Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Abordagens Complementares para Interrogar o Fluxo de Mitofagia em Células β Pancreáticas

Published: September 15, 2023 doi: 10.3791/65789
Automatic Translation
1,2, 1, 1,3,4
1Department of Internal Medicine, Division of Metabolism, Endocrinology and Diabetes, University of Michigan, Ann Arbor, 2Graduate Program in Immunology, University of Michigan Medical School, 3Department of Molecular and Integrative Physiology, University of Michigan, Ann Arbor, 4VA Ann Arbor Healthcare System

Summary

Este protocolo descreve dois métodos para a análise quantitativa da mitofagia em células β pancreáticas: primeiro, uma combinação de corantes específicos para mitocôndrias permeáveis a células e, segundo, um repórter de mitofagia codificado geneticamente. Essas duas técnicas são complementares e podem ser empregadas com base em necessidades específicas, permitindo flexibilidade e precisão na abordagem quantitativa do controle de qualidade mitocondrial.

Abstract

A mitofagia é um mecanismo de controle de qualidade necessário para manter a função mitocondrial ideal. A mitofagia disfuncional de células β resulta em liberação insuficiente de insulina. Avaliações quantitativas avançadas de mitofagia geralmente requerem o uso de repórteres genéticos. O modelo de camundongo mt-Keima, que expressa uma sonda de dupla excitação sensível ao pH para quantificar a mitofagia via citometria de fluxo, foi otimizado em células β. A razão entre as emissões de comprimento de onda mt-Keima ácido-neutro pode ser usada para quantificar robustamente a mitofagia. No entanto, o uso de mitofagia genética pode ser um desafio ao trabalhar com modelos genéticos complexos de camundongos ou células difíceis de transfectar, como ilhotas humanas primárias. Este protocolo descreve um novo método complementar baseado em corantes para quantificar a mitofagia de células β em ilhotas primárias usando MtPhagy. A MtPhagy é um corante celular sensível ao pH que se acumula nas mitocôndrias e aumenta sua intensidade de fluorescência quando as mitocôndrias estão em ambientes de pH baixo, como os lisossomos durante a mitofagia. Combinando o corante MtPhagy com Fluozin-3-AM, um indicador de Zn2+ que seleciona para células β, e Tetrametilrodamina, éster etílico (TMRE) para avaliar o potencial de membrana mitocondrial, o fluxo de mitofagia pode ser quantificado especificamente em células β via citometria de fluxo. Essas duas abordagens são altamente complementares, permitindo flexibilidade e precisão na avaliação do controle de qualidade mitocondrial em inúmeros modelos de células β.

Introduction

As células β pancreáticas produzem e secretam insulina para atender às demandas metabólicas, e a disfunção das células β é responsável pela hiperglicemia e pelo aparecimento de diabetes tanto no diabetes tipo 1 quanto no tipo 2. As células β acoplam o metabolismo da glicose à secreção de insulina via produção energética e metabólica mitocondrial, que dependem de uma reserva de massa mitocondrial funcional 1,2,3. Para manter a função ótima das células β, as células β dependem de mecanismos de controle de qualidade mitocondrial para remover mitocôndrias envelhecidas ou danificadas e preservar a massa mitocondrial funcional4. A autofagia mitocondrial seletiva, também conhecida como mitofagia, é um componente-chave da via de controle de qualidade mitocondrial.

Avaliações de mitofagia em células vivas geralmente dependem de mudanças no pH mitocondrial que ocorrem durante a mitofagia. As mitocôndrias têm um pH ligeiramente alcalino, e as mitocôndrias saudáveis normalmente residem no citosol neutro em pH. Durante a mitofagia, mitocôndrias danificadas ou disfuncionais são seletivamente incorporadas aos autofagossomos e, eventualmente, eliminadas dentro dos lisossomos ácidos5. Vários modelos de mitofagia transgênica in vivo em camundongos, como mt-Keima6, mitoQC7 e CMMR8, bem como sondas transfectáveis de mitofagia, como o plasmídeo Cox8-EGFP-mCherry9, utilizam essa mudança de pH para fornecer avaliações quantitativas da mitofagia. O uso de camundongos transgênicos expressando a sonda de dupla excitação mt-Keima-sensível ao pH foi otimizado para avaliações de mitofagia em ilhotas e células β por citometria de fluxo10,11. A razão entre as emissões ácidas/neutras do comprimento de onda mt-Keima (a razão entre a excitação ácida de 561 nm e a excitação neutra de 480 nm) pode ser usada para quantificar robustamente a mitofagia 6,12.

Este protocolo descreve uma abordagem otimizada para avaliar o fluxo de mitofagia em ilhotas primárias e células β isoladas de camundongos transgênicos mt-Keima10,11. Embora a mt-Keima seja uma sonda altamente sensível, ela requer esquemas complicados de melhoramento animal ou a transfecção de células, o que muitas vezes pode ser desafiador quando se trabalha em combinação com outros modelos genéticos ou com ilhotas humanas primárias. Além disso, o uso de múltiplos lasers e detectores de fluorescência para identificar populações de células neutras e ácidas pode limitar o uso combinatório de outros repórteres fluorescentes.

Para superar esses desafios, este protocolo também descreve um método complementar, de canal único fluorescente, baseado em corantes para detecção robusta de mitofagia em células-β de ilhotas isoladas de camundongos. Esta abordagem, conhecida como método MtPhagy, utiliza uma combinação de três corantes permeáveis a células para selecionar células β, quantificar as populações celulares ativamente submetidas à mitofagia e avaliar o potencial de membrana mitocondrial (MMP ou Δψm) simultaneamente.

O primeiro desses corantes é o Fluozin-3-AM, um indicador Zn2+ permeável a células com um Ex/Em 494/516 nm13. As ilhotas de camundongos compreendem uma população heterogênea de células funcionalmente distintas, incluindo células α, β, δ e PP. As células-β compreendem aproximadamente 80% das células dentro da ilhota de camundongo e podem ser distinguidas de outros tipos de ilhotas devido à sua alta concentração de Zn2+ dentro dos grânulos de insulina14,15, permitindo a identificação de células-β comoa alta população de Fluozina-3-AM. O corante MtPhagy, um corante sensível ao pH que é imobilizado na mitocôndria através de uma ligação química e emite fluorescência fraca, também é utilizado neste protocolo16. Após a indução da mitofagia, as mitocôndrias danificadas são incorporadas ao lisossomo ácido, e o corante MtPhagy aumenta sua intensidade de fluorescência dentro do ambiente de pH baixo (Ex/Em 561/570-700 nm).

Além disso, a tetrametilrodamina, éster etílico (TMRE), é usada para avaliar a MMP. TMRE é um corante permeável a células com carga positiva (Ex/Em 552/575 nm) que é sequestrado por mitocôndrias saudáveis devido à carga negativa relativa sustentada por seu potencial de membrana17. Mitocôndrias danificadas ou insalubres dissipam seu potencial de membrana, resultando na diminuição da capacidade de sequestrar TMRE. Utilizando esses corantes em conjunto, as células β submetidas à mitofagia podem ser identificadas como a população baixa de MtPhagyaltaFluozin MtPhagyatravésda citometria de fluxo. Como a mitofagia é um processo dinâmico e não estático, este protocolo foi otimizado para avaliar o fluxo mitofágico usando valinomicina, um ionóforo K+ que induz mitofagia após dissipação de MMP18. A comparação da mitofagia na presença e ausência de valinomicina permite avaliar o fluxo de mitofagia em diferentes grupos amostrais.

A natureza baseada em corantes da abordagem atual permite que ela seja extrapolada para ilhotas humanas e outros tipos de células difíceis de transfectar e contorna a necessidade de esquemas complicados de criação de animais, ao contrário do protocolo mt-Keima. O objetivo geral deste protocolo é quantificar a mitofagia em células β em nível de célula única através de dois métodos independentes baseados em citometria de fluxo. Em conjunto, este protocolo descreve dois métodos poderosos e complementares que permitem precisão e flexibilidade no estudo quantitativo do controle de qualidade mitocondrial.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Os estudos em animais apresentados neste protocolo foram revisados e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Michigan. Camundongos C57BL/6J machos de vinte semanas de idade, com dieta regular de gordura (RFD) ou dieta hiperlipídica (HFD), foram usados para este estudo.

1. Avaliação da mitofagia através da abordagem MtPhagy baseada em corantes (Método 1)

  1. Preparação e tratamento de ilhotas de camundongos
    1. Realizar cultura de ilhotas e exposição à valinomicina seguindo os passos abaixo.
      1. Isolar ilhotas de camundongos com dieta com gordura regular (RFD) ou dieta hiperlipídica (DHH, 60 kcal% de gordura19), seguindo os métodos descritos anteriormente 2,10.
      2. Amostras de ilhotas cultivadas durante a noite a 37 °C em meio RPMI suplementado com 100 unidades/mL de antibiótico-antimicótico, 50 unidades/mL de penicilina-estreptomicina, 1 mM de piruvato de sódio, 10 mM de HEPES e 10% de soro fetal bovino (SFB) (ver Tabela de Materiais). Este meio será referido como "meio ilhota".
      3. Usando uma pipeta, escolha 100 ilhotas por condição em placas de Petri de 6 cm em 2 mL de meio de ilhotas.
        NOTA: Condições utilizadas para este protocolo: (1) Controle sem manchas: ilhotas RFD sem manchas; (2) Controle somente DAPI: ilhotas RFD coradas com DAPI; (3) Controle somente com fluozina-3-AM: ilhotas RFD coradas com fluozina-3-AM; (4) Controle somente MtPhagy: ilhotas RFD coradas com MtPhagy; (5) Controle somente TMRE: ilhotas RFD coradas com TMRE; (6) RFD não tratada: ilhotas RFD coradas com MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM e DAPI; (7) Ilhotas RFD expostas à valinomicina: ilhotas RFD expostas à valinomicina e coradas com MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM e DAPI; (8) DHL não tratada: ilhotas de DH coradas com MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM e DAPI; (9) Ilhotas HFD expostas à valinomicina: ilhotas HFD expostas à valinomicina e coradas com MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM e DAPI.
      4. Para as condições (7) e (9) (ver NOTA acima) expostas à valinomicina, adicionar 2 μL de 250 nΜ de estoque de valinomicina (ver Tabela de Materiais) às ilhotas na placa de Petri por 3 h para induzir mitofagia.
    2. Realizar dissociação de célula única.
      1. Após 3 h de exposição à valinomicina, escolha 100 ilhotas de cada condição em tubos de microcentrífuga separados usando uma pipeta.
      2. Gire ilhotas a 350 x g durante 1 min a 10 °C e elimine o sobrenadante utilizando uma pipeta.
      3. Lavar as amostras 2x com 1 mL 1x de solução salina tamponada com fosfato (PBS), com passos de rotação (350 x g/1 min, 10 °C) entre cada lavagem. Descarte o sobrenadante com uma pipeta após cada lavagem.
      4. Para dissociar ilhotas em células únicas, adicione 500 μL de tripsina a 0,05% (pré-aquecida a 37 °C) ao tubo de microcentrífuga de uma amostra para evitar a digestão excessiva das ilhotas. Pipetar para cima e para baixo repetidamente até que as ilhotas estejam visivelmente dispersas.
      5. Adicionar imediatamente 1 mL de meio de ilhota pré-aquecido para neutralizar a tripsina. Repita a tripsinização e a neutralização para cada amostra, uma de cada vez.
      6. Amostras de spin a 500 x g durante 5 min a 10 °C. Retire o sobrenadante com uma pipeta, com cuidado para não atrapalhar o pellet.
        OBS: O pellet será delicado para amostras expostas à valinomicina.
      7. Lavar as amostras 2x com meio RPMI, sem vermelho fenol, suplementado com 100 unidades/mL de antibiótico-micótico, 50 unidades/mL de penicilina-estreptomicina, 1 mM de piruvato de sódio, 10 mM de HEPES e 10% de albumina de soro bovino (BSA). Este meio será referido como "meio de fluxo de ilhotas". Inclua passos de rotação (350 x g/1 min, 10 °C) entre cada lavagem. Descarte o sobrenadante com uma pipeta após cada lavagem.
    3. Células corantes com MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM e DAPI para se preparar para citometria de fluxo.
      1. Ressuspender amostras de ilhotas em 500 μL de meio de fluxo de ilhotas.
      2. Adicionar 0,25 μL de 100 μM de MtPhagy stock (ver Tabela de Materiais) aos tubos que recebem corante MtPhagy (condições 4, 6, 7, 8 e 9, NOTA para o passo 1.1.1).
      3. Adicionar 0,25 μL de estoque TMRE de 100 μM (ver Tabela de Materiais) aos tubos que recebem corante TMRE (condições 5, 6, 7, 8 e 9).
      4. Adicionar 0,25 μL de estoque de Fluozin-3-AM 1 mM (consulte Tabela de Materiais) aos tubos que recebem corante Fluozin-3-AM (condições 3, 6, 7, 8 e 9).
      5. Tubos de vórtice em baixa velocidade por 5 s para misturar.
      6. Embrulhe os tubos de microcentrífuga em papel alumínio para proteger da luz e incube a 37 °C por 30 min. No meio da incubação, tubos de vórtice em baixa velocidade para 5-10 s para misturar.
      7. Após a incubação, centrifugar as amostras a 350 x g durante 1 min a 10 °C. Descarte o sobrenadante usando uma pipeta.
      8. Ressuspender amostras em meio de fluxo de ilhotas de 500 μL. Adicionar 0,2 μg/mL DAPI (ver Tabela de Materiais) às condições 2, 6, 7, 8 e 9.
      9. Amostras de spin a 350 x g durante 1 min a 10 °C. Eliminar o sobrenadante utilizando uma pipeta e ressuspender em 500 μL de meio de fluxo das ilhotas.
      10. Coloque amostras no gelo.
  2. Citometria de fluxo
    1. Inicie o instrumento (consulte Tabela de Materiais).
      NOTA: Qualquer citômetro de fluxo com os filtros apropriados funcionará. Os seguintes filtros foram utilizados neste estudo: (1) VL1 para DAPI: Excitação/Emissão - 405 nm/440 nm (50 nm); (2) BL1 para Fluozin-3-AM: Excitação/Emissão - 488 nm/530 nm (30 nm); (3) BL2 para corante MtPhagy: Excitação/Emissão - 488 nm/590 nm (40 nm); (4) YL1 para TMRE: Excitação/Emissão - 561 nm/585 nm (16 nm).
    2. Ajuste as tensões para frente (FSC) e dispersão lateral (SSC) para garantir que as populações de células estejam no centro do gráfico de dispersão. Para este protocolo, as tensões utilizadas foram 120 V para FSC e 260 V para SSC para garantir que as células caíssem uniformemente dentro do FSC-A vs. Gráfico SSC-A (Figura 1A).
    3. Para excluir células não únicas, adicione uma porta retangular em FSC-H vs. FSC-W seguido por SSC-H vs. SSC-W (Figura 1B,C).
    4. Ajuste as tensões e a compensação para DAPI para filtrar células β vivas. Ajuste as comportas de fluorescência para cada fluoróforo utilizado com base na amostra de RFD não corada (Figuras 1D-F).
      NOTA: Tensões utilizadas para cada canal: (1) VL1: 320-360 V; (2) BL1: 300-340 V; (3) BL2: 260-300 V; (4) YL1: 300-340 V.
    5. Uma vez que os portões são estabelecidos, colete 10.000 eventos por amostra.
      NOTA: Utilizando esta abordagem de gating, os níveis de mitofagia em condições basais e na indução de valinomicina foram avaliados em ilhotas RFD e HFD (Figura 2).
    6. Salve os dados como arquivos FCS para análise.

2. Avaliação da mitofagia utilizando o repórter mt-Keima codificado geneticamente (Método 2)

  1. Preparação de ilhotas de camundongo e dissociação unicelular
    1. Realizar cultura de ilhotas e exposição à valinomicina seguindo os passos abaixo.
      1. Isolar ilhotas pancreáticas de camundongos selvagens (WT) e mt-Keima/+ (mt-Keima)6. Neste método, foram utilizados camundongos machos WT ou mt-Keima/+ com 20 semanas de idade alimentados com RFD.
      2. Amostras de ilhotas de cultura durante a noite a 37 °C em meio de ilhotas.
      3. Usando uma pipeta, escolha 100 ilhotas por condição em placas de Petri de 6 cm com 2 mL de meio de ilhotas.
        NOTA: Condições utilizadas para este protocolo: (1) Controle sem manchas: ilhotas WT sem manchas; (2) Controle somente DAPI: ilhotas WT coradas com DAPI; (3) Controle somente com fluozina-3-AM: ilhotas WT coradas com Fluozin-3-AM; (4) mt-Keima apenas controle: ilhotas mt-Keima/+ não manchadas; (5) Não tratadas: ilhéus mt-Keima/+ coradas com Fluozin-3-AM e DAPI; (6) Valinomicina: ilhotas mt-Keima/+ expostas à valinomicina e coradas com Fluozin-3-AM e DAPI.
      4. Para a condição (6) com exposição à valinomicina, adicionar 2 μL de estoque de valinomicina 250 nM às ilhotas em placa de Petri por 3 h para induzir mitofagia.
    2. Realizar dissociação de célula única.
      1. Execute etapas de dissociação de célula única, conforme descrito na etapa 1.1.2.
    3. Células corantes com Fluozin-3-AM e DAPI.
      1. Ressuspender amostras de ilhotas em 500 μL de meio de fluxo de ilhotas.
      2. Adicionar 0,25 μL de estoque de Fluozin-3-AM 1 mM aos tubos que recebem corante Fluozin-3-AM (condições 3, 5 e 6).
      3. Incubar as células a 37 °C e proceder ao tratamento com DAPI, conforme descrito nos passos 1.1.3.5-1.3.10.
  2. Citometria de fluxo
    1. Inicie o instrumento. Qualquer citômetro de fluxo com os filtros apropriados funcionará.
      OBS: Foram utilizados os seguintes filtros: (1) VL1 para DAPI: Excitação/Emissão - 405 nm/440 nm (50 nm); (2) BL1 para Fluozin-3-AM: Excitação/Emissão - 488 nm/530 nm (30 nm); (3) VL3 para mt-Keima neutro: Excitação/Emissão - 405 nm/603 nm (48 nm); (4) YL2 para o ácido mt-Keima: Excitação/Emissão - 561 nm/620 nm (15 nm).
    2. Ajuste as tensões FSC e SSC e exclua células não individuais, conforme descrito nas etapas 1.2.2-1.2.3 (Figuras 3A-C).
    3. Ajuste as tensões e compensações para DAPI, Fluozin-3-AM e mt-Keima usando controles não corados e single-positive (condições 1-4) para garantir que as populações de células positivas para fluorescência sejam distinguíveis das células não coradas. Uma vez que a compensação apropriada tenha sido aplicada a cada canal, configure a porta negativa DAPI e as portas positivas Fluozin-3-AM para filtrar as células β vivas (Figuras 3D-E).
    4. Estabelecer um esquema de triângulo usando a amostra positiva para mt-Keima (condição 4) para identificar populações de células ácidas e neutras (Figura 3F).
      NOTA: Tensões normalmente utilizadas para cada canal: (1) VL1: 320-340 V; (2) BL2: 260-280 V; (3) VL3: 280-300 V; (4) YL2: 280-300 V.
    5. Uma vez que os portões são estabelecidos, colete 10.000 eventos por amostra. Os esquemas de vedação para as condições 5 e 6 são ilustrados na Figura 3A-G.
    6. Salve os dados como arquivos FCS para análise.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Avaliação da mitofagia através da abordagem MtPhagy baseada em corantes
Esta abordagem baseada em corante foi otimizada para analisar o fluxo de mitofagia dentro de células primárias de β de camundongos sem a necessidade de um repórter genético, usando Fluozin-3-AM, TMRE e MtPhagy, bem como DAPI para excluir células mortas. Ao emparelhar esses corantes com valinomicina para induzir mitofagia, este protocolo delineia um método baseado em corantes para medir seletivamente o fluxo de mitofagia em células-β primárias de camundongos18. Para os dados mostrados usando este método de MtPhagy, tanto a mitofagia basal quanto a induzida por valinomicina foram analisadas em ilhotas isoladas de dieta com gordura regular (RFD) ou dieta hiperlipídica (HFD, 60 kcal% de gordura) alimentadas com camundongos para avaliar o efeito do estresse metabólico sobre o fluxo de mitofagia. Para identificar a população de interesse, as células foram confinadas usando ilhotas RFD não tratadas. As tensões FSC e SSC foram primeiramente ajustadas para obter uma distribuição uniforme de células em um gráfico SSC-A vs. FSC-A (Figura 1A). Para selecionar células únicas, FSC-H vs. FSC-W e SSC-H vs. Foram utilizados gráficos SSC-W, onde os multipletos foram excluídos devido aos seus maiores valores de sinal de largura em comparação com células individuais (Figura 1B,C). Em seguida, células DAPI-negativas foram selecionadas para excluir células mortas20 (Figura 1D). Após o estabelecimento das comportas primárias, controles corados com coloração única foram utilizados para estabelecer comportas de fluorescência para Fluozin-3-AM, MtPhagy e TMRE (Figura 1E-G), bem como controles de compensação para citometria de fluxo de fluorescência multicolorida.

Uma vez estabelecidas essas comportas primárias e de fluorescência, as células β com alta utilização de mitofagia foram definidas comoa população baixa de TMREaltaMtPhagydeFluozin no quadrante 3 (Q3) usando RFD sem exposição à valinomicina (Figura 1H). Usando essa estratégia de gateing, os níveis basais e de mitofagia induzidos por valinomicina foram caracterizados em ambas as ilhotas de DDF e HFD (Figura 2). Para quantificar o fluxo mitofágico, basal vs. Os níveis de mitofagia induzida por valinomicina foram comparados usando a seguinte razão:

Equation 1

Usando esta razão, o fluxo de mitofagia foi quantificado e comparado em RFD vs. Células β HFD para avaliar diferenças na mitofagia após a indução de obesidade e resistência periférica à insulina. Quantificação do fluxo mitofágico em RFD vs. As amostras de HFD são mostradas na Figura 2E. Este resultado destaca a viabilidade deste ensaio para quantificar a mitofagia em células β usando uma abordagem simples baseada em corantes. Este método também pode ser empregado em ilhotas humanas, células de difícil transfecção e ilhotas isoladas de modelos genéticos complexos, onde o cruzamento com o modelo transgênico mt-Keima seria complicado.

Avaliação da mitofagia utilizando o repórter mt-Keima codificado geneticamente
Mt-Keima é uma proteína fluorescente de excitação dupla fundida com uma sequência de localização de Cox8 que permite seu direcionamento para a membrana mitocondrial interna. A propriedade fluorescente bimodal do mt-Keima permite alternar seus espectros de excitação do comprimento de onda neutro (405 nm) para ácido (561 nm), dependendo do pH do compartimento intracelular6. Isso permite uma análise robusta de fluorescência ratiométrica da mitofagia, onde um aumento na razão ácido-neutro indica indução da mitofagia. Nesse protocolo, a fluozina-3-AM também foi utilizada para seleção de células β por citometria de fluxo. Nesses estudos representativos, o fluxo de mitofagia foi avaliado utilizando ilhotas isoladas de camundongos alimentados com dieta RFD10,11. As tensões FSC e SSC foram primeiramente ajustadas para atingir uma distribuição uniforme de células em um SSC-A vs. Gráfico FSC-A (Figura 3A). Para selecionar células únicas, FSC-H vs. FSC-W e SSC-H vs. Foram utilizados gráficos SSC-W, onde os multipletos foram excluídos devido aos seus maiores valores de sinal de largura em comparação com células individuais (Figura 3B,C). A voltagem e a estratégia de gating para DAPI e Fluozin-3-AM foram determinadas utilizando ilhotas de coloração simples (Figura 3D,E). Portas triangulares para as populações ácida e neutra foram então identificadas usando a amostra mt-Keima positiva sem exposição à valinomicina (Figura 3F).

Uma vez estabelecidas essas comportas primárias e de fluorescência, o fluxo mitofágico foi avaliado por meio das alterações basais e induzidas pela valinomicina na fluorescência da mt-Keima (Figura 3F,G). Para quantificar o fluxo mitofágico, mitofagia basal vs. Os níveis induzidos por valinomicina foram comparados usando a seguinte razão:

Equation 2

Usando esta razão, o fluxo de mitofagia foi quantificado em células RFD. A quantificação desse resultado é mostrada na Figura 3H. É importante ressaltar que esses resultados são comparáveis aos resultados em ilhotas RFD geradas usando a abordagem MtPhagy (Figura 3H).

Figure 1
Figura 1: Esquema de Gating para o método MtPhagy. (A) Gráfico de fluxo exibindo esquema de gating a ser selecionado para todas as células. (B) Gating para selecionar singlets com base em FSC-H vs. FSC-W e (C) SSC-H vs. SSC-W. (D) Gating para células DAPI-negativas para excluir células mortas. (E) Gating para célulasaltas de Fluozin-3-AM para selecionar células β. (F) Esquema de Gating para o corante MtPhagy para identificar populaçõesde células altas e baixas deMtPhagy. (G) Esquema de Gating para TMRE para identificar populaçõesde células TMRE altas ebaixas TMRE. (H) Esquema de agrupamento de quadrantes estabelecido com ilhotas RFD não tratadas paraidentificar células baixas de FluozinhighMtPhagyhighTMRE no quadrante 3 (Q3) como células β submetidas à mitofagia. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Avaliação das diferenças do fluxo mitofágico em células β de camundongo após estresse metabólico usando o esquema de gating MtPhagy. Gráficos representativos de citometria de fluxo de (A) células β RFD não tratadas, (B) células β HFD não tratadas, (C) células β RFD expostas à valinomicina e (D) células β HFD expostas à valinomicina. (E) Quantificação do fluxo de mitofagia em células β, calculado usando uma razão entreas células baixas TMREaltasMtPhagy expostas à valinomicina eas células baixas TMREaltasMtPhagy não expostas à valinomicina, tanto para amostras de RFD quanto HFD. *p < 0,05 pelo teste t de Student não pareado. n = 3/grupo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Esquema de Gating para o método mt-Keima e comparação entre os dois métodos. (A) Gráfico de fluxo exibindo esquema de gating para selecionar para todas as células. (B) Gating para selecionar singlets com base em FSC-H vs. FSC-W e (C) SSC-H vs. SSC-W. (D) Gating para células DAPI-negativas para excluir células mortas. (E) Gating para célulasaltas de Fluozin-3-AM para selecionar células β. (F) Gráficos representativos de citometria de fluxo de células mt-Keima/+ não tratadas e (G) células mt-Keima/+ expostas à valinomicina. (H) Quantificação do fluxo de mitofagia em células β de camundongos alimentados com RFD, calculado usando uma razão entre as células ácidas/neutras expostas à valinomicina e a razão entre as células ácidas/neutras não expostas à valinomicina usando o método mt-Keima e comparado com o método MtPhagy (dados para o protocolo MtPhagy originalmente mostrados na Figura 2E). n = 3/grupo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Este protocolo descreveu dois métodos complementares para quantificar o fluxo de mitofagia em ilhotas primárias dissociadas de camundongos. Usando o método mt-Keima, um aumento na mitofagia foi quantificado como um aumento da razão de células ácidas (561 nm)/neutras (405 nm), enquanto no método MtPhagy, o aumento do fluxo de mitofagia foi quantificado como um aumento na população de células baixas de MtPhagyaltaMtPhagy Fluozinalta. Esses métodos permitem avaliações rápidas, quantitativas e específicas de β células do fluxo mitofágico.

Ambos os métodos são abordagens simples. No entanto, algumas etapas dentro desse protocolo são cruciais para a obtenção de resultados de qualidade e reprodutíveis. Essas etapas incluem: (1) dissociação adequada das ilhotas para obter uma suspensão de célula única, mas leve o suficiente para garantir a viabilidade das ilhotas, (2) estabelecimento cuidadoso de gating para identificar corretamente as populações de interesse e (3) quantificação objetiva dos dados de citometria de fluxo por meio de ferramentas de software para garantir uma avaliação imparcial do fluxo de mitofagia.

Ao selecionar o método a ser utilizado, deve-se considerar o tipo celular e a natureza dos modelos genéticos utilizados. O método mt-Keima, utilizado in vivo ou transfectado in vitro, é um método altamente citado e conceituado para avaliação da mitofagia por citometria de fluxo ou imagem de células vivas21. Embora o método MtPhagy baseado em corante seja uma abordagem mais recente em comparação com repórteres genéticos, há casos em que seu uso pode ser preferido em relação ao mt-Keima. De fato, o método MtPhagy supera a necessidade de transfecção ou esquemas complexos de melhoramento, e a coloração MtPhagy leva apenas 30 min e é realizada imediatamente antes da citometria de fluxo. A abordagem MtPhagy também pode ser empregada com sucesso em amostras de ilhotas humanas primárias difíceis de transfectar. Este protocolo, que se baseia em corantes mitocondriais sensíveis ao pH ou sondas para medir diretamente a mitofagia, é distinto de uma abordagem anterior de Mauro-Lizcano et. al que empregou o corante MitoTracker Deep Red sensível ao potencial de membrana e necessitou do uso de mitofagia e inibidores lisossômicos para quantificar o fluxo mitofágico por citometria de fluxo22. Como o Mauro-Lizcano et. O método al não foi testado em ilhotas, sendo difícil compará-lo diretamente com a eficácia dos métodos MtPhagy ou mt-Keima aqui descritos. Em conjunto, a combinação desses métodos fornece um número crescente de opções para avaliar rigorosamente o fluxo de mitofagia em ensaios unicelulares vivos altamente quantitativos.

Uma desvantagem para ambos os métodos é a sua incompatibilidade com a fixação celular. Embora ambos os métodos sejam compatíveis com abordagens de imagem de células vivas, a fixação celular interfere no gradiente de pH da MtPhagy e da mt-Keima através da membrana lisossômica7,16. Como alternativa, o uso do mitoQC mitophagy reporter em amostras fixas tem sido empregadopreviamente7. Além disso, uma limitação para ambos os métodos é a necessidade de dissociar ilhotas antes da citometria de fluxo, o que pode afetar a viabilidade celular. Portanto, é fundamental corar as células com DAPI para monitorar a viabilidade celular após a dissociação das ilhotas e garantir que todas as amostras sejam tratadas de forma consistente. Após a coloração DAPI, as amostras apresentaram uma média de 12,7% ± 7,4 células mortas (Figura 1D), indicando que >80% das células de cada amostra puderam ser utilizadas para análise. O monitoramento da viabilidade celular em cada estágio (após o isolamento das ilhotas, cultura e, em seguida, dissociação) pode ser adicionalmente útil para obter conhecimento da sobrevivência celular em cada etapa do procedimento. A variabilidade no tempo entre o isolamento das ilhotas e a dissociação de uma única célula também pode afetar a viabilidade celular e os resultados. Assim, recomenda-se permanecer consistente com o tempo em todos os experimentos.

Como o controle de qualidade mitocondrial é crítico para a saúde e a função das células β, avaliações rigorosas da mitofagia usando abordagens bioquímicas ou de imagem tradicionais (incluindo turnover de proteínas da membrana externa mitocondrial, localização mitocondrial para autofagossomos ou lisossomos e microscopia eletrônica) podem ser desafiadoras e demoradas. Assim, o desenvolvimento de sistemas repórteres de mitofagia eficazes e robustos é crucial. Tanto a abordagem mt-Keima quanto a mtPhagy são eficientes e permitem avaliações quantitativas do fluxo mitofágico. Essas duas técnicas permitem flexibilidade e precisão na abordagem do controle de qualidade mitocondrial de células β e na sondagem de interações inter-organelas.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

A SAS recebeu financiamento da Ono Pharmaceutical Co., Ltd. e é consultora da Novo Nordisk.

Acknowledgments

E.L-D. reconhece o apoio dos NIH (T32-AI007413 e T32-AG000114). A SAS agradece o apoio do JDRF (COE-2019-861), do NIH (R01 DK135268, R01 DK108921, R01 DK135032, R01 DK136547, U01 DK127747), do Departamento de Assuntos de Veteranos (I01 BX004444), da família Brehm e da família Anthony.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibiotic-Antimycotic Life Technologies 15240-062
Attune NxT Flow Cytometer Thermofisher Scientific A24858
Dimethyl Sulfoxide Sigma-Aldrich 317275
Fatty Acid Free heat shock BSA powder Equitech BAH66
Fetal bovine serum Gemini Bio 900-108
Fluozin-3AM  Thermofisher Scientific  F24195 100 μg Fluozin-3AM powder reconstituted in 51 μL DMSO and 51 μL Pluronic F-127 to reach 1 mM stock. 
Gibco RPMI 1640 Medium Fisher Scientific 11-875-093
HEPES (1M) Life Technologies 15630-080
MtPhagy dye Dojindo MT02-10 5 μg MtPhagy powder reconstituted with 50 μL DMSO to reach 100 μM stock. 
MtPhagy dye Dojindo MT02-10
Penicillin-Streptomycin (100x) Life Technologies 15140-122 1x Solution used in procotol by diluting 1:10 in ddH2O
Phosphate buffered saline, 10x Fisher Scientific BP399-20 1x Solution used in procotol by diluting 1:10 in ddH2O
Sodium Pyruvate (100x) Life Technologies 11360-070 5 μg MtPhagy powder reconstituted with 50 μL DMSO to reach 100 μM stock. 
TMRE [Tetramethylrhodamine, ethyl ester, perchlorate] Anaspec AS-88061 TMRE powder reconstituted in DMSO to reach 100 μM stock.
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Thermofisher Scientific 25300054
Valinomycin Sigma V0627 Valinomycin powder reconsituted in DMSO to reach 250 nM stock.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kaufman, B. A., Li, C., Soleimanpour, S. A. Mitochondrial regulation of β-cell function: maintaining the momentum for insulin release. Molecular Aspects of Medicine. 42, 91-104 (2015).
  2. Soleimanpour, S. A., et al. The diabetes susceptibility gene Clec16a regulates mitophagy. Cell. 157 (7), 1577-1590 (2014).
  3. Pearson, G., et al. Clec16a, Nrdp1, and USP8 form a ubiquitin-dependent tripartite complex that regulates β-cell mitophagy. Diabetes. 67 (2), 265-277 (2018).
  4. Hattori, N., Saiki, S., Imai, Y. Regulation by mitophagy. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 53, 147-150 (2014).
  5. Berezhnov, A. V., et al. Intracellular pH modulates autophagy and mitophagy. Journal of Biological Chemistry. 291 (16), 8701-8708 (2016).
  6. Sun, N., et al. Measuring in vivo mitophagy. Molecular Cell. 60 (4), 685-696 (2015).
  7. McWilliams, T. G., et al. mito-QC illuminates mitophagy and mitochondrial architecture in vivo. Journal of Cell Biology. 214 (3), 333-345 (2016).
  8. Aoyagi, K., et al. A new beta cell-specific mitophagy reporter mouse shows that metabolic stress leads to accumulation of dysfunctional mitochondria despite increased mitophagy. Diabetologia. 66 (1), 147-162 (2023).
  9. Ma, X., Ding, W. X. A fluorescence imaging based-assay to monitor mitophagy in cultured hepatocytes and mouse liver. Liver Research. 5 (1), 16-20 (2021).
  10. Sidarala, V., et al. Mitophagy protects β cells from inflammatory damage in diabetes. JCI Insight. 5 (24), 141138 (2020).
  11. Gingerich, M. A., et al. An intrinsically disordered protein region encoded by the human disease gene CLEC16A regulates mitophagy. Autophagy. 19 (2), 525-543 (2023).
  12. Sun, N., Malide, D., Liu, J., Rovira, I. I., Combs, C. A., Finkel, T. A fluorescence-based imaging method to measure in vitro and in vivo mitophagy using mt-Keima. Nature Protocols. 12 (8), 1576-1587 (2017).
  13. Zhao, J., Bertoglio, B. A., Gee, K. R., Kay, A. R. The zinc indicator FluoZin-3 is not perturbed significantly by physiological levels of calcium or magnesium. Cell Calcium. 44 (4), 422-426 (2008).
  14. Da Silva Xavier, G. The Cells of the Islets of Langerhans. Journal of Clinical Medicine. 7 (3), 54 (2018).
  15. Thapa, B., et al. Imaging β-cell function using a zinc-responsive MRI contrast agent may identify first responder islets. Frontiers in Endocrinology. 12, 809867 (2022).
  16. Iwashita, H., et al. Live cell imaging of mitochondrial autophagy with a novel fluorescent small molecule. ACS Chemical Biology. 12 (10), 2546-2551 (2017).
  17. Crowley, L. C., Christensen, M. E., Waterhouse, N. J. Measuring mitochondrial transmembrane potential by TMRE staining. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (12), 087361 (2016).
  18. Klein, B., Wörndl, K., Lütz-Meindl, U., Kerschbaum, H. H. Perturbation of intracellular K(+) homeostasis with valinomycin promotes cell death by mitochondrial swelling and autophagic processes. Apoptosis. 16 (11), 1101-1117 (2011).
  19. Ji, Y., et al. Toll-like receptors TLR2 and TLR4 block the replication of pancreatic β cells in diet-induced obesity. Nature Immunology. 20 (6), 677-686 (2019).
  20. Sauvat, A., et al. Quantification of cellular viability by automated microscopy and flow cytometry. Oncotarget. 6 (11), 9467-9475 (2015).
  21. Liu, Y. T., et al. Mt-Keima detects PINK1-PRKN mitophagy in vivo with greater sensitivity than mito-QC. Autophagy. 17 (11), 3753-3762 (2021).
  22. Mauro-Lizcano, M., et al. New method to assess mitophagy flux by flow cytometry. Autophagy. 11 (5), 833-843 (2015).

Tags

Fluxo de Mitofagia Células β Pancreáticas Abordagens Complementares Repórteres Genéticos Modelo de Camundongo Mt-Keima Quantificação de Mitofagia Citometria de Fluxo Sonda Ratiométrica de Dupla Excitação Sensível a PH Emissões de Comprimento de Onda Mt-Keima Ácido-a a Neutro Repórteres de Mitofagia Genética Modelos Genéticos Complexos de Camundongos Células Difíceis de Transfectar Ilhotas Humanas Primárias Método Baseado em Corante MtPhagy Corante Permeável a Células Lisossomos Durante a Mitofagia Fluozina-3-AM Indicador Zn2+ Éster Etílico de Tetrametilrodamina (TMRE) Potencial de Membrana Mitocondrial
Abordagens Complementares para Interrogar o Fluxo de Mitofagia em Células β Pancreáticas
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Levi-D’Ancona, E., Sidarala,… More

Levi-D’Ancona, E., Sidarala, V., Soleimanpour, S. A. Complementary Approaches to Interrogate Mitophagy Flux in Pancreatic β-Cells. J. Vis. Exp. (199), e65789, doi:10.3791/65789 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter