Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Bildebaserte metoder for å studere membrantrafikkhendelser i stomatale avstamningsceller

Published: May 12, 2023 doi: 10.3791/65257
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Biology, Rutgers University, 2Pharmacology and Toxicology Department, University of Arkansas for Medical Sciences

Summary

Flere vanlige metoder introduseres her for å studere membrantrafikkhendelsene til en plasmamembranreseptorkinase. Dette manuskriptet beskriver detaljerte protokoller, inkludert forberedelse av plantemateriale, farmakologisk behandling og konfokal bildeoppsett.

Abstract

I eukaryote celler transporteres membrankomponenter, inkludert proteiner og lipider, spatiotemporalt til deres destinasjon i endomembransystemet. Dette inkluderer sekretorisk transport av nylig syntetiserte proteiner til celleoverflaten eller utsiden av cellen, endocytisk transport av ekstracellulære laster eller plasmamembrankomponenter inn i cellen, og resirkulering eller skytteltransport av last mellom de subcellulære organellene, etc. Membrantrafikkhendelser er avgjørende for utvikling, vekst og miljøtilpasning av alle eukaryote celler og er derfor under streng regulering. Celleoverflatereseptorkinaser, som oppfatter ligandsignaler fra det ekstracellulære rommet, gjennomgår både sekretorisk og endocytisk transport. Vanlige tilnærminger for å studere membrantrafikkhendelser ved bruk av en plasmamembranlokalisert leucinrik-repetisjonsreseptorkinase, ERL1, er beskrevet her. Tilnærmingene inkluderer forberedelse av plantemateriale, farmakologisk behandling og konfokal bildeoppsett. For å overvåke den spatiotemporale reguleringen av ERL1, beskriver denne studien samlokaliseringsanalysen mellom ERL1 og et multivesikulært kroppsmarkørprotein, RFP-Ara7, tidsserieanalysen av disse to proteinene og z-stack-analysen av ERL1-YFP behandlet med membrantrafikkhemmerne brefeldin A og wortmannin.

Introduction

Membrantrafikk er en konservert cellulær prosess som distribuerer membrankomponenter (også kjent som laster), inkludert proteiner, lipider og andre biologiske produkter, mellom forskjellige organeller i en eukaryot celle eller over plasmamembranen til og fra det ekstracellulære rommet1. Denne prosessen forenkles av en samling membraner og organeller kalt endomembransystemet, som består av kjernemembranen, endoplasmatisk retikulum, Golgi-apparatet, vakuol / lysosomer, plasmamembranen og flere endosomer1. Endomembransystemet muliggjør modifikasjon, pakking og transport av membrankomponenter ved hjelp av dynamiske vesikler som skyttelbuss mellom disse organellene. Membrantrafikkhendelser er avgjørende for celleutvikling, vekst og miljøtilpasning og er derfor under streng og kompleks regulering2. For tiden har flere tilnærminger innen molekylærbiologi, kjemisk biologi, mikroskopi og massespektrometri blitt utviklet og anvendt på feltet membranhandel og har i stor grad avansert forståelsen av den spatiotemporale reguleringen av endomembransystemet 3,4. Molekylærbiologi brukes til klassiske genetiske manipulasjoner av de antatte aktørene som er involvert i membranhandel, for eksempel å endre genuttrykket av proteinet av interesse eller merke proteinet av interesse med visse koder. Verktøy i kjemisk biologi inkluderer bruk av molekyler som spesifikt forstyrrer trafikken på visse ruter 4,5. Massespektrometri er kraftig for å identifisere komponentene i en organell som har blitt mekanisk isolert ved biokjemiske tilnærminger 3,4. Imidlertid er membrantrafikk en dynamisk, mangfoldig og kompleks biologisk prosess1. For å visualisere membrantrafikkprosessen i levende celler under forskjellige forhold, er lysmikroskopi et viktig verktøy. Kontinuerlig fremgang har blitt gjort i avanserte mikroskopteknikker for å overvinne utfordringene med å måle effektiviteten, kinetikken og mangfoldet av hendelsene4. Her fokuserer denne studien på de allment vedtatte metodene innen kjemisk / farmakologisk biologi, molekylærbiologi og mikroskopi for å studere membrantrafikkhendelser i et naturlig forenklet og eksperimentelt tilgjengelig system, den stomatale utviklingsprosessen.

Stomata er mikroporer på planteoverflater som åpnes og lukkes for å lette gassutveksling mellom de indre cellene og miljøet 6,7,8. Derfor er stomata avgjørende for fotosyntese og transpirasjon, to hendelser som er avgjørende for planteoverlevelse og vekst. Stomatal utvikling justeres dynamisk av miljømessige signaler for å optimalisere plantens tilpasning til omgivelsene9. Dateres tilbake til studier i 2002, åpnet identifiseringen av reseptorproteinet Too Many Mouths (TMM) døren til en ny æra for å undersøke molekylære mekanismer for stomatal utvikling i modellplanten Arabidopsis thaliana10. Etter bare noen tiår er en klassisk signalvei identifisert. Fra oppstrøms til nedstrøms inkluderer denne banen en gruppe sekretoriske peptidligander i familien epidermale mønsterfaktorer (EFP), flere celleoverflate leucinrike-gjentatte (LRR) reseptorkinaser i EREECTA (ER) -familien, LRR-reseptorproteinet TMM, en MAPK-kaskade og flere bHLH-transkripsjonsfaktorer, inkludert SPEECHLESS (SPCH), MUTE, FAMA og SCREAM (SCRM) 11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26. Tidligere arbeid indikerer at en av reseptorkinasene, ER-LIKE 1 (ERL1), demonstrerer aktiv subcellulær atferd ved EPF-oppfatning20. ERL2 trafikkerer også dynamisk mellom plasmamembranen og noen intracellulære organeller27. Blokkering av membrantrafikktrinnene forårsaker unormal stomatal mønster, noe som resulterer i stomatale klynger på bladoverflaten28. Disse resultatene tyder på at membrantrafikk spiller en viktig rolle i stomatal utvikling. Denne studien beskriver en protokoll for å spatiotemporalt undersøke ERL1-dynamikken ved hjelp av protein-protein subcellulær samlokaliseringsanalyse kombinert med farmakologisk behandling ved bruk av noen membrantrafikkhemmere.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Forberedelse av løsningene

  1. Forbered frøsteriliseringsløsning ved å blande 15 ml blekemiddel med 35 ml destillert vann og 50 μl Triton X-100.
  2. Forbered brefeldin A (BFA) oppløsning ved å oppløse BFA-pulveret i etanol til en endelig konsentrasjon på 10 mM (lager). Forbered wortmannin (Wm) oppløsning ved å oppløse Wm-pulveret i DMSO til en endelig konsentrasjon på 10 mM (stam).

2. Såing av frøene

  1. Aliquot 10-50 frø fra hver av de nødvendige transgene plantene i 1,5 ml mikrosentrifugerør. Tilsett 1 ml frøsteriliseringsløsning i hvert rør, og bland godt ved å snu røret forsiktig i 10 minutter på en shaker.
  2. Kast frøsteriliseringsløsningen, og vask frøene med 1 ml autoklavert destillert vann fem ganger.
  3. Tilsett 300 μL autoklavert destillert vann i hvert rør, og så frøene på MS-medier med halv styrke som inneholder 1% (w / v) sukrose og 0,75% (w / v) agar. Suppler mediet med tilsvarende antibiotika etter behov.
  4. Hold platen opp ned ved 4 °C i mørket i 2 dager for å synkronisere spiringen.
  5. Etter 2 dager, overfør platen til et vekstrom med en mørk syklus på 16 timer / 8 timer (80 μmol / m2 / s1) ved 22 ° C. Dette regnes som den første dagen etter spiring (1 dpg).
  6. Transplanter plantene i jord ved 10 dpg for videre vekst.

3. Fremstilling av dobbeltfargede F1 transgene planter

  1. Dyrk homozygote transgene planter som bærer ERL1-YFP (plante A) og homozygote transgene planter som bærer et RFP-merket markørprotein RFP-Ara7 (plante B)20 side om side til blomstring i et vekstrom med en mørk syklus på 16 timer / 8 timer (80 μmol / m2 / s1) ved 22 ° C.
  2. Velg en ung blomsterstand fra plante A. Hold en blomst som er i ferd med å åpne på blomsterstanden for genetiske kryss. Fjern alle eldre blomster og silikater. I tillegg må du forsiktig fjerne de yngre blomstene og blomstermeristemene for å unngå fremtidig forvirring.
  3. Disseker forsiktig den uåpnede blomsten ved å fjerne begerbladene, kronbladene og pollenbærerne ved hjelp av en skarp pinsett. La bare pistilen ligge på blomsterstanden.
  4. Ta en moden stamen fra en åpnet blomst på plante B, og legg pollenkornene på stigmaet til den dissekerte pistilen på plante A.
  5. Merk denne manuelt kryssede blomsten ved å indikere faren, moren og datoen for det genetiske korset. La blomsten modnes, og høst F1-frøene når silique blir gul/brun (~20 dager etter korset). Se etter et vellykket F1-anlegg som har både YFP- og RFP-signaler.

4. Farmakologisk behandling

  1. For BFA-behandlingen, fjern cotyledonene til 7 dager gamle frøplanter, senk resten av plantene ned i enten en hånlig løsning (0,3% etanol) eller 30 μM BFA-løsning, påfør vakuum i 1 min, og hold prøven nedsenket i 30 minutter før avbildning.
  2. For wortmanninbehandlingen, fjern cotyledonene til 7 dager gamle frøplanter, senk resten av plantene i enten 0,25% DMSO-løsning eller 25 mM wortmannin, påfør vakuum i 1 min, og hold prøven nedsenket i 30 minutter før avbildning.
  3. For vakuumbehandling av prøver, i et 1,5 ml mikrosentrifugerør, tilsett 500 μL av den tilsvarende legemiddeloppløsningen, og senk de dissekerte plantene ned i løsningen. Fest en 10 ml sprøyte godt til mikrosentrifugerøret, og påfør vakuum i 1 min (figur 1). Fjern sprøyten, og oppbevar prøven i løsningen i nødvendig tid. Ta forsiktig ut plantene for bildebehandling.

Figure 1
Figur 1: Enkel vakuumenhet. En 10 ml sprøyte er festet til et 1,5 ml mikrosentrifugerør for vakuumbehandlingen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

5. Prøveklargjøring for avbildning

  1. Dissekere det sanne bladet fra den behandlede prøven ved hjelp av et skarpt barberblad. Legg det sanne bladet forsiktig i en dråpe vann på en glassglass, og hold den abaxiale siden opp. Dekk det sanne bladet sakte med en deksel mens du unngår å fange bobler.

6. Konfokal bildebehandling

MERK: Et Leica SP8 invertert skanning konfokalmikroskop ble brukt til å avbilde fluorescenssignalet til prøvene i dette arbeidet.

  1. Oppsett av strålebane
    1. Velg en 514 nm laser for YFP-eksitasjon. Bruk en høy lasereffekt for å øke signalintensiteten og dermed oppnå høy bildekvalitet. Imidlertid risikerer laserkrefter over 5% fotobleking, og prøvens helse kan påvirkes. Hvis prøvesignalet ikke er for svakt, starter du med lav laserintensitet.
    2. Slå på PMT/HyD for deteksjon, og definer øvre og nedre utslippsbåndsterskler basert på spekteret for YFP-fluoroforen. Still inn et deteksjonsvindu på 530-570 nm for å samle inn YFP-signalet.
    3. Sekvensiell avbildning for den andre fargen: Klikk på Seq-knappen, og legg til en ny kanal. Som standard vil den tidligere utformede YFP-strålebanen være Seq 1. I Seq 2, velg en 561 nm laser for RFP-eksitasjonen, og sett et deteksjonsvindu på 570-630 nm for å samle RFP-signalet.
  2. Oppsett av skannebetingelser (figur 2)
    1. For å avbilde den subcellulære membrantrafikkaktiviteten i stomatale forløperceller, velg et 63x/1.2 W Corr-objektiv på systemet for avbildning.
    2. Formatet refererer til bildestørrelsen i piksler. Start med 1 024 piksler x 1 024 piksler, og optimaliser deretter dette basert på zoomfaktoren og objektivinnstillingene for en god oppløsning av publikasjonskvaliteten.
    3. Hastigheten refererer til hastigheten på skannehodet når laseren passerer over hver piksel. Selv om langsomme skannehastigheter ofte resulterer i et bedre signal-støy-forhold, fanger de kanskje ikke effektivt opp de raskt skiftende membrantrafikkhendelsene. Start med en hastighet på 400 Hz, og optimaliser dette basert på prøvenes spesifikke situasjon.
    4. Zoomfaktoren brukes til å zoome inn på et interesseområde uten å endre objektivlinsen. Start med en zoomfaktor på 1, og optimaliser dette basert på eksperimentets spesifikke behov.
    5. Linjegjennomsnittet refererer til antall ganger hver X-linje vil bli skannet for å oppnå et gjennomsnittlig resultat. Et større linjegjennomsnitt reduserer støyen i det resulterende bildet, men det øker også skannetiden og eksponeringstiden til laserlyset. For å avbilde membrantrafikkhendelser må du ikke bruke et høyt linjegjennomsnitt. Start med et gjennomsnitt på 2x linjer, og optimaliser etter behov.
  3. Innsamling av tidsserier
    MERK: Når man studerer membrantrafikkhendelser, er det ofte nødvendig med en tidsserie for å registrere den raske bevegelsen av de subcellulære endosomene.
    1. I anskaffelsesmodus velger du xyt-skannemodus for å aktivere tidsserieverktøyet.
    2. Bestem en venteperiode mellom tidspunktene under Tidsintervall. Alternativt kan du klikke på Minimer for å ta bildene umiddelbart etter hverandre. Et tidsintervall på 7 s ble brukt i følgende tidsserieeksperiment.
    3. Velg Varighet, og angi den totale tiden eksperimentet skal kjøre. Du kan også definere antall delbilder som skal samles inn, ved å velge Rammer (figur 3).
  4. For å samle inn tredimensjonal informasjon om membrantrafikkhendelsen i hele cellen, bruk Z-stack-skannemodus. Projeksjonen av maksimal intensitet for Z-stack-bildene brukes ofte til analysen.
    1. Velg xyz-skannemodus i anskaffelsesmodus, og deretter blir Z-Stack-verktøyet tilgjengelig.
    2. Velg alternativet Z-wide. Under skannemodus definerer du toppbildet og det nederste bildet av Z-stakken ved hjelp av Start og Slutt-knappene .
    3. Definer tykkelsen på z-trinnet ved å klikke på z-trinns størrelse. Alternativt kan du definere hvor mange bilder som skal tas for å dekke hele spekteret av Z-stakken. For å sikre konsistens mellom prøvene, definer z-trinnstørrelsen (figur 4).
  5. Bildebehandling
    1. Den maksimale intensitetsprojeksjonen av z-stack-bildene genereres av konfokalprogramvaren (http://www.leica-microsystems.com). I den primære Prosess-fanen velger du først den interesserte z-stack-filen under Åpne prosjekter-fanen helt til venstre. Bytt deretter til den midterste fanen som heter Prosessverktøy, velg Projeksjonsfunksjonen , velg Maksimum i rullegardinpanelet til Metode, og klikk på Bruk-knappen . Et z-stack-projeksjonsbilde genereres under fanen Åpne prosjekter.
    2. Videoen av tidsseriebildene er generert av Fiji (https://imagej.net/Fiji). I kategorien Fil bruker du Åpne-funksjonen til å åpne alle tidsseriebildene i riktig rekkefølge. I Bilde fanen, finn Stack funksjon, og velg Bilder å stable for å generere en video. Lagre filen i .avi format med ønsket bildefrekvens (5 bilder / s for Video 1).

Figure 2
Figur 2: Skannemoduspanelet for XY-dimensjonen. Panelet for skannemodus brukes til å konfigurere forholdene for bildeskanning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Tidsserieverktøyet under xyt-skannemodus. Tidsserieverktøyet brukes til å definere bildebetingelsene for å samle en serie bilder fortløpende. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Z-stack-verktøyet under xyz-skannemodus. Z-stack-verktøyet brukes til å konfigurere bildebetingelsene for å samle en serie bilder på z-aksen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En tidligere studie indikerte at ERL1 er en aktiv reseptorkinase som gjennomgår dynamiske membrantrafikkhendelser20. ERL1 er en transmembran LRR-reseptorkinase på plasmamembranen. Nylig syntetisert ERL1 i endoplasmatisk retikulum behandles i Golgi-legemene og transporteres videre til plasmamembranen. ERL1-molekylene på plasmamembranen kan oppfatte EPF-ligander ved å bruke deres ekstracellulære LRR-domene18. Ved aktivering av de hemmende EPFene, inkludert EPF1, blir ERL1 internalisert til endosomer, transportert til multivesikulære legemer (MVB), og deretter transportert inn i vakuolene for nedbrytning for å avslutte signalet20. I motsetning til dette beholder den antagonistiske EPFL9-liganden, som fremmer stomatal dannelse14, ERL1 i endoplasmatisk retikulum. Alternativt kan plasmamembranlokalisert ERL1 resirkulere mellom endosomer og plasmamembranen20.

Her ble transgene planter med ERL1 promotor::ERL1-YFP dyrket i 7 dager etter protokollen nevnt ovenfor. Når det bare dukket opp, ble det sanne bladet dissekert for avbildning, da ERL1 bare uttrykkes i stomatale avstamningsceller i unge blader20. Som forventet ble spredte celler markert av YFP-signalet, der ERL1-YFP merket plasmamembranen (figur 5). I tillegg ble det også observert flere punktsignaler, noe som tyder på at ERL1 også var lokalisert til endosomene.

Flere organeller i planteceller presenterer som punkterte fluorescerende signaler når de observeres under et lysmikroskop, for eksempel trans-Golgi-nettverket og MVB-ene. Når MVB-markørlinjen med RFP-Ara7 ble genetisk krysset med ERL1-YFP transgen linje, ble begge markørproteinene observert ved bruk av sekvensiell avbildningstilnærming som beskrevet ovenfor. Som vist i figur 6 fremhevet RFP-Ara7 flere punktsignaler i nesten alle cellene, noe som indikerer MVBene i disse cellene (figur 6B). Ved sammenslåing med ERL1-YFP-signalet overlappet det meste av ERL1-YFP-positivt punktat med RFP-Ara7-merket punktering. Dette resultatet antyder at noen av ERL1-YFP-molekylene transporteres til MVB-ene.

For å overvåke dynamikken til disse raskt bevegelige endosomene ble tidsseriebilder av de 7 dager gamle sanne bladene med ERL1-YFP og RFP-Ara7 samlet inn (figur 7). Tidsintervaller på 7 s ble brukt for 203 s, og de innsamlede 30 bildene ble brukt til å generere en video i bilde J (Video 1). Videoen viste at ERL1-YFP-merkede endosomer beveget seg sammen med RFP-Ara7 i stomatale avstamningsceller, og bekreftet dermed at ERL1-YFP var lokalisert til MVBene.

For å undersøke ERL1-smuglerruter ved hjelp av en farmakologisk tilnærming, ble effekten av to vanlige membranhandelsmidler, brefeldin A (BFA) og wortmannin (Wm), analysert. BFA, ved å hemme ADP-ribosyleringsfaktoren guanin-nukleotidutvekslingsfaktorer, inkludert GNOM, kan blokkere endosomal resirkulering og endocytose av membranproteiner29. Etter 30 minutters eksponering for BFA-oppløsningen ble ERL1-YFP detektert i noen store rom kjent som BFA-legemer (figur 8B, C). Dette indikerer at ERL1-handel kan blokkeres av BFA, noe som tyder på at ERL1 gjennomgår resirkulering eller endocytose. Wm kan hemme fosfatidylinositol-3 og fosfatidylinositol-4 kinaser og forårsaker dermed fusjon av MVB5. Ved behandling med Wm i 30 minutter ble det observert noen ringlignende strukturer fremhevet av ERL1-YFP, som vanligvis kalles Wm-legemer (figur 8C). Dette resultatet indikerer at ERL1-YFP transporteres til MVB, noe som tyder på at ERL1 følger ruten til vakuoler for nedbrytning.

Figure 5
Figur 5: Enkeltplanbilde av ERL1-YFP. (A) Fluorescensbildet, (B) det lyse feltbildet og (C) det sammenslåtte bildet viser at ERL1-YFP merker plasmamembranen og noe svært mobilt punktat i stomatale avstamningsceller. Skala bar: 10 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Sekvensielle bilder av ERL1-YFP og RFP-Ara7. (A) ERL1-YFP og (B) RFP-Ara7 merker begge punktsignaler i cellen. Det hvite punktatet i (C) det sammenslåtte bildet og (D) det innfelte bildet indikerer at de to proteinene samlokaliserer på MVBene i stomatale avstamningsceller. De hvite pilene indikerer endosomer merket av både ERL1-YFP og RFP-Ara7. De røde pilene indikerer endosomer merket av RFP-Ara7. Skala bar: 10 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: Tidsseriebilder av ERL1-YFP og RFP-Ara7. Bildene er tatt med 7 s tidsintervall. Tidspunktet for hvert bilde er angitt øverst til venstre. Skala bar: 10 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 8
Figur 8: Z-stack bilder av ERL1-YFP. (A, B) Z-stack bilder av ERL1-YFP planter behandlet med (A) mock eller (B) BFA. Tallene øverst til høyre angir posisjonen til bildet i z-stakken fra topp til bunn. Skala bar: 10 μm. (C) Projeksjon av z-stack-bildene av ERL1-YFP behandlet med mock eller BFA-løsning og mock eller Wm-løsning, som angitt øverst til høyre. Pilene indikerer aggregeringsorganene til ERL1-YFP forårsaket av legemidlene. Skala bar: 10 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Video 1: Video av tidsseriebildene av ERL1-YFP og RFP-Ara7. Tidsseriebildene av ERL1-YFP og RFP-Ara7 er stablet inn i en video ved hjelp av Fiji med en hastighet på 5 bilder / s. Klikk her for å laste ned denne videoen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Endomembransystemet separerer cytoplasma av en eukaryot celle i forskjellige rom, noe som muliggjør den spesialiserte biologiske funksjonen til disse organellene. For å levere lastproteiner og makromolekyler til deres endelige destinasjon til rett tid, blir mange vesikler guidet til skyttelbuss mellom disse organellene. Sterkt regulerte membrantrafikkhendelser spiller grunnleggende roller i levedyktighet, utvikling og vekst av celler. Mekanismen som regulerer denne avgjørende og kompliserte prosessen er fortsatt dårlig forstått.

Flere tilnærminger har blitt beskrevet her for å observere subcellulær lokalisering av membranproteiner, analysere samlokaliseringen mellom to membranproteiner merket med forskjellige fluorescerende proteiner, overvåke den dynamiske bevegelsen av et membranprotein ved hjelp av tidsseriebilder og samle 3D-informasjon om et membranprotein ved å utføre z-stack-avbildning som dekker hele cellen. I tillegg til membrantrafikkhendelsene som er beskrevet her, kan disse tilnærmingene enkelt brukes på andre biologiske prosesser. For eksempel kan tidsserieavbildningen utføres over en langsiktig periode (flere dager) for å overvåke en utviklingsprosess30. Z-stack-avbildningen kan utføres for å kvantifisere overflod av et protein i en celle30. I tillegg kan disse bildebehandlingsmetodene perfekt kombineres med farmakologiske applikasjoner, inkludert ulike stoffer, hormoner og til og med miljømessige tegn, noe som indikerer at disse bildebehandlingsmetodene lett kan brukes på levende biologiske prøver. Foruten fleksibiliteten i prøvebehandlingen, krever metodene beskrevet her bare økonomisk rimelige enheter, bortsett fra konfokalmikroskopet, og bare lett opplæring av personellet i de tekniske ferdighetene, noe som betyr at disse metodene kan bli allment vedtatt.

Forsiktighet er nødvendig i flere kritiske trinn i protokollen. For det første varierer de optimale konsentrasjonene av membranhandelen avhengig av materialet og behandlingen. En tidligere studie antyder at 30 μM BFA er en lav konsentrasjon som kan utløse karakteristisk BFA-kroppsdannelse uten å forårsake kollaps av Golgi-apparatet i meristemoider20. På samme måte er 25 μM Wm en lav, men effektiv konsentrasjon som kan gi Wm-kroppsdannelse uten å skade meristemoidene alvorlig. Når et nytt materiale (forskjellige plantearter, forskjellige deler av planten, etc.) behandles, må konsentrasjonene av legemidlene optimaliseres tilsvarende. For det andre, for å opprettholde prøvenes fysiologiske tilstand i maksimal grad under behandlingen, holdes plantene delvis intakte (bare fjerning av cotyledonene) til avbildningstrinnet. Ekte blader dissekeres for lysbildeforberedelse, og prøven avbildes etterpå. Hver prøve må behandles individuelt, og lysbildet må gjøres ferskt for avbildning. Til slutt krever både z-stack-avbildning og tidsserieavbildning gjentatt laserskanning av prøven. For å minimere risikoen for fotobleking og fototoksisitet på prøvene, anbefales en lav lasereffekt sterkt.

Den høye effektiviteten av membrantrafikkhendelser sikres av mangfoldet av trafikkruter og deres kinetikk som svar på cellens spesifikke utviklings- og miljøforhold1. De beskrevne metodene har begrenset spatiotemporal oppløsning, så mer sofistikerte lysmikroskopiteknikker dukker opp for å få detaljert kunnskap om membrantrafikk i en eukaryot celle. For eksempel øker superoppløsningsmikroskopi, inkludert stokastisk optisk rekonstruksjonsmikroskopi (STORM) og fotoaktivert lokaliseringsmikroskopi (PALM), romlig oppløsning av et fluorescensmerket protein31,32, selv om bare faste prøver kan analyseres; Spinning-disk mikroskopi akselererer skanningshastigheten betydelig og reduserer fotobleking av prøvene33, selv om det er utfordrende å registrere dynamikken til proteiner med lav overflod ved hjelp av denne metoden; lysarkmikroskopi gir rask og skånsom 3D-avbildning34,35; og to-foton mikroskopi muliggjør deteksjon av fluorescenssignaler fra dypere vev35,36, men på bekostning av litt lavere oppløsning, etc. I tillegg har kjemisk biologi identifisert mer spesifikke stoffer som blander seg med visse smuglerruter. Til tross for begrensningene vil disse teknikkene sammen med andre nye avanserte teknikker i stor grad forbedre vår kunnskap og kaste lys over mekanismene i cellemembrantrafikksystemet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne oppgir ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av National Science Foundation (IOS-2217757) (X.Q.) og University of Arkansas for Medical Sciences (UAMS) Bronson Foundation Award (H.Z.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mL syringes VWR BD309695 Vacuum samples
Brefeldin A (BFA) Sigma B7651 membrane trafficking drug
Confocal Microscope Leica Lecia SP8 TCS with LAS-X software package Imaging
Dissecting Forceps VWR 82027-402 Genetic cross
Fiji NIH https://imagej.net/Fiji Image processing
Leica LAS AF software Leica http://www.leica-microsystems.com Image processing
transgenic seeds of ERL1-YFP Qi, X. et al. The manifold actions of signaling peptides on subcellular dynamics of a receptor specify stomatal cell fate. Elife. 9, doi:10.7554/eLife.58097, (2020).
transgenic seeds of RFP-Ara7 Ebine, K. et al. A membrane trafficking pathway regulated by the plant-specific RAB GTPase ARA6. Nat Cell Biol. 13 (7), 853-859, doi:10.1038/ncb2270, (2011).
Wortmannin (Wm) Sigma W1628 membrane trafficking drug

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Aniento, F., Sanchez de Medina Hernandez, V., Dagdas, Y., Rojas-Pierce, M., Russinova, E. Molecular mechanisms of endomembrane trafficking in plants. Plant Cell. 34 (1), 146-173 (2022).
  2. Sigismund, S., et al. Endocytosis and signaling: Cell logistics shape the eukaryotic cell plan. Physiological Reviews. 92 (1), 273-366 (2012).
  3. Lyu, Z., Genereux, J. C. Methodologies for measuring protein trafficking across cellular membranes. ChemPlusChem. 86 (10), 1397-1415 (2021).
  4. Rodriguez-Furlan, C., Raikhel, N. V., Hicks, G. R. Merging roads: Chemical tools and cell biology to study unconventional protein secretion. Journal of Experimental Botany. 69 (1), 39-46 (2017).
  5. Foissner, I., Sommer, A., Hoeftberger, M., Hoepflinger, M. C., Absolonova, M. Is wortmannin-induced reorganization of the trans-Golgi network the key to explain charasome formation. Frontiers in Plant Science. 7, 756 (2016).
  6. Qi, X., Torii, K. U. Hormonal and environmental signals guiding stomatal development. BMC Biology. 16 (1), 21 (2018).
  7. Han, S. K., Kwak, J. M., Qi, X. Stomatal lineage control by developmental program and environmental cues. Frontiers in Plant Science. 12, 751852 (2021).
  8. Bharath, P., Gahir, S., Raghavendra, A. S. Abscisic acid-induced stomatal closure: An important component of plant defense against abiotic and biotic stress. Frontiers in Plant Science. 12, 615114 (2021).
  9. Becklin, K. M., Ward, J. K., Way, D. A. Photosynthesis, Respiration, and Climate Change., 1st edition. , Springer. Cham, Switzerland. (2021).
  10. Yang, M., Sack, F. D. The too many mouths and four lips mutations affect stomatal production in Arabidopsis. Plant Cell. 7 (12), 2227-2239 (1995).
  11. Hara, K., Kajita, R., Torii, K. U., Bergmann, D. C., Kakimoto, T. The secretory peptide gene EPF1 enforces the stomatal one-cell-spacing rule. Genes & Development. 21 (14), 1720-1725 (2007).
  12. Hara, K., et al. Epidermal cell density is autoregulated via a secretory peptide, EPIDERMAL PATTERNING FACTOR 2 in Arabidopsis leaves. Plant & Cell Physiology. 50 (6), 1019-1031 (2009).
  13. Hunt, L., Gray, J. E. The signaling peptide EPF2 controls asymmetric cell divisions during stomatal development. Current Biology. 19 (10), 864-869 (2009).
  14. Sugano, S. S., et al. Stomagen positively regulates stomatal density in Arabidopsis. Nature. 463 (7278), 241-244 (2010).
  15. Kondo, T., et al. Stomatal density is controlled by a mesophyll-derived signaling molecule. Plant & Cell Physiology. 51 (1), 1-8 (2010).
  16. Hunt, L., Bailey, K. J., Gray, J. E. The signalling peptide EPFL9 is a positive regulator of stomatal development. New Phytologist. 186 (3), 609-614 (2010).
  17. Shpak, E. D., McAbee, J. M., Pillitteri, L. J., Torii, K. U. Stomatal patterning and differentiation by synergistic interactions of receptor kinases. Science. 309 (5732), 290-293 (2005).
  18. Lin, G., et al. A receptor-like protein acts as a specificity switch for the regulation of stomatal development. Genes & Development. 31 (9), 927-938 (2017).
  19. Lee, J. S., et al. Direct interaction of ligand-receptor pairs specifying stomatal patterning. Genes & Development. 26 (2), 126-136 (2012).
  20. Qi, X., et al. The manifold actions of signaling peptides on subcellular dynamics of a receptor specify stomatal cell fate. Elife. 9, e58097 (2020).
  21. MacAlister, C. A., Ohashi-Ito, K., Bergmann, D. C. Transcription factor control of asymmetric cell divisions that establish the stomatal lineage. Nature. 445 (7127), 537-540 (2007).
  22. Pillitteri, L. J., Sloan, D. B., Bogenschutz, N. L., Torii, K. U. Termination of asymmetric cell division and differentiation of stomata. Nature. 445 (7127), 501-505 (2007).
  23. Ohashi-Ito, K., Bergmann, D. C. Arabidopsis FAMA controls the final proliferation/differentiation switch during stomatal development. Plant Cell. 18 (10), 2493-2505 (2006).
  24. Kanaoka, M. M., et al. SCREAM/ICE1 and SCREAM2 specify three cell-state transitional steps leading to Arabidopsis stomatal differentiation. Plant Cell. 20 (7), 1775-1785 (2008).
  25. Bergmann, D. C., Lukowitz, W., Somerville, C. R. Stomatal development and pattern controlled by a MAPKK kinase. Science. 304 (5676), 1494-1497 (2004).
  26. Wang, H., Ngwenyama, N., Liu, Y., Walker, J. C., Zhang, S. Stomatal development and patterning are regulated by environmentally responsive mitogen-activated protein kinases in Arabidopsis. Plant Cell. 19 (1), 63-73 (2007).
  27. Ho, C. M., Paciorek, T., Abrash, E., Bergmann, D. C. Modulators of stomatal lineage signal transduction alter membrane contact sites and reveal specialization among ERECTA kinases. Developmental Cell. 38 (4), 345-357 (2016).
  28. Le, J., et al. Auxin transport and activity regulate stomatal patterning and development. Nature Communications. 5, 3090 (2014).
  29. Geldner, N., et al. The Arabidopsis GNOM ARF-GEF mediates endosomal recycling, auxin transport, and auxin-dependent plant growth. Cell. 112 (2), 219-230 (2003).
  30. Qi, X., et al. Autocrine regulation of stomatal differentiation potential by EPF1 and ERECTA-LIKE1 ligand-receptor signaling. Elife. 6, 24102 (2017).
  31. Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Angewandte Chemie. 47 (33), 6172-6176 (2008).
  32. Leighton, R. E., Alperstein, A. M., Frontiera, R. R. Label-free super-resolution imaging techniques. Annual Review of Analytical Chemistry. 15 (1), 37-55 (2022).
  33. Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. Spinning-disk confocal microscopy: Present technology and future trends. Methods in Cell Biology. 123, 153-175 (2014).
  34. Gao, R., et al. Cortical column and whole-brain imaging with molecular contrast and nanoscale resolution. Science. 363 (6424), (2019).
  35. Nwaneshiudu, A., et al. Introduction to confocal microscopy. Journal of Investigative Dermatology. 132 (12), (2012).
  36. Sanderson, J. Multi-photon microscopy. Current Protocols. 3 (1), 634 (2023).

Tags

Biologi utgave 195
Bildebaserte metoder for å studere membrantrafikkhendelser i stomatale avstamningsceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

He, Q., Zhang, H., Qi, X.… More

He, Q., Zhang, H., Qi, X. Image-Based Methods to Study Membrane Trafficking Events in Stomatal Lineage Cells. J. Vis. Exp. (195), e65257, doi:10.3791/65257 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter