Summary
Questo protocollo delinea due metodi per l'analisi quantitativa della mitofagia nelle cellule β pancreatiche: in primo luogo, una combinazione di coloranti specifici per mitocondri permeabili alle cellule e, in secondo luogo, un reporter mitofagico geneticamente codificato. Queste due tecniche sono complementari e possono essere implementate in base a esigenze specifiche, consentendo flessibilità e precisione nell'affrontare quantitativamente il controllo di qualità mitocondriale.
Abstract
La mitofagia è un meccanismo di controllo della qualità necessario per mantenere una funzione mitocondriale ottimale. La mitofagia disfunzionale a β cellule provoca un rilascio insufficiente di insulina. Le valutazioni quantitative avanzate della mitofagia spesso richiedono l'uso di reporter genetici. Il modello murino mt-Keima, che esprime una sonda raziometrica a doppia eccitazione sensibile al pH mirata ai mitocondri per quantificare la mitofagia tramite citometria a flusso, è stato ottimizzato in cellule β. Il rapporto tra le emissioni acide e neutre della lunghezza d'onda mt-Keima può essere utilizzato per quantificare in modo robusto la mitofagia. Tuttavia, l'utilizzo di reporter di mitofagia genetica può essere difficile quando si lavora con modelli murini genetici complessi o cellule difficili da trasfettare, come le isole umane primarie. Questo protocollo descrive un nuovo metodo complementare basato su coloranti per quantificare la mitofagia a β cellule nelle isole primarie utilizzando MtPhagy. La mtfagia è un colorante sensibile al pH e permeabile alle cellule che si accumula nei mitocondri e aumenta la sua intensità di fluorescenza quando i mitocondri si trovano in ambienti a basso pH, come i lisosomi durante la mitofagia. Combinando il colorante MtPhagy con Fluozin-3-AM, un indicatore Zn2+ che seleziona le cellule β, e Tetrametilrodamina, estere etilico (TMRE) per valutare il potenziale di membrana mitocondriale, il flusso mitofagico può essere quantificato in modo specifico nelle cellule β tramite citometria a flusso. Questi due approcci sono altamente complementari e consentono flessibilità e precisione nella valutazione del controllo di qualità mitocondriale in numerosi modelli di cellule β.
Introduction
Le cellule β pancreatiche producono e secernono insulina per soddisfare le richieste metaboliche e la disfunzione delle cellule β è responsabile dell'iperglicemia e dell'insorgenza del diabete sia nel diabete di tipo 1 che in quello di tipo 2. Le cellule β accoppiano il metabolismo del glucosio con la secrezione di insulina attraverso l'energetica mitocondriale e l'output metabolico, che dipendono da una riserva di massa mitocondriale funzionale 1,2,3. Per mantenere una funzione ottimale delle cellule β, le cellule β si affidano a meccanismi di controllo della qualità mitocondriale per rimuovere i mitocondri invecchiati o danneggiati e preservare la massa mitocondriale funzionale4. L'autofagia mitocondriale selettiva, nota anche come mitofagia, è una componente chiave del percorso di controllo della qualità mitocondriale.
Le valutazioni della mitofagia nelle cellule vive spesso si basano sui cambiamenti del pH mitocondriale che si verificano durante la mitofagia. I mitocondri hanno un pH leggermente alcalino e i mitocondri sani risiedono normalmente nel citosol a pH neutro. Durante la mitofagia, i mitocondri danneggiati o disfunzionali vengono selettivamente incorporati negli autofagosomi e infine eliminati all'interno dei lisosomi acidi5. Diversi modelli murini reporter di mitofagia transgenica in vivo, come mt-Keima6, mitoQC7 e CMMR8, nonché sonde di mitofagia trasfettabili, come il plasmide Cox8-EGFP-mCherry9, utilizzano questa variazione di pH per fornire valutazioni quantitative della mitofagia. L'uso di topi transgenici che esprimono la sonda raziometrica a doppia eccitazione sensibile al pH mt-Keima è stato ottimizzato per le valutazioni della mitofagia nelle isole e nelle cellule β tramite citometria a flusso10,11. Il rapporto tra le emissioni acide e neutre della lunghezza d'onda mt-Keima (il rapporto tra l'eccitazione acida di 561 nm e quella neutra di 480 nm) può essere utilizzato per quantificare in modo robusto la mitofagia 6,12.
Questo protocollo descrive un approccio ottimizzato per valutare il flusso mitofagico nelle isole primarie e nelle cellule β isolate da topi transgenici mt-Keima 10,11. Sebbene mt-Keima sia una sonda altamente sensibile, richiede complicati schemi di allevamento animale o la trasfezione di cellule, che spesso possono essere difficili quando si lavora in combinazione con altri modelli genetici o con isole umane primarie. Inoltre, l'uso di laser e rivelatori a fluorescenza multipli per identificare popolazioni cellulari neutre e acide può limitare l'uso combinatorio di altri reporter fluorescenti.
Per superare queste sfide, questo protocollo descrive anche un metodo complementare, a canale fluorescente singolo, basato su coloranti per il rilevamento robusto della mitofagia in cellule β da isole di topo isolate. Questo approccio, denominato metodo MtPhagy, utilizza una combinazione di tre coloranti permeabili alle cellule per selezionare le cellule β, quantificare le popolazioni cellulari attivamente sottoposte a mitofagia e valutare contemporaneamente il potenziale di membrana mitocondriale (MMP o Δψm).
Il primo di questi coloranti è la Fluozin-3-AM, un indicatore Zn2+ permeabile alle cellule con un Ex/Em 494/516 nm13. Le isole di topo comprendono una popolazione eterogenea di cellule funzionalmente distinte, tra cui cellule α, β, δ e PP. Le cellule β comprendono circa l'80% delle cellule all'interno dell'isolotto di topo e possono essere distinte da altri tipi di cellule insulari a causa della loro elevata concentrazione di Zn2+ all'interno dei granuli di insulina14,15, consentendo l'identificazione delle cellule β come la popolazionead alto contenuto di Fluozin-3-AM. Il colorante MtPhagy, un colorante sensibile al pH che è immobilizzato sui mitocondri tramite un legame chimico ed emette una debole fluorescenza, è utilizzato anche in questo protocollo16. Dopo l'induzione della mitofagia, i mitocondri danneggiati vengono incorporati nel lisosoma acido e il colorante MtPhagy aumenta la sua intensità di fluorescenza all'interno dell'ambiente a basso pH (Ex/Em 561/570-700 nm).
Inoltre, la tetrametilrodamina, estere etilico (TMRE), viene utilizzata per valutare la MMP. TMRE è un colorante permeabile alle cellule carica positiva (Ex/Em 552/575 nm) che viene sequestrato dai mitocondri sani a causa della relativa carica negativa sostenuta dal loro potenziale di membrana17. I mitocondri danneggiati o malsani dissipano il loro potenziale di membrana, con conseguente diminuzione della capacità di sequestrare la TMRE. Utilizzando questi coloranti insieme, le cellule β sottoposte a mitofagia possono essere identificate comela bassa popolazione di Fluozinad altaMtPhagyad altoTMRE tramite citometria a flusso. Poiché la mitofagia è un processo dinamico piuttosto che statico, questo protocollo è stato ottimizzato per valutare il flusso mitofagico utilizzando valinomicina, uno ionoforo K+ che induce la mitofagia dopo la dissipazione di MMP18. Il confronto della mitofagia in presenza e assenza di valinomicina consente di valutare il flusso mitofagico in diversi gruppi di campioni.
La natura basata sul colorante dell'attuale approccio consente di estrapolarlo alle isole umane e ad altri tipi di cellule difficili da trasfettare e aggira la necessità di complicati schemi di allevamento degli animali, a differenza del protocollo mt-Keima. L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di quantificare la mitofagia nelle cellule β a livello di singola cellula attraverso due metodi indipendenti basati sulla citometria a flusso. Nel loro insieme, questo protocollo descrive due metodi potenti e complementari che consentono sia precisione che flessibilità nello studio quantitativo del controllo di qualità mitocondriale.
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Protocol
Gli studi sugli animali presentati in questo protocollo sono stati esaminati e approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università del Michigan. Per questo studio sono stati utilizzati topi maschi C57BL/6J di 20 settimane, con una dieta grassa regolare (RFD) di 15 settimane o una dieta ricca di grassi (HFD).
1. Valutazione della mitofagia tramite l'approccio MtPhagy basato su coloranti (Metodo 1)
- Preparazione e trattamento delle isole di topo
- Eseguire la coltura delle isole e l'esposizione alla valinomicina seguendo i passaggi seguenti.
- Isolare le isole da topi con dieta grassa normale (RFD) o dieta ricca di grassi (HFD, 60 kcal% di grassi19), seguendo i metodidescritti in precedenza 2,10.
- Campioni di isole di coltura per una notte a 37 °C in terreno RPMI integrato con 100 unità/mL di antibiotico antimicotico, 50 unità/mL di penicillina-streptomicina, 1 mM di piruvato di sodio, 10 mM di HEPES e 10% di siero fetale bovino (FBS) (vedere Tabella dei materiali). Questo mezzo sarà indicato come "mezzo isolotto".
- Utilizzando una pipetta, prelevare 100 isole per condizione in piastre di Petri da 6 cm in 2 mL di terreno insulare.
NOTA: Condizioni utilizzate per questo protocollo: (1) Controllo non colorato: isolotti RFD non colorati; (2) Controllo solo DAPI: isolotti RFD colorati con DAPI; (3) Controllo solo Fluozin-3-AM: isolotti RFD colorati con Fluozin-3-AM; (4) Controllo solo MtPhagy: isolotti RFD colorati con MtPhagy; (5) Controllo solo TMRE: isolotti RFD colorati con TMRE; (6) RFD non trattata: isole RFD colorate con MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM e DAPI; (7) Isole RFD esposte alla valinomicina: isole RFD esposte a valinomicina e colorate con MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM e DAPI; (8) HFD non trattata: isole HFD colorate con MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM e DAPI; (9) Isole HFD esposte alla valinomicina: isolotti HFD esposti a valinomicina e colorati con MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM e DAPI. - Per le condizioni (7) e (9) (vedere NOTA sopra) esposte alla valinomicina, aggiungere 2 μL di 250 nΜ di valinomicina (vedere la tabella dei materiali) alle isole nella capsula di Petri per 3 ore per indurre la mitofagia.
- Eseguire la dissociazione di una singola cellula.
- Dopo 3 ore di esposizione alla valinomicina, prelevare 100 isolotti da ciascuna condizione in provette di microcentrifuga separate utilizzando una pipetta.
- Centrifugare le isole a 350 x g per 1 minuto a 10 °C ed eliminare il surnatante con una pipetta.
- Lavare i campioni 2x con 1 mL 1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), con fasi di centrifuga (350 x g/1 min, 10 °C) tra ogni lavaggio. Scartare il surnatante con una pipetta dopo ogni lavaggio.
- Per dissociare le isole in singole cellule, aggiungere 500 μL di tripsina allo 0,05% (preriscaldata a 37 °C) alla provetta per microcentrifuga di un campione per evitare un'eccessiva digestione delle isole. Pipettare ripetutamente su e giù fino a quando le isole non sono visibilmente disperse.
- Aggiungere immediatamente 1 mL di terreno insulare preriscaldato per neutralizzare la tripsina. Ripetere la tripsinizzazione e la neutralizzazione per ogni campione, una alla volta.
- Centrifugare i campioni a 500 x g per 5 minuti a 10 °C. Rimuovere il surnatante con una pipetta, facendo attenzione a non disturbare il pellet.
NOTA: Il pellet sarà delicato per i campioni esposti alla valinomicina. - Lavare i campioni 2 volte con terreno RPMI, senza rosso fenolo, integrato con 100 unità/mL di antibiotico antimicotico, 50 unità/mL di penicillina-streptomicina, 1 mM di piruvato di sodio, 10 mM di HEPES e 10% di albumina sierica bovina (BSA). Questo mezzo sarà indicato come "mezzo di flusso dell'isolotto". Includere le fasi di centrifuga (350 x g/1 min, 10 °C) tra un lavaggio e l'altro. Scartare il surnatante con una pipetta dopo ogni lavaggio.
- Colorare le cellule con MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM e DAPI per prepararsi alla citometria a flusso.
- Risospendere i campioni di isole in 500 μL di mezzo di flusso delle isole.
- Aggiungere 0,25 μL di 100 μM di MtFagy stock (vedere la Tabella dei materiali) alle provette che ricevono il colorante MtPhagy (condizioni 4, 6, 7, 8 e 9, NOTA al punto 1.1.1).
- Aggiungere 0,25 μL di 100 μM di materiale TMRE (vedere la tabella dei materiali) alle provette che ricevono il colorante TMRE (condizioni 5, 6, 7, 8 e 9).
- Aggiungere 0,25 μL di 1 mM di Fluozin-3-AM (vedere la tabella dei materiali) alle provette che ricevono il colorante Fluozin-3-AM (condizioni 3, 6, 7, 8 e 9).
- Tubi a vortice a bassa velocità per 5 s per miscelare.
- Avvolgere le provette per microcentrifuga in un foglio di alluminio per proteggerle dalla luce e incubarle a 37 °C per 30 min. A metà dell'incubazione, tubi a vortice a bassa velocità per 5-10 secondi per mescolarsi.
- Dopo l'incubazione, centrifugare i campioni a 350 x g per 1 minuto a 10 °C. Scartare il surnatante con una pipetta.
- Risospendere i campioni in un mezzo di flusso insulare da 500 μL. Aggiungere 0,2 μg/mL di DAPI (vedere la tabella dei materiali) alle condizioni 2, 6, 7, 8 e 9.
- Centrifugare i campioni a 350 x g per 1 minuto a 10 °C. Scartare il surnatante utilizzando una pipetta e risospendere in 500 μL di fluido di flusso dell'isola.
- Posizionare i campioni sul ghiaccio.
- Eseguire la coltura delle isole e l'esposizione alla valinomicina seguendo i passaggi seguenti.
- Citometria a flusso
- Avviare lo strumento (vedere la tabella dei materiali).
NOTA: Qualsiasi citometro a flusso con i filtri appropriati funzionerà. In questo studio sono stati utilizzati i seguenti filtri: (1) VL1 per DAPI: Eccitazione/Emissione - 405 nm/440 nm (50 nm); (2) BL1 per Fluozin-3-AM: Eccitazione/Emissione - 488 nm/530 nm (30 nm); (3) BL2 per il colorante MtPhagy: Eccitazione/Emissione - 488 nm/590 nm (40 nm); (4) YL1 per TMRE: eccitazione/emissione - 561 nm/585 nm (16 nm). - Regolare le tensioni per la dispersione diretta (FSC) e laterale (SSC) per garantire che le popolazioni di celle siano al centro del grafico a dispersione. Per questo protocollo, le tensioni utilizzate erano 120 V per FSC e 260 V per SSC per garantire che le celle rientrino uniformemente all'interno dell'FSC-A vs. Grafico SSC-A (Figura 1A).
- Per escludere celle non singole, aggiungere un gate rettangolare su FSC-H vs. FSC-W seguito da SSC-H vs. SSC-W (Figura 1B,C).
- Regolare le tensioni e la compensazione per DAPI per filtrare le celle β attive. Impostare i gate di fluorescenza per ciascun fluoroforo utilizzato in base al campione RFD non colorato (Figure 1D-F).
NOTA: Tensioni utilizzate per ciascun canale: (1) VL1: 320-360 V; (2) BL1: 300-340 V; (3) BL2: 260-300 V; (4) YL1: 300-340 V. - Una volta stabiliti i gate, raccogliere 10.000 eventi per campione.
NOTA: Utilizzando questo approccio di gating, i livelli di mitofagia in condizioni basali e dopo l'induzione della valinomicina sono stati valutati sia nelle isole RFD che HFD (Figura 2). - Salvare i dati come file FCS per l'analisi.
- Avviare lo strumento (vedere la tabella dei materiali).
2. Valutazione della mitofagia utilizzando il reporter mt-Keima geneticamente codificato (Metodo 2)
- Preparazione delle isole di topo e dissociazione di singole cellule
- Eseguire la coltura delle isole e l'esposizione alla valinomicina seguendo i passaggi seguenti.
- Isolare le isole pancreatiche da topi wild-type (WT) e mt-Keima/+ (mt-Keima)6. In questo metodo sono stati utilizzati topi maschi di 20 settimane WT o mt-Keima/+ alimentati con RFD.
- Campioni di isolotti di coltura durante la notte a 37 °C nel terreno dell'isolotto.
- Utilizzando una pipetta, prelevare 100 isole per condizione in piastre di Petri da 6 cm con 2 ml di terreno insulare.
NOTA: Condizioni utilizzate per questo protocollo: (1) Controllo non colorato: isolotti WT non colorati; (2) Controllo solo DAPI: isolotti WT colorati con DAPI; (3) Controllo solo Fluozin-3-AM: isolotti WT colorati con Fluozin-3-AM; (4) controllo solo mt-Keima: isolotti mt-Keima/+ non macchiati; (5) Non trattati: isolotti mt-Keima/+ colorati con Fluozin-3-AM e DAPI; (6) Valinomicina: isolotti mt-Keima/+ esposti a valinomicina e colorati con Fluozin-3-AM e DAPI. - Per la condizione (6) con esposizione alla valinomicina, aggiungere 2 μL di 250 nM di valinomicina alle isole nella capsula di Petri per 3 ore per indurre la mitofagia.
- Eseguire la dissociazione unicellulare.
- Eseguire le fasi di dissociazione di una singola cellula, come descritto al punto 1.1.2.
- Colorare le cellule con Fluozin-3-AM e DAPI.
- Risospendere i campioni di isole in 500 μL di mezzo di flusso delle isole.
- Aggiungere 0,25 μL di 1 mM di Fluozin-3-AM alle provette che ricevono il colorante Fluozin-3-AM (condizioni 3, 5 e 6).
- Incubare le cellule a 37 °C e procedere al trattamento con DAPI, come descritto nei passaggi 1.1.3.5-1.3.10.
- Eseguire la coltura delle isole e l'esposizione alla valinomicina seguendo i passaggi seguenti.
- Citometria a flusso
- Avviare lo strumento. Qualsiasi citometro a flusso con i filtri appropriati funzionerà.
NOTA: In questo studio sono stati utilizzati i seguenti filtri: (1) VL1 per DAPI: Eccitazione/Emissione - 405 nm/440 nm (50 nm); (2) BL1 per Fluozin-3-AM: Eccitazione/Emissione - 488 nm/530 nm (30 nm); (3) VL3 per mt-Keima neutro: Eccitazione/Emissione - 405 nm/603 nm (48 nm); (4) YL2 per l'acido mt-Keima: Eccitazione/Emissione - 561 nm/620 nm (15 nm). - Regolare le tensioni FSC e SSC ed escludere le celle non singole come descritto nei passaggi 1.2.2-1.2.3 (Figure 3A-C).
- Regolare le tensioni e la compensazione per DAPI, Fluozin-3-AM e mt-Keima utilizzando controlli non colorati e single-positivi (condizioni 1-4) per garantire che le popolazioni di cellule fluorescenza-positive siano distinguibili dalle cellule non colorate. Una volta applicata la compensazione appropriata a ciascun canale, impostare il gate negativo DAPI e il gate positivo Fluozin-3-AM per filtrare le celle β vive (Figure 3D-E).
- Impostare uno schema di gating triangolare utilizzando il campione positivo mt-Keima (condizione 4) per identificare le popolazioni cellulari acide e neutre (Figura 3F).
NOTA: Tensioni tipicamente utilizzate per ciascun canale: (1) VL1: 320-340 V; (2) BL2: 260-280 V; (3) VL3: 280-300 V; (4) YL2: 280-300 V. - Una volta stabiliti i gate, raccogliere 10.000 eventi per campione. Gli schemi di gating per le condizioni 5 e 6 sono illustrati nella Figura 3A-G.
- Salvare i dati come file FCS per l'analisi.
- Avviare lo strumento. Qualsiasi citometro a flusso con i filtri appropriati funzionerà.
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Representative Results
Valutazione della mitofagia tramite l'approccio MtPhagy basato su coloranti
Questo approccio basato su coloranti è stato ottimizzato per analizzare il flusso mitofagico all'interno delle cellule primarie di β di topo senza la necessità di un reporter genetico, utilizzando Fluozin-3-AM, TMRE e MtPhagy, nonché DAPI per escludere le cellule morte. Accoppiando questi coloranti con valinomicina per indurre la mitofagia, questo protocollo delinea un metodo basato su coloranti per misurare selettivamente il flusso mitofagico nelle cellule β primarie di topo18. Per i dati mostrati utilizzando questo metodo MtPhagy, sia la mitofagia basale che quella indotta da valinomicina sono state analizzate in isolotti isolati da topi alimentati con dieta grassa normale (RFD) o dieta ad alto contenuto di grassi (HFD, 60 kcal% di grassi) per valutare l'effetto dello stress metabolico sul flusso mitofagico. Per identificare la popolazione di interesse, le cellule sono state sottoposte a gating utilizzando isole RFD non trattate. Le tensioni FSC e SSC sono state prima regolate per ottenere una distribuzione uniforme delle celle su un grafico SSC-A rispetto a FSC-A (Figura 1A). Per selezionare le celle singole, sia FSC-H che FSC-H FSC-W e SSC-H a confronto. Sono stati utilizzati grafici SSC-W, in cui i multipletti sono stati esclusi a causa dei loro valori di segnale di larghezza più elevati rispetto alle singole celle (Figura 1B,C). Successivamente, sono state selezionate cellule DAPI-negative per escludere le cellule morte20 (Figura 1D). Dopo aver stabilito i gate primari, sono stati utilizzati controlli colorati singoli per stabilire i gate di fluorescenza per Fluozin-3-AM, MtFagy e TMRE (Figura 1E-G), nonché i controlli di compensazione per la citometria a flusso di fluorescenza multicolore.
Una volta che questi gate primari e di fluorescenza sono stati stabiliti, le cellule β con elevato utilizzo della mitofagia sono state definite come la popolazione Fluozinad altoMtPhagyad altoTMREnel quadrante 3 (Q3) utilizzando RFD senza esposizione a valinomicina (Figura 1H). Utilizzando questa strategia di gating, i livelli di mitofagia basale e indotta da valinomicina sono stati caratterizzati sia nelle isole RFD che HFD (Figura 2). Per quantificare il flusso mitofagico, basale vs. I livelli di mitofagia indotta da valinomicina sono stati confrontati utilizzando il seguente rapporto:
Utilizzando questo rapporto, il flusso mitofagico è stato quantificato e confrontato in RFD vs. HFD β cellule per valutare le differenze nella mitofagia in seguito all'induzione dell'obesità e dell'insulino-resistenza periferica. Quantificazione del flusso mitofagico in RFD vs. I campioni HFD sono mostrati nella Figura 2E. Questo risultato evidenzia la fattibilità di questo test per quantificare la mitofagia nelle cellule β utilizzando un approccio semplice basato sul colorante. Questo metodo può essere impiegato anche in isole umane, cellule difficili da trasfettare e isole isolate da modelli genetici complessi in cui l'incrocio con il modello transgenico mt-Keima sarebbe ingombrante.
Valutazione della mitofagia utilizzando il reporter mt-Keima geneticamente codificato
Mt-Keima è una proteina fluorescente a doppia eccitazione fusa con una sequenza di localizzazione Cox8 che ne consente il targeting alla membrana mitocondriale interna. La proprietà fluorescente bimodale di mt-Keima gli consente di cambiare i suoi spettri di eccitazione dalla lunghezza d'onda neutra (405 nm) a quella acida (561 nm), a seconda del pH del compartimento intracellulare6. Ciò consente una robusta analisi di fluorescenza raziometrica della mitofagia, in cui un aumento del rapporto acido-neutro indica l'induzione della mitofagia. In questo protocollo, la fluozin-3-AM è stata utilizzata anche per selezionare le cellule β tramite citometria a flusso. In questi studi rappresentativi, il flusso mitofagico è stato valutato utilizzando isole isolate da topi alimentati con una dieta RFD10,11. Le tensioni FSC e SSC sono state prima regolate per ottenere una distribuzione uniforme delle celle su un SSC-A vs. Grafico FSC-A (Figura 3A). Per selezionare le celle singole, sia FSC-H che FSC-H FSC-W e SSC-H a confronto. Sono stati utilizzati grafici SSC-W, in cui i multipletti sono stati esclusi a causa dei loro valori di segnale di larghezza più elevati rispetto alle celle singole (Figura 3B,C). La tensione e la strategia di gating per DAPI e Fluozin-3-AM sono state determinate utilizzando isolotti a colorazione singola (Figura 3D,E). I gate triangolari per le popolazioni acide e neutre sono stati quindi identificati utilizzando il campione positivo di mt-Keima senza esposizione alla valinomicina (Figura 3F).
Una volta che queste porte primarie e di fluorescenza sono state stabilite, il flusso mitofagico è stato valutato utilizzando cambiamenti basali e indotti dalla valinomicina nella fluorescenza mt-Keima (Figura 3F,G). Per quantificare il flusso mitofagico, la mitofagia basale vs. I livelli indotti dalla valinomicina sono stati confrontati utilizzando il seguente rapporto:
Utilizzando questo rapporto, il flusso mitofagico è stato quantificato nelle cellule RFD. La quantificazione di questo risultato è mostrata nella Figura 3H. È importante sottolineare che questi risultati sono paragonabili ai risultati delle isole RFD generate utilizzando l'approccio MtPhagy (Figura 3H).
Figura 1: Schema di gating per il metodo MtPhagy. (A) Diagramma di flusso che mostra lo schema di gating da selezionare per tutte le celle. (B) Gating per selezionare i singoletti in base a FSC-H vs. FSC-W e (C) SSC-H vs. SSC-W. (D) Gating per le cellule DAPI-negative per escludere le cellule morte. (E) Gating per celle alte di Fluozin-3-AM per selezionare le celluleβ . (F) Schema di gating per il colorante MtPhagy per identificare le popolazioni cellulariMtPhagy alte eMtPhagy basse . (G) Schema di gating per TMRE per identificare le popolazioni cellulari di TMREalto eTMRE basso . (H) Schema di gating a quadrante stabilito con isole RFD non trattate per identificare le cellule Fluozinad altoMtPhagyad altoTMREnel quadrante 3 (Q3) come cellule β sottoposte a mitofagia. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Valutazione delle differenze di flusso mitofagico nelle cellule β di topo a seguito di stress metabolico utilizzando lo schema di gating MtPhagy. Grafici rappresentativi della citometria a flusso di (A) cellule β RFD non trattate, (B) cellule β HFD non trattate, (C) cellule β RFD esposte alla valinomicina e (D) cellule β HFD esposte alla valinomicina. (E) Quantificazione del flusso mitofagico nelle cellule β, calcolato utilizzando un rapporto trale cellule ad alto TMREespostea valinomicina e le cellule abasso TMREnonesposte a valinomicina, sia per i campioni RFD che per quelli HFD. *p < 0,05 dal test t spaiato di Student. n = 3/gruppo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Schema di gating per il metodo mt-Keima e confronto tra i due metodi. (A) Diagramma di flusso che mostra lo schema di gating da selezionare per tutte le celle. (B) Gating per selezionare i singoletti in base a FSC-H vs. FSC-W e (C) SSC-H vs. SSC-W. (D) Gating per le cellule DAPI-negative per escludere le cellule morte. (E) Gating per celle alte di Fluozin-3-AM per selezionare le celluleβ . (F) Grafici rappresentativi di citometria a flusso di cellule mt-Keima/+ non trattate e (G) cellule esposte a mt-Keima/+ valinomicina. (H) Quantificazione del flusso mitofagico in cellule β di topi alimentati con RFD, calcolato utilizzando un rapporto tra le cellule acide/neutre esposte alla valinomicina e il rapporto tra le cellule acide/neutre non esposte alla valinomicina utilizzando il metodo mt-Keima e confrontato con il metodo MtPhagy (dati per il protocollo MtPhagy originariamente mostrati nella Figura 2E). n = 3/gruppo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo protocollo ha descritto due metodi complementari per quantificare il flusso mitofagico nelle isole primarie di topo dissociate. Utilizzando il metodo mt-Keima, un aumento della mitofagia è stato quantificato come un aumento del rapporto tra cellule acide (561 nm) / neutre (405 nm), mentre nel metodo MtPhagi, l'aumento del flusso mitofagico è stato quantificato come un aumento della popolazione cellulare Fluozinad altoMtPhagyad altoTMREbasso . Questi metodi consentono valutazioni rapide, quantitative e specifiche per β cellula del flusso mitofagico.
Entrambi i metodi sono approcci semplici. Tuttavia, alcuni passaggi all'interno di questo protocollo sono cruciali per ottenere risultati di qualità e riproducibili. Questi passaggi includono: (1) una corretta dissociazione delle isole per ottenere una sospensione a singola cellula, ma abbastanza lieve da garantire la vitalità delle isole, (2) un'attenta definizione del gating per identificare correttamente le popolazioni di interesse e (3) la quantificazione oggettiva dei dati di citometria a flusso tramite strumenti software per garantire una valutazione imparziale del flusso mitofagico.
Quando si sceglie il metodo da utilizzare, è necessario considerare il tipo di cellula e la natura dei modelli genetici utilizzati. Il metodo mt-Keima, utilizzato in vivo o trasfettato in vitro, è un metodo molto citato e apprezzato per la valutazione della mitofagia mediante citometria a flusso o imaging di cellule vive21. Sebbene il metodo MtPhagy basato su coloranti sia un approccio più recente rispetto ai reporter genetici, ci sono casi in cui il suo uso può essere preferito rispetto a mt-Keima. Infatti, il metodo MtPhagy supera la necessità di trasfezione o schemi di allevamento complessi e la colorazione MtPhagy richiede solo 30 minuti e viene eseguita immediatamente prima della citometria a flusso. L'approccio MtPhagy può essere impiegato con successo anche in campioni di isole umane primarie difficili da trasfettare. Questo protocollo, che si basa su coloranti mitocondriali sensibili al pH o sonde per misurare direttamente la mitofagia, è distinto da un precedente approccio di Mauro-Lizcano et. che impiegava il colorante MitoTracker Deep Red sensibile al potenziale di membrana e richiedeva l'uso di mitofagia e inibitori lisosomiali per quantificare il flusso mitofagico mediante citometria a flusso22. Come il Mauro-Lizcano et. Questo metodo non è stato testato negli isolotti, è difficile confrontarlo direttamente con l'efficacia dei metodi MtPhagy o mt-Keima qui descritti. Nel loro insieme, la combinazione di questi metodi fornisce nel complesso un numero crescente di opzioni per valutare rigorosamente il flusso mitofagico in saggi altamente quantitativi su singole cellule vive.
Uno svantaggio di entrambi i metodi è la loro incompatibilità con la fissazione cellulare. Sebbene entrambi i metodi siano compatibili con gli approcci di imaging di cellule vive, la fissazione cellulare interferisce con il gradiente di pH sia di MtPhagy che di mt-Keima attraverso la membrana lisosomiale 7,16. In alternativa, è stato precedentemente utilizzato l'uso del reporter mitofagico mitoQC in campioni fissi7. Inoltre, una limitazione per entrambi i metodi è la necessità di dissociare le isole prima della citometria a flusso, che può influire sulla vitalità cellulare. Pertanto, è fondamentale colorare le cellule con DAPI per monitorare la vitalità cellulare dopo la dissociazione delle isole e garantire che tutti i campioni siano trattati in modo coerente. Dopo la colorazione DAPI, i campioni avevano una media del 12,7% ± 7,4 cellule morte (Figura 1D), indicando che il >80% delle cellule in ciascun campione poteva essere utilizzato per l'analisi. Il monitoraggio della vitalità cellulare in ogni fase (dopo l'isolamento delle isole, la coltura e quindi la dissociazione) può essere utile per ottenere conoscenze sulla sopravvivenza cellulare in ogni fase della procedura. Anche la variabilità dei tempi tra l'isolamento delle isole e la dissociazione delle singole cellule può influenzare la vitalità cellulare e i risultati. Pertanto, si consiglia di rimanere coerenti con la tempistica in tutti gli esperimenti.
Poiché il controllo della qualità mitocondriale è fondamentale per la salute e la funzione delle cellule β, valutazioni rigorose della mitofagia utilizzando approcci biochimici o di imaging tradizionali (tra cui il turnover delle proteine della membrana esterna mitocondriale, la localizzazione mitocondriale in autofagosomi o lisosomi e la microscopia elettronica) possono rivelarsi impegnative e richiedere molto tempo. Pertanto, lo sviluppo di sistemi reporter di mitofagia efficaci e robusti è fondamentale. Sia l'approccio mt-Keima che quello MtPhagy sono efficienti e consentono valutazioni quantitative del flusso mitofagico. Queste due tecniche consentono flessibilità e precisione nell'affrontare il controllo di qualità mitocondriale delle cellule β e nel sondare le interazioni inter-organello.
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Disclosures
SAS ha ricevuto sovvenzioni da Ono Pharmaceutical Co., Ltd. ed è consulente per Novo Nordisk.
Acknowledgments
E.L-D. riconosce il sostegno del NIH (T32-AI007413 e T32-AG000114). SAS riconosce il sostegno della JDRF (COE-2019-861), del NIH (R01 DK135268, R01 DK108921, R01 DK135032, R01 DK136547, U01 DK127747), del Dipartimento degli affari dei veterani (I01 BX004444), della famiglia Brehm e della famiglia Anthony.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibiotic-Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| Attune NxT Flow Cytometer | Thermofisher Scientific | A24858 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | 317275 | |
| Fatty Acid Free heat shock BSA powder | Equitech | BAH66 | |
| Fetal bovine serum | Gemini Bio | 900-108 | |
| Fluozin-3AM | Thermofisher Scientific | F24195 | 100 μg Fluozin-3AM powder reconstituted in 51 μL DMSO and 51 μL Pluronic F-127 to reach 1 mM stock. |
| Gibco RPMI 1640 Medium | Fisher Scientific | 11-875-093 | |
| HEPES (1M) | Life Technologies | 15630-080 | |
| MtPhagy dye | Dojindo | MT02-10 | 5 μg MtPhagy powder reconstituted with 50 μL DMSO to reach 100 μM stock. |
| MtPhagy dye | Dojindo | MT02-10 | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | Life Technologies | 15140-122 | 1x Solution used in procotol by diluting 1:10 in ddH2O |
| Phosphate buffered saline, 10x | Fisher Scientific | BP399-20 | 1x Solution used in procotol by diluting 1:10 in ddH2O |
| Sodium Pyruvate (100x) | Life Technologies | 11360-070 | 5 μg MtPhagy powder reconstituted with 50 μL DMSO to reach 100 μM stock. |
| TMRE [Tetramethylrhodamine, ethyl ester, perchlorate] | Anaspec | AS-88061 | TMRE powder reconstituted in DMSO to reach 100 μM stock. |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermofisher Scientific | 25300054 | |
| Valinomycin | Sigma | V0627 | Valinomycin powder reconsituted in DMSO to reach 250 nM stock. |
References
- Kaufman, B. A., Li, C., Soleimanpour, S. A. Mitochondrial regulation of β-cell function: maintaining the momentum for insulin release. Molecular Aspects of Medicine. 42, 91-104 (2015).
- Soleimanpour, S. A., et al. The diabetes susceptibility gene Clec16a regulates mitophagy. Cell. 157 (7), 1577-1590 (2014).
- Pearson, G., et al. Clec16a, Nrdp1, and USP8 form a ubiquitin-dependent tripartite complex that regulates β-cell mitophagy. Diabetes. 67 (2), 265-277 (2018).
- Hattori, N., Saiki, S., Imai, Y.
- Berezhnov, A. V., et al. Intracellular pH modulates autophagy and mitophagy. Journal of Biological Chemistry. 291 (16), 8701-8708 (2016).
- Sun, N., et al.
- McWilliams, T. G., et al. mito-QC illuminates mitophagy and mitochondrial architecture in vivo. Journal of Cell Biology. 214 (3), 333-345 (2016).
- Aoyagi, K., et al. A new beta cell-specific mitophagy reporter mouse shows that metabolic stress leads to accumulation of dysfunctional mitochondria despite increased mitophagy. Diabetologia. 66 (1), 147-162 (2023).
- Ma, X., Ding, W. X. A fluorescence imaging based-assay to monitor mitophagy in cultured hepatocytes and mouse liver. Liver Research. 5 (1), 16-20 (2021).
- Sidarala, V., et al. Mitophagy protects β cells from inflammatory damage in diabetes. JCI Insight. 5 (24), 141138 (2020).
- Gingerich, M. A., et al. An intrinsically disordered protein region encoded by the human disease gene CLEC16A regulates mitophagy. Autophagy. 19 (2), 525-543 (2023).
- Sun, N., Malide, D., Liu, J., Rovira, I. I., Combs, C. A., Finkel, T. A fluorescence-based imaging method to measure in vitro and in vivo mitophagy using mt-Keima. Nature Protocols. 12 (8), 1576-1587 (2017).
- Zhao, J., Bertoglio, B. A., Gee, K. R., Kay, A. R. The zinc indicator FluoZin-3 is not perturbed significantly by physiological levels of calcium or magnesium. Cell Calcium. 44 (4), 422-426 (2008).
- Da Silva Xavier, G.
- Thapa, B., et al. Imaging β-cell function using a zinc-responsive MRI contrast agent may identify first responder islets. Frontiers in Endocrinology. 12, 809867 (2022).
- Iwashita, H., et al. Live cell imaging of mitochondrial autophagy with a novel fluorescent small molecule. ACS Chemical Biology. 12 (10), 2546-2551 (2017).
- Crowley, L. C., Christensen, M. E., Waterhouse, N. J. Measuring mitochondrial transmembrane potential by TMRE staining. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (12), 087361 (2016).
- Klein, B., Wörndl, K., Lütz-Meindl, U., Kerschbaum, H. H. Perturbation of intracellular K(+) homeostasis with valinomycin promotes cell death by mitochondrial swelling and autophagic processes. Apoptosis. 16 (11), 1101-1117 (2011).
- Ji, Y., et al. Toll-like receptors TLR2 and TLR4 block the replication of pancreatic β cells in diet-induced obesity. Nature Immunology. 20 (6), 677-686 (2019).
- Sauvat, A., et al. Quantification of cellular viability by automated microscopy and flow cytometry. Oncotarget. 6 (11), 9467-9475 (2015).
- Liu, Y. T., et al. Mt-Keima detects PINK1-PRKN mitophagy in vivo with greater sensitivity than mito-QC. Autophagy. 17 (11), 3753-3762 (2021).
- Mauro-Lizcano, M., et al. New method to assess mitophagy flux by flow cytometry. Autophagy. 11 (5), 833-843 (2015).
