिवर्तन कर सकते हैं.
GnRH प्रणाली में दोहरी रिकॉर्डिंग विशेष रूप से GnRH न्यूरॉन्स और उनके फैलाना वितरण की सीमित संख्या के कारण चुनौती दे रहे हैं. दोहरी रिकॉर्डिंग के सफल होने के लिए जोड़तोड़ बेहद स्थिर होना चाहिए. यहां तक कि इलेक्ट्रोड के मामूली आंदोलन विंदुक का कारण के लिए रवाना न्यूरॉन पर्ची और रिकॉर्डिंग के अंत कर सकते हैं. इसके अलावा, सेल पर विंदुक के आंदोलन (उदाहरण के लिए, फिर से स्थिति को आंदोलन के लिए क्षतिपूर्ति) फायरिंग पैटर्न बदल सकते हैं. कुछ आयन चैनलों जैसे N-प्रकार कैल्शियम चैनल यंत्रवत् संवेदनशील हैं: झिल्ली खिंचाव दोनों पूरे सेल और सेल संलग्न रिकॉर्डिंग विन्यास (14) में दोहरावदार गतिविधि का कारण बनता है. अंत में, जोड़तोड़ प्रणाली निहायत ठीक है और चिकनी गति के लिए सक्षम होना चाहिए. जैसा कि ऊपर दोहरी रिकॉर्डिंग के साथ, ने कहा, एक दो पहले से चयनित न्यूरॉन्स की सतह के लिए एक ही समय और सील करने का प्रयास दो pipettes लेताएक न्यूरॉन. यदि सफल, फिर एक प्रयास दूसरा सेल मुहर. आम तौर पर, एक सील और हर प्रयास के साथ एक उच्च गुणवत्ता रिकॉर्डिंग नहीं की उम्मीद कर सकते हैं. यह, हालांकि, दोहरी रिकॉर्डिंग के साथ एक विशेष समस्या पैदा करता है. यदि एक पहली न्यूरॉन के साथ सफल है, लेकिन दूसरे के साथ विफल रहता है, एक विंदुक को बदलने और एक अलग सेल की कोशिश करना चाहिए. इसलिए, एक सफलतापूर्वक सील न्यूरॉन में बाधा पहुँचा के बिना अच्छी तरह छिड़काव के शीर्ष (विंदुक परिवर्तन) के लिए दोनों माइक्रोस्कोप के विसर्जन के उद्देश्य और विंदुक को स्थानांतरित करने के लिए सक्षम होना चाहिए.
हमारे विकास और दोहरी रिकॉर्डिंग के लिए ढीला सेल संलग्न दृष्टिकोण के उपयोग GnRH न्यूरॉन्स अध्ययन में एक प्रमुख तकनीकी अग्रिम है. यह उपयोगी परिणाम है कि क्षेत्र आगे काँपने के गुणवाला हार्मोन स्राव में परिणाम है कि तंत्र क्या समन्वित गतिविधि आबाद महत्वपूर्ण प्रश्न के संदर्भ में ले जाने के मदद मिलेगी उत्पादन की संभावना है
Acknowledgments
मैं रोनाल्ड एल Calabrese, Dieter शुद्ध ऊनी कपड़ा (Emory विश्वविद्यालय) और वार्ड Yuhas (Axon उपकरण) उपयोगी तकनीकी चर्चा के लिए आभारी हूँ.
References
- Silverman, A. J. The gonadotropin releasing-hormone (GnRH) neuronal systems: immunocytochemistry. The Physiology of Reproduction. Knobil, E., Neill, J. D. , Raven Press. New York. (1994).
- Freeman, M. E. The neuroendocrine control of the ovarian cycle of the rat. In: The physiology of reproduction. The Physiology of Reproduction. Knobil, E., Neill, J. D. , Raven Press. New York. (1994).
- Belchetz, P. E., Plant, T. M., Nakai, Y., Keogh, E. J., Knobil, E. Hypophysial responses to continuous and intermittent delivery of hypopthalamic gonadotropin-releasing hormone. Science. 202, 631-633 (1978).
- Maurer, J. A., Wray, S. Luteinizing hormone-releasing hormone quantified in tissues and slice explant cultures of postnatal rat hypothalami. Endocrinology. 140, 791-799 (1999).
- Harris, G. C., Levine, J. E. Pubertal acceleration of pulsatile gonadotropin-releasing hormone release in male rats as revealed by microdialysis. Endocrinology. 14, 163-171 (2003).
- Sisk, C. L., Richardson, H. N., Chappell, P. E., Levine, J. E. In vivo gonadotropin-releasing hormone secretion in female rats during peripubertal development and on proestrus. Endocrinology. 142, 2929-2936 (2001).
- Cardenas, H., Ordog, T., O'Byrne, K. T., Knobil, E. Single unit components of the hypothalamic multiunit electrical activity associated with the central signal generator that directs the pulsatile secretion of gonadotropic hormones. Proc Natl Acad Sci U S A. 90, 9630-9634 (1993).
- Silverman, A. J., Wilson, R., Kesner, J. S., Knobil, E. Hypothalamic localization of multiunit electrical activity associated with pulsatile LH release in the rhesus monkey. Neuroendocrinology. 44, 168-171 (1986).
- Roberts, C. B., O'Boyle, M. P., Suter, K. J. Dendrites determine the contribution of after depolarization potentials (ADPs) to generation of repetitive action potentials in hypothalamic gonadotropin releasing-hormone (GnRH) neurons. J Comput Neurosci. 26, 39-53 (2009).
- Spergel, D. J., Kruth, U., Hanley, D. F., Sprengel, R., Seeburg, P. H. GABA- and glutamate-activated channels in green fluorescent protein-tagged gonadotropin-releasing hormone neurons in transgenic mice. J Neurosci. 19, 2037-2050 (1999).
- Nelson, J. F., Felicio, L. S., Randall, P. K., Sims, C., Finch, C. E. A longitudinal study of estrous cyclicity in aging C57BL/6J mice: I. Cycle frequency, length and vaginal cytology. Biol Reprod. 27, 327-339 (1982).
- Gee, D. M., Flurkey, K., Finch, C. E. Aging and the regulation of luteinizing hormone in C57BL/6J mice: impaired elevations after ovariectomy and spontaneous elevations at advanced ages. Biol Reprod. 28, 598-607 (1983).
- Anson, B. D., Roberts, W. M. Loose-patch voltage-clamp technique. Neuromethods, Patch-clamp analysis: Advanced techniques. Walz, W., Boulton, A. A., Baker, G. B. 35, Humana Press. Place Unknown. 265-286 (2002).
- Calabrese, B., Tabarean, T., Juranka, P., Morris, C. E. Mechanosensitivity of N-type calcium channel currents. Biophys J. 83, 2560-2574 (2002).
- Higure, Y., Katayama, Y., Takeuchi, K., Ohtubo, Y., Yoshii, K. Rapid killing of single neurons by irradiation of intracellularly injected dye. Science. 206, 702-704 (1979).
- Higure, Y., Katayama, Y., Takeuchi, K., Ohtubo, Y., Yoshii, K. Lucifer Yellow slows voltage-gated Na+ current inactivation in a light-dependent manner in mice. J Physiol. 550, 159-167 (2003).
