SNAP-tag et CLIP-tag systèmes d'étiquetage de protéines permettre au particulier, la fixation covalente de molécules, y compris les colorants fluorescents, à une protéine d'intérêt dans les cellules vivantes. Une fois cloné et exprimé, la protéine marquée peut être utilisé avec une variété de substrats pour de nombreuses applications en aval sans avoir à cloner à nouveau.
SNAP-tag et CLIP-tag systèmes d'étiquetage de protéines permettre au particulier, la fixation covalente de molécules, y compris les colorants fluorescents, à une protéine d'intérêt dans les cellules vivantes. Ces systèmes offrent une large sélection de substrats fluorescents optimisé pour une gamme d'instruments d'imagerie. Une fois cloné et exprimé, la protéine marquée peut être utilisé avec une variété de substrats pour de nombreuses applications en aval sans avoir à cloner à nouveau. Il ya deux étapes à l'aide de ce système: le clonage et l'expression de la protéine d'intérêt comme une fusion SNAP-tag, et l'étiquetage de la fusion avec le substrat de SNAP-tag de choix. Le SNAP-tag est une petite protéine humaine basée sur O<sup> 6</sup>-Alkylguanine-ADN-alkyltransférase (hAGT), une protéine de réparation d'ADN. SNAP-tag étiquettes sont des colorants conjugués à la guanine ou chloropyrimidine groupes partants via un linker benzylique. Dans la réaction de l'étiquetage, le groupe benzyle substitué du substrat est fixée de manière covalente à l'SNAP-tag. CLIP-tag est une version modifiée du SNAP-tag, conçu pour réagir avec benzylcytosine plutôt que dérivés benzylguanine. Lorsqu'il est utilisé en conjonction avec SNAP-tag, CLIP-tag permet l'étiquetage orthogonaux et complémentaires de deux protéines simultanément dans les mêmes cellules.
Il ya plusieurs variables qui affectent les résultats observés tels que l'intensité du laser se concentrer, capacités de l'équipement, l'objectif utilisé, etc photostabilité du fluorophore détermine la vitesse de la fluorescence doit être capturé avant de s'estomper.
Cette méthode de marquage des protéines est polyvalent et convient pour de nombreuses applications. Technologies de SNAP-tag et CLIP-tag pour le marquage spécifique de protéines de fusion avec des sondes synthétiques permettent divers aspects de la fonction des protéines, y compris une variété de processus dynamiques dans les cellules vivantes et dans les lysats cellulaires. SNAP-CLIP-MCP-et ACP-tag technologies offrent une polyvalence extraordinaire simplicité et à l'imagerie de protéines dans les cellules vivantes et fixes, et à l'étude des protéines in vitro. La création d'un seul gène de construire donne une protéine de fusion taggés capable de former une liaison covalente à une variété de groupes fonctionnels, y compris les fluorophores, biotine, ou des perles. La protéine d'intérêt doit être cloné et exprimé qu'une seule fois et ensuite la fusion peut être utilisé avec une variété de substrats fluorescents pour de nombreuses applications en aval tels que l'étiquetage de protéines simultanément à l'intérieur des cellules vivantes, la localisation des protéines et translocation, pulse-chase expériences, des études de l'internalisation du récepteur , sélectives étiquetage surface de la cellule, les protéines déroulant tests, la détection de protéines en SDS-PAGE, la cytométrie en flux à haut débit dans les dosages de liaison des plaques de microtitration, des expériences d'interaction biocapteur, et FRET basé dosages de liaison.
The authors have nothing to disclose.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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CHO-K1 Cells | ATCC | CCL-61 | ||
Serum free F-12K | ||||
Lab-Tek II Chambered Coverglass with #1.5 borosilicate coverglass chambers | Nalgene Nunc Int. | 155409 | Lot: 100808-8-0 | |
DMEM | ||||
Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate (10 mg/ml solution in water, 16.2 mM solution) | Invitrogen Molecular Probes | H3570 | 470519 | |
Zeiss Apotome Axiovert 200M fluorescent microscope | Zeiss | |||
Transpass V | New England Biolabs | M2561S | 0030709 | |
Transpass D2 | New England Biolabs | M2554S | 0060802 | |
SNAP-Cell TMR Star | New England Biolabs | S9105S | 0010811 | |
pSNAP-ADBR2 Control Plasmid | New England Biolabs | N9178S | 0010811 | |
pSNAP-H2B Control Plasmid | New England Biolabs | N9179S | 0010811 |