Dual-Somatische Recordings von Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) Neuronen von Green Fluorescent Protein (GFP) in Hypothalamus Slices Identified

Summary

Aktivität in neuronalen Systemen erfordert oft synchrone Aktionspotential Entladungen von Neuronen innerhalb einer bestimmten Population. Zum Beispiel, Impulse von Gonadotropin-Releasing-Hormon (GnRH) wahrscheinlich erfordern deshalb eine koordinierte Aktivität zwischen GnRH-Neurone. Wir präsentieren unsere methodische Ansatz für die zuverlässige Beschaffung gleichzeitige elektrophysiologischen Ableitungen aus dem diffus verteilt GnRH Neuronen.

Abstract

Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) ist ein kleines Neuropeptid, das Hypophysen-Version von luteinisierendes Hormon (LH) und Follikel-stimulierendes Hormon (FSH) reguliert. Diese Gonadotropine sind essentiell für die Regulierung der reproduktiven Funktion. Die GnRH-haltigen Neuronen sind diffus über den Hypothalamus und Projekt der Median Eminenz verteilt, wo sie GnRH aus ihren Axonterminalen Freisetzung in die hypophysiotropic Portal-System (1). In dem Portal Kapillaren, reist GnRH die Hirnanhangdrüse die Freisetzung von Gonadotropinen in den systemischen Kreislauf zu stimulieren. GnRH Release ist nicht kontinuierlich, sondern tritt in episodischen Impulse. Es ist bekannt, dass die intermittierende Weise von GnRH Freisetzung notwendig für die Fortpflanzung (2, 3).

Koordination der Tätigkeit mehrerer GnRH Neuronen wahrscheinlich zugrunde GnRH-Pulse. Insgesamt Peptid-Gehalt in GnRH-Neurone ist etwa 1,0 pg / Zelle (4), von denen 30% Wahrscheinlichkeit besteht die lösbare Pool. Levels von GnRH während eines Pulses (5, 6), deuten mehrere GnRH Neuronen sind wahrscheinlich in Neurosekretion beteiligt. Ebenso Einheit Aktivität von Hypothalamus Multi-Unit-Aufnahmen während der LH-Freisetzung extrahiert zeigt Veränderungen der Aktivität mehrerer Neurone (7). Die Elektroden mit aufgezeichneten Aktivität während der LH Impulse werden entweder mit GnRH Somata oder Fasern (8) verbunden sind. Daher kann zumindest einige dieser Aktivitäten ergibt sich aus GnRH Neuronen.

Die Mechanismen, die dazu führen, dass synchronisiert feuern in hypothalamischen GnRH-Neurone sind unbekannt. Die Aufklärung der Mechanismen, Brennen in GnRH-Neurone zu koordinieren ist ein komplexes Problem. Zunächst werden die GnRH-Neurone relativ wenige. In Nagetiere, gibt es 800-2500 GnRH Neuronen. Es ist nicht klar, dass alle GnRH-Neurone in episodische GnRH Freisetzung beteiligt sind. Darüber hinaus sind GnRH-Neurone diffus verteilt (1). Dies hat unser Verständnis der Koordinierung des Brand kompliziert und hat viele technische Ansätze unlösbar. Wir haben lose Zellen befestigt Aufnahmen in Current-Clamp-Modus zum direkten Nachweis von Aktionspotentialen optimiert und entwickelt eine Aufnahme Ansatz, der für die gleichzeitige Aufnahmen von Paaren von GnRH-Neurone können.

Protocol

1. Hypothalamic Hirnschnitten bereit sind, inkubiert und die Aufnahme Kammer wie zuvor ausführlich (9) in Tieren, deren GnRH Neuronen exprimieren grün fluoreszierende Protein (GFP) unter der Kontrolle des GnRH-Peptid-Promotor (10). Nach Entfernung des Gehirns aus dem Tier, ist das Gehirn blockiert mit einer Rasierklinge in Regionen, die nicht von Interesse sind zu beseitigen. Um die Regionen zu entfernen zu bestimmen, wird das Gehirn auf der dorsalen Fläche platziert, so dass der Hypothalamus visualisiert werden können. Sowohl für den koronalen und sagittalen Schicht Orientierungen, ist das Kleinhirn entfernt. Für koronare Schicht Vorbereitung, ist der rostralen Teil des Kortex entfernt. In diesem Stück Orientierung bieten die seitlichen Bereiche der Hirnrinde Unterstützung für das Schneiden des Gehirns und eine ausreichende Fläche des Gehirns für die Platzierung von Silberdraht an das Gehirn bei der Aufnahme Kammer zu sichern. Für die sagittalen Schicht Vorbereitung sind die seitlichen Regionen des Gehirns entfernt und die rostralen Teile der Hirnrinde bieten die Unterstützung für Gehirn Schneiden und für die Platzierung von Silber Drähte mit dem Gehirn in der Aufnahme gut zu sichern. Während der Sperrung Verfahren wird das Gehirn ständig befeuchtet mit kaltem künstlichen Liquor (ACSF) mit einer Glaspipette.
2. Eine kleine Menge Sekundenkleber ist auf dem neuesten Plattform gesetzt. Das Gehirn ist mit einem Spatel angehoben. Überschüssiges ACSF wird durch mitbringen Kimwipe an die Oberfläche der Spachtel und Zeichnung über ACSF Entfernung aus dem Gehirn entfernt. Das Gehirn ist leicht nach vorne geschoben auf den Leim. Es ist wichtig, nicht auf das Gehirn zu berühren oder drücken Sie auf es, um es zu sichern. Das Gewicht des Gehirns selbst ist in der Regel ausreichend, um sicherzustellen, dass es sicher ist.
3. Das Gehirn und das Schneidwerk wird dann an den vibrierenden Mikrotom gesichert und das Schneiden gut mit kaltem ACSF gefüllt. Die kalte Lösung beide Firmen das Gehirn und kann vor Beschädigungen während des Schneidens Verfahren zu schützen. Verschiedenen Hirnregionen unterschiedlich im Grad der Kälte, die Qualität Scheiben optimiert. Die Temperatur des ACSF für die Vorbereitung der Hypothalamus Scheiben ist in der Regel 0 ° C.
4. Scheiben sollte langsam geschnitten und jede Scheibe sollten frei weg schwimmen aus dem Gehirn. Wenn Scheiben beim Schneiden curl beginnen, sollten die Geschwindigkeit, mit der Klinge voran verlangsamt werden. Man kann mit einem kleinen Pinsel auf uncurl Scheiben aber das bedeutet Gefahr der Beschädigung der Scheiben und sollte daher vermieden werden. Langsam wird die Vorschubgeschwindigkeit der Klinge ist über mit einem Pinsel bevorzugt.
5. Da jede Scheibe aus dem Gehirn geschnitten wird, ist es aus der Trennkammer entnommen und in eine Scheibe Inkubationskammer in einem warmen Wasserbad (ca. 32 ° C). Die Scheibe Inkubator wird kontinuierlich mit Sauerstoff mit einer Mischung aus 95% O ₂ und 5% CO ₂ zugeführt. Generell Pre-Recording-Scheibe Inkubationszeit reicht von 30 Minuten bis 2 Stunden.
6. Glaspipetten (3-6 MOhm) hergestellt sind, wie zuvor beschrieben (9) mit einer vertikalen Abzieher. Die Temperatur und Dauer des Ziehens hängt von der Art der Pipette Abzieher benutzt man die Art von Glas verwendet man und die Lebensdauer der Heizfaden des puller basiert. Die Form der Pipettenspitze kann auch variieren je nach Präferenz des Nutzers. Wir haben gute Erfolge mit einer gleichmäßig konische Spitze mit einer Öffnung von 0,1 mm erreicht. Größere Öffnungen in der Pipette neigen dazu, die Neuronen beschädigen, während kleinere Öffnungen in langen Dauer Aufnahmen Ergebnis ausfallen.
7. Pipetten mit Sylgard beschichtet, um Kapazität zu reduzieren. Gezogen Pipettenspitzen sind leicht mit Sylgard 184 mit einer zweiten Pipette aufgetragen. Sylgarded Tipps sind dann thermisch gehärtet mit einer Heißluftpistole. Diese Pipetten sind dann mit dem Bad Perfusat gefüllt. Zur Erhöhung der Visualisierung der Pipettenspitzen, wird eine kleine Menge von Alexa-568, um den Teil des Bades als Pipettenlösung vor dem Befüllen der Pipetten verwendet werden aufgenommen. Wir wissen nicht wiegen die Alexa-568, sondern genug zu verwenden, um die Lösung pink von Auge drehen. Die Pipettenspitzen können dann unter dem Texas-Rot-Filter visualisiert.
8. Wir haben einen Ansatz zur Strom-Clamp Messungen zur Detektion von Aktionspotentialen mit geringem Widerstand Dichtungen (siehe Diskussion) zu erhalten entwickelt. Die Aufnahmen werden in der Zelle endogene Ruhepotential ohne angelegten Strom mit Axon Instruments 2B Axoclamp durchgeführt. Aufgrund des geringen Widerstandes Dichtung, konnte man nicht erkennen Aktionspotentiale nur mit dem 2B-Verstärker. Zur Erhöhung des Signals ist ein zweiter Verstärker (AM-Systeme 3000) in Serie mit dem Axoclamp 2B verwendet. Dieser Ansatz hat die Leichtigkeit von losen Dichtungen und Nutzen der Langzeit-Aufzeichnungen. Technisch kann man direkt zu messen Aktionspotentiale und damit die Umgehung der Probleme mit dem Ansatz in der Voltage-Clamp-Aufnahme-Modus (siehe Diskussion).
9. Man nimmt zwei Pipetten an der Oberfläche der beiden zuvor markierten Neuronen gleichzeitig, in ähnlicher Weise wie der Ansatz für die ganze Zelle Aufnahme-Konfiguration. Annäherung beider neurons zur gleichen Zeit wurde mehr Erfolg bei der Beschaffung der Dual-Aufnahmen, als zu versuchen jedes Neuron des Paares unabhängig. Während dieser Zeit werden die aktuellen Einspritzimpulse aus der 2B-Verstärker weitergegeben, wie während der Ansatz für Ganzzellableitungen getan wird.
10. Positiver Druck muss auf beiden Pipetten beibehalten werden, um Verstopfungen zu verhindern der Spitze. Positiver Druck für Dual-Aufnahmen ist am besten mit einem ungefüllten 3 ml leere Spritze an den Pipettenhalter von einer Länge von Rohrstück generiert. Mit Spritzen erlaubt es, Druck auf beide Pipetten aufrecht zu erhalten. Positiver Druck sollte so schnell wie der Pipette in die Badlösung der Aufnahme Kammer platziert wurde aufgetragen werden. Man nähert sich dem ausgewählten Neuronen mit den Pipetten der Reihe nach. Nach der Positionierung der ersten Pipette direkt auf die größte Fläche des Neurons, unterhält eine positive, indem man die Spritze in Stelle und lässt die Pipette in dieser Position. Einer kehrt dann an die Spitze der Aufnahme Kammer und senkt die zweite Aufnahme Pipette in die richtige Position. Ausgewählte Neuronen sind oft auf verschiedenen Ebenen der Scheibe. Die erste Pipette sollte über die Neuron, das tiefste in der Scheibe und die Position der zweiten Pipette an der mehr oberflächlichen Neuron positioniert werden. Dies verhindert die Positionierung des zweiten Pipette aus Verschiebung der Positionierung des zweiten Pipette als die Scheibe etwas bewegen wird in der vertikalen Ebene wie Pipetten der Scheibe geben.
11. Lose Dichtungen (18-30 MQ) verwendet werden. Der Überdruck wird induzieren eine kleine Grübchen auf der Oberfläche jeder Zelle. Man versucht zum ersten Neuron durch die Freigabe positiver Druck und Anwendung sehr leichten Unterdruck zu versiegeln. Der Überdruck wird durch Entfernen der Spritze freigegeben. Saug-durch den Mund wird dann an das freie Ende des Schlauchs angewendet. Eine gesunde Neuronen-Membran wird schnell auf die Freisetzung von positiven Druck zu reagieren und sich an der Pipette. Leichten Sog bilden eine Dichtung mit entsprechenden Widerstand in einem gesunden Nervenzelle.


12. Wenn man zu einem Neuron und scheitert Dichtung versucht, kann die Pipette nicht wieder verwendet werden, da Membranen nur Dichtung, sehr sauberes Glas. Stattdessen wirft man die Pipette (und Mikroskop-Objektiv) weg von der Oberfläche der Scheibe an die Spitze der Perfusion gut, entfernt die Pipette aus dem Bad, Änderungen an einer sauberen Pipette und kehrt dann in die Scheibe zu versuchen, eine andere Zelle Dichtung . Für diesen Gründen ist es wichtig, mehrere potenzielle Neuronen für Aufnahmen auszuwählen. Für Scheiben mit weniger als 4-6 Aufnahmequalität Neuronen, von denen wählen, ist der Erfolg bei der Beschaffung von Dual-Aufnahmen beschränkt.
13. Nach der Gründung einer losen Dichtung am Widerstand basiert, werden die aktuellen Einspritzimpulse aus der 2B-Verstärker beendet. Die 2B Verstärker ist in Serie mit dem 3000-Serie Verstärker gelegt. In dieser Konfiguration dient der Ausgabe des 2B Verstärker als Eingang für die 3000-Serie Verstärker. Letztere Verstärker liefert ein Signal für die Datenerfassung.
14. Die Dichtung (Schritt 4) und Rekonfiguration von Verstärkern (Schritt 5) wird dann für das zweite Neuron wiederholt.

Abbildung 1. Ein Zeitraum von mehr schießen in zwei GnRH-Neurone mit dem losen Dichtung angebracht Aufnahme-Konfiguration in einer sagittalen Schicht Vorbereitung. Die Scheibe wurde von einem kastrierten männlichen abgeleitet. Jeder Ausschlag nach oben zeigt ein Aktionspotenzial. Beachten Sie, dass eine GnRH Neuron (top Spuren) fast Dauerfeuer Exponate während der zweite GnRH Neuron weist intermittierende platzt. Dieses Muster der Aktivität von einzelnen Neuronen GnRH ist ähnlich dem der einzelne Einheiten von Multi-Unit-Aufnahmen während der Sekretion in vivo (7) extrahiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version der Abbildung 1 zu sehen.

Discussion

Die Aktivität von Interesse in einigen Neuronen auch GnRH-Neurone (basierend auf Hormonsekretion) tritt auf Zeitskalen von Stunden (5-7). Daher ist die ganze Zelle Konfiguration nicht die beste Wahl für einige experimentelle Ziele durch die Dialyse von intrazellulären Botenstoffen in der ganzen Zelle Aufnahmemodus. In zweiter Linie sind Ganzzellableitungen allgemein Tiere weniger als etwa 120 Tage alt begrenzt. Mit zunehmendem Alter scheinen neuronalen Membranen zu versteifen, so dass eine hohe Beständigkeit Dichtungen nur schwer zu erreichen. Darüber hinaus erhält, wenn man eine hohe Dichtung, Reißen der Patch stört das Siegel, so dass ein Loch zwischen der Pipette und der Membran. Dies führt zu einem unbrauchbaren Aufnahmen und ein Neuron, das schnell sterben wird durch ionische Ungleichgewichte. Regelmäßige Eierstock-Zyklen und damit stabile Aktivität des GnRH-Puls-Generators nicht erst später im Leben auftreten (7-10 Monate alt in C57BL6 Frauen; 11, 12), über das Alter, wenn man vernünftigerweise erwarten, erhalten Ganzzellableitungen zuverlässig. Schließlich zerstören Ganzzellableitungen der endogenen Verhältnisse von internen und externen Ionenkonzentrationen. Mit ganzen Zelle Aufnahmen, entspricht die interne Konzentration von Ionen die Konzentration der Ionen in der Pipette Lösung. Dies liegt daran, Pipettenlösung der relativ großen Volumen schnell ein Gleichgewicht erreicht mit / ersetzt die relativ kleine endogene Volumen der Zelle.

Die lose Zelle angebracht Ansatz umgeht viele der Einschränkungen der whole-cell-Aufnahmen. Erstens kann ein niedriger Widerstand Dichtung (15-30 MQ) verwendet werden. Diese sind relativ einfach, auch in Neuronen von älteren Tieren zu bilden. Zweitens muss man nicht Ruptur der versiegelten Patch der Membran. Daher sind lose Zelle angebracht Aufnahmen technisch viel einfacher als Ganzzellableitungen. Zusätzlich wird, da die Zellmembran intakt ist, ist Dialyse von intrazellulären Komponenten nicht auftreten und endogenen ionischen Verhältnisse erhalten bleiben. Man kann nicht mit dem losen Zelle angebracht Ansatz zur Untersuchung synaptischer Ströme, aber es ist ideal für Langzeit-Aufzeichnungen von Neuronen in einem relativ nicht-invasive Art und Weise. Die Zelle-Attached-Aufnahmen können auch mit jedem Standard intrazelluläre Lösung in der Pipette werden. Dies bietet den zusätzlichen Vorteil, daß dadurch die Membran-Patch, wenn langfristig die Aufnahme abgeschlossen ist und die Kennzeichnung des Neurons mit einem intrazellulären Marker.

Die lose Zelle angebracht Ansatz hat in der Voltage-Clamp-Aufnahme-Modus verwendet. Allerdings hat Voltage-Clamp-Aufnahme in das lose Zelle Attached-Konfiguration mehrere methodische Probleme. Zuerst wird das aufgenommene Signal ein indirektes Maß der Aktivität. Das Signal, das gemessen (die so genannte Aktion Strom) ist der kapazitive Strom, dass die Membran (13) Gebühren. Dies ist eine äußerst wichtige methodische Frage. Die Kapazität und Widerstand einer Aufnahme Pipette filtern das aufgezeichnete Signal. Es ist sehr wahrscheinlich, dass die kleine Aktion Strömungen in Aufladen der Kapazität der Pipette, die nicht richtig mit den meisten Verstärkern, aufgrund der hohen Widerstandsfähigkeit der headstage kompensiert werden, gehen verloren. Wenn diese Signale unentdeckt bleiben, ist die scheinbare Brennen Muster des Neurons nicht den tatsächlichen Feuern Muster. Ebenso führen unkompensierte Pipette und Abdichtwiderstande erhebliche Fehler bei der Messung während Veränderungen wie bei der Aktion Strömungen zum Ausdruck kommen (13). Einige Verstärker sorgen für Kapazität und Widerstand "Entschädigung" für die Pipette und Siegel, welches Signal Loss-Limite, aber hohe Kopf Stufen der meisten Verstärker behindern optimalen Ausgleich. Zweitens ist eine künstliche Situation auf die Zelle eingeführt. In Voltage-Clamp-Modus, ist die Gegend um die Zellmembran zu einem festen Potential gehalten wird, in diesen Studien, 0 mV. Dies bedeutet nicht, es gibt keine Bestromung der Zellmembran. Das Signal in Voltage-Clamp gemessen wird tatsächlich die Menge des angelegten Stroms an die Membran zu dem festen Potential aufrecht zu erhalten. Daher kann diese angelegten Strom verändern die Zellaktivität.

Dual-Aufnahmen in der GnRH-System sind eine besondere Herausforderung aufgrund der begrenzten Anzahl der GnRH-Neurone und deren diffuse Verteilung. Für Dual-Aufnahmen um erfolgreich zu sein, muss der Manipulator als überaus stabil. Auch leichte Bewegung der Elektrode kann die Pipette zu rutschen das Neuron und die Aufnahme zu beenden. Darüber hinaus kann die Bewegung der Pipette auf die Zelle (zB Re-Positionierung, um die Bewegung zu kompensieren) verändern Brennen Muster. Einige Ionenkanäle wie N-Typ-Kalziumkanäle sind mechanisch empfindlich: Membran Strecke führt repetitive Aktivität sowohl Ganzkörper-Zell-und Zell-attached Aufnahme-Konfigurationen (14). Schließlich muss der Manipulator System in der Lage sein überaus feine und gleichmäßige Bewegung. Wie oben, mit zwei Aufnahmen bemerkt, nimmt man zwei Pipetten an der Oberfläche der beiden zuvor markierten Neuronen gleichzeitig und versucht, Dichtungeinem Neuron. Wenn dies gelingt, dann versucht man Siegel der zweiten Zelle. Generell kann man nicht erwarten, zu versiegeln und haben eine hohe Qualität der Aufnahme bei jedem Versuch. Dies erzeugt jedoch ein besonderes Problem mit Dual-Aufnahmen. Wenn man erfolgreich mit dem ersten Neuron ist aber nicht mit dem zweiten, muss man ändern Sie die Pipette und versuchen Sie eine andere Zelle. Deshalb muss man in der Lage sein, sowohl die Tauch-Objektiv des Mikroskops und die Pipette an die Spitze der Perfusion gut (um die Pipette zu ändern) zu bewegen, ohne dass der Erfolg besiegelt Neurons.

Unsere Entwicklung und den Einsatz der losen Zelle-Attached-Ansatz für Dual-Aufnahmen ist ein großer technischer Fortschritt im Studium GnRH Neuronen. Es ist wahrscheinlich, zu brauchbaren Ergebnissen, die dazu beitragen, die Feld, die im Kontext der kritischen Frage, welche Mechanismen zu Grunde liegen die koordinierte Aktivität, die Ergebnisse in pulsatile Hormonsekretion. Produzieren