גישות משלימות לחקירת שטף מיטופגיה בתאי β הלבלב
Summary
פרוטוקול זה מתאר שתי שיטות לניתוח כמותי של מיטופגיה בתאי β של הלבלב: הראשונה, שילוב של צבעים ספציפיים למיטוכונדריה החדירים, ושנית, כתב מיטופגיה מקודד גנטית. שתי טכניקות אלה משלימות זו את זו וניתנות לפריסה על בסיס צרכים ספציפיים, ומאפשרות גמישות ודיוק בטיפול כמותי בבקרת איכות מיטוכונדריאלית.
Abstract
מיטופגיה היא מנגנון בקרת איכות הכרחי לשמירה על תפקוד מיטוכונדריאלי אופטימלי. מיטופגיה לא מתפקדת של תאי β גורמת לשחרור אינסולין לא מספיק. הערכות כמותיות מתקדמות של מיטופגיה דורשות לעתים קרובות שימוש במדווחים גנטיים. מודל העכבר mt-Keima, המבטא בדיקה ממוקדת pH רגישה למיטוכונדריה בעלת יחס עירור כפול לכימות מיטופגיה באמצעות ציטומטריית זרימה, עבר אופטימיזציה בתאי β. ניתן להשתמש ביחס בין פליטות אורכי גל mt-Keima חומציים לנייטרליים כדי לכמת מיטופגיה בצורה איתנה. עם זאת, שימוש בכתבי מיטופגיה גנטית יכול להיות מאתגר כאשר עובדים עם מודלים גנטיים מורכבים של עכברים או תאים קשים להעברה, כגון איים אנושיים ראשוניים. פרוטוקול זה מתאר שיטה חדשנית מבוססת צבע משלימה לכימות מיטופגיה של β תאים באיים ראשוניים באמצעות MtPhagy. MtPhagy הוא צבע רגיש ל-pH וחדיר לתאים שמצטבר במיטוכונדריה ומגביר את עוצמת הפלואורסצנטיות שלו כאשר מיטוכונדריה נמצאים בסביבות pH נמוכות, כמו ליזוזומים במהלך מיטופגיה. על ידי שילוב צבע MtPhagy עם Fluozin-3-AM, מחוון Zn2+ הבוחר עבור תאי β, וטטרמתילרודמין, אתיל אסטר (TMRE) להערכת פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית, ניתן לכמת שטף מיטופגיה באופן ספציפי בתאי β באמצעות ציטומטריית זרימה. שתי גישות אלה משלימות מאוד, ומאפשרות גמישות ודיוק בהערכת בקרת איכות מיטוכונדריאלית במודלים רבים של תאי β.
Introduction
תאי β בלבלב מייצרים ומפרישים אינסולין כדי לעמוד בדרישות המטבוליות, ותפקוד לקוי של תאי β אחראי להתפרצות היפרגליקמיה וסוכרת הן בסוכרת מסוג 1 והן בסוכרת מסוג 2. תאי β משלבים מטבוליזם של גלוקוז עם הפרשת אינסולין באמצעות אנרגיה מיטוכונדריאלית ופלט מטבולי, אשר תלויים בעתודה של מסה מיטוכונדריאלית תפקודית 1,2,3. כדי לשמור על תפקוד מיטבי של תאי β, תאי β מסתמכים על מנגנוני בקרת איכות מיטוכונדריה כדי להסיר מיטוכונדריה מיושנים או פגומים ולשמר את המסה המיטוכונדריאלית התפקודית4. אוטופגיה מיטוכונדריאלית סלקטיבית, הידועה גם בשם מיטופגיה, היא מרכיב מרכזי במסלול בקרת האיכות של המיטוכונדריה.
הערכות של מיטופגיה בתאים חיים מסתמכות לעתים קרובות על שינויים ב- pH המיטוכונדריאלי המתרחשים במהלך מיטופגיה. למיטוכונדריה יש pH בסיסי מעט, ומיטוכונדריה בריאים בדרך כלל שוכנים בציטוזול ניטרלי עם pH. במהלך מיטופגיה, מיטוכונדריה פגומים או לא מתפקדים משולבים באופן סלקטיבי באוטופגוזומים ובסופו של דבר מנוקים בתוך ליזוזומים חומציים5. מספר מודלים של עכברי כתב מיטופגיה טרנסגנית in vivo, כגון mt-Keima6, mitoQC7 ו-CMMR8, כמו גם בדיקות מיטופגיות טרנספקטיות, כגון פלסמיד Cox8-EGFP-mCherry9, משתמשים בשינוי pH זה כדי לספק הערכות כמותיות של מיטופגיה. השימוש בעכברים טרנסגניים המבטאים את ה-mt-Keima pH-sensitive dual-excitation ratiometric probe עבר אופטימיזציה להערכות מיטופגיות באיים ובתאים β באמצעות ציטומטריית זרימה10,11. ניתן להשתמש ביחס בין פליטות אורכי גל חומציים לנייטרליים mt-Keima (היחס בין עירור חומצי של 561 ננומטר לעירור נייטרלי של 480 ננומטר) כדי לכמת בצורה איתנה מיטופגיה 6,12.
פרוטוקול זה מתאר גישה אופטימלית להערכת שטף מיטופגיה באיים ראשוניים ובתאי β שבודדו מעכברים טרנסגניים mt-Keima 10,11. בעוד mt-Keima היא בדיקה רגישה מאוד, זה דורש או תוכניות רבייה מסובכות של בעלי חיים או transfection של תאים, אשר לעתים קרובות יכול להיות מאתגר כאשר עובדים בשילוב עם מודלים גנטיים אחרים או עם איים אנושיים ראשוניים. בנוסף, השימוש במספר לייזרים וגלאים פלואורסצנטיים לזיהוי אוכלוסיות תאים ניטרליים וחומציים יכול להגביל את השימוש הקומבינטורי של כתבים פלואורסצנטיים אחרים.
כדי להתגבר על אתגרים אלה, פרוטוקול זה מתאר גם שיטה משלימה, בעלת תעלה פלואורסצנטית יחידה, מבוססת צבע, לזיהוי חזק של מיטופגיה בתאי β מאיי עכבר מבודדים. גישה זו, המכונה שיטת MtPhagy, משתמשת בשילוב של שלושה צבעים חדירים לתאים כדי לבחור תאים β, לכמת את אוכלוסיות התאים שעוברות מיטופגיה באופן פעיל, ולהעריך את פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית (MMP או Δψm) בו זמנית.
הראשון מבין צבעים אלה הוא Fluozin-3-AM, מחוון Zn2+ חדיר לתאים עם Ex/Em 494/516 nm13. איי עכבר מהווים אוכלוסייה הטרוגנית של תאים נבדלים מבחינה תפקודית, כולל תאי α, β, δ ו- PP. תאי β מהווים כ-80% מהתאים בתוך איון העכבר וניתן להבדיל בינם לבין סוגי תאי איון אחרים בשל ריכוזם הגבוה Zn2+ בגרגרי אינסולין14,15, המאפשר זיהוי של תאי β כאוכלוסייההגבוהה של פלואוזין-3-AM. צבע MtPhagy, צבע רגיש ל- pH המשותק על המיטוכונדריה באמצעות קשר כימי ופולט פלואורסצנטיות חלשה, משמש גם בפרוטוקולזה 16. עם השראת מיטופגיה, מיטוכונדריה פגומה משולבת בליזוזום החומצי, וצבע MtPhagy מגביר את עוצמת הפלואורסצנטיות שלו בסביבת pH נמוכה (Ex/Em 561/570-700 ננומטר).
בנוסף, טטרמתילרודמין, אתיל אסטר (TMRE), משמש להערכת MMP. TMRE הוא צבע בעל מטען חיובי חדיר לתאים (Ex/Em 552/575 nm) אשר נתפס על ידי מיטוכונדריה בריאה בשל המטען השלילי היחסי הנתמך על ידי פוטנציאל הממברנה שלהם17. מיטוכונדריה פגומה או לא בריאה מפזרת את פוטנציאל הממברנה שלהם, וכתוצאה מכך היכולת לבודד TMRE יורדת. באמצעות שימוש בצבעים אלה יחד, ניתן לזהות β תאים שעוברים מיטופגיה כאוכלוסייהנמוכה של פלואוזיןגבוה MtPhagyגבוהTMRE באמצעות ציטומטריית זרימה. מאחר שמיטופגיה היא תהליך דינמי ולא סטטי, פרוטוקול זה עבר אופטימיזציה להערכת שטף מיטופגיה באמצעות Valinomycin, K+-ionophore המשרה מיטופגיה לאחר פיזור MMP18. השוואה של מיטופגיה בנוכחות והיעדר valinomycin מאפשרת הערכה של שטף מיטופגיה בקבוצות מדגם שונות.
האופי מבוסס הצבע של הגישה הנוכחית מאפשר להסיק אותה על איים אנושיים וסוגי תאים קשים אחרים להעברה ולעקוף את הצורך בתוכניות גידול מסובכות של בעלי חיים, בניגוד לפרוטוקול mt-Keima. מטרת העל של פרוטוקול זה היא לכמת מיטופגיה בתאי β ברמת התא הבודד באמצעות שתי שיטות עצמאיות מבוססות ציטומטריית זרימה. יחד, פרוטוקול זה מתאר שתי שיטות חזקות ומשלימות המאפשרות דיוק וגמישות במחקר כמותי של בקרת איכות מיטוכונדריאלית.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה תיאר שתי שיטות משלימות לכימות שטף מיטופגיה באיים עכבריים ראשוניים מנותקים. בשיטת mt-Keima כומתה עלייה במיטופגיה כיחס מוגבר של תאים חומציים (561 ננומטר)/ניטרליים (405 ננומטר), ואילו בשיטת MtPhagy כומתה שטף מיטופגיה מוגבר כגידול באוכלוסייתהתאים הגבוהה MtPhagyHighTMRE. שיטות אלה…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
א.ל-ד. מאשר תמיכה מה-NIH (T32-AI007413 ו-T32-AG000114). SAS מודה על תמיכתם של JDRF (COE-2019-861), NIH (R01 DK135268, R01 DK108921, R01 DK135032, R01 DK136547, U01 DK127747), המחלקה לענייני חיילים משוחררים (I01 BX004444), משפחת ברהם ומשפחת אנתוני.
Materials
| Antibiotic-Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| Attune NxT Flow Cytometer | Thermofisher Scientific | A24858 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermofisher Scientific | D1306 | DAPI reconstituted in ddH2O to reach 0.2 µg/mL stock |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | 317275 | |
| Fatty Acid Free heat shock BSA powder | Equitech | BAH66 | |
| Fetal bovine serum | Gemini Bio | 900-108 | |
| Fluozin-3AM | Thermofisher Scientific | F24195 | 100 μg Fluozin-3AM powder reconstituted in 51 μL DMSO and 51 μL Pluronic F-127 to reach 1 mM stock. |
| Gibco RPMI 1640 Medium | Fisher Scientific | 11-875-093 | |
| HEPES (1M) | Life Technologies | 15630-080 | |
| MtPhagy dye | Dojindo | MT02-10 | 5 μg MtPhagy powder reconstituted with 50 μL DMSO to reach 100 μM stock. |
| MtPhagy dye | Dojindo | MT02-10 | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | Life Technologies | 15140-122 | 1x Solution used in procotol by diluting 1:10 in ddH2O |
| Phosphate buffered saline, 10x | Fisher Scientific | BP399-20 | 1x Solution used in procotol by diluting 1:10 in ddH2O |
| Sodium Pyruvate (100x) | Life Technologies | 11360-070 | 5 μg MtPhagy powder reconstituted with 50 μL DMSO to reach 100 μM stock. |
| TMRE [Tetramethylrhodamine, ethyl ester, perchlorate] | Anaspec | AS-88061 | TMRE powder reconstituted in DMSO to reach 100 μM stock. |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermofisher Scientific | 25300054 | |
| Valinomycin | Sigma | V0627 | Valinomycin powder reconsituted in DMSO to reach 250 nM stock. |
References
- Kaufman, B. A., Li, C., Soleimanpour, S. A. Mitochondrial regulation of β-cell function: maintaining the momentum for insulin release. Molecular Aspects of Medicine. 42, 91-104 (2015).
- Soleimanpour, S. A., et al. The diabetes susceptibility gene Clec16a regulates mitophagy. Cell. 157 (7), 1577-1590 (2014).
- Pearson, G., et al. Clec16a, Nrdp1, and USP8 form a ubiquitin-dependent tripartite complex that regulates β-cell mitophagy. Diabetes. 67 (2), 265-277 (2018).
- Hattori, N., Saiki, S., Imai, Y. Regulation by mitophagy. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 53, 147-150 (2014).
- Berezhnov, A. V., et al. Intracellular pH modulates autophagy and mitophagy. Journal of Biological Chemistry. 291 (16), 8701-8708 (2016).
- Sun, N., et al. Measuring in vivo mitophagy. Molecular Cell. 60 (4), 685-696 (2015).
- McWilliams, T. G., et al. mito-QC illuminates mitophagy and mitochondrial architecture in vivo. Journal of Cell Biology. 214 (3), 333-345 (2016).
- Aoyagi, K., et al. A new beta cell-specific mitophagy reporter mouse shows that metabolic stress leads to accumulation of dysfunctional mitochondria despite increased mitophagy. Diabetologia. 66 (1), 147-162 (2023).
- Ma, X., Ding, W. X. A fluorescence imaging based-assay to monitor mitophagy in cultured hepatocytes and mouse liver. Liver Research. 5 (1), 16-20 (2021).
- Sidarala, V., et al. Mitophagy protects β cells from inflammatory damage in diabetes. JCI Insight. 5 (24), 141138 (2020).
- Gingerich, M. A., et al. An intrinsically disordered protein region encoded by the human disease gene CLEC16A regulates mitophagy. Autophagy. 19 (2), 525-543 (2023).
- Sun, N., Malide, D., Liu, J., Rovira, I. I., Combs, C. A., Finkel, T. A fluorescence-based imaging method to measure in vitro and in vivo mitophagy using mt-Keima. Nature Protocols. 12 (8), 1576-1587 (2017).
- Zhao, J., Bertoglio, B. A., Gee, K. R., Kay, A. R. The zinc indicator FluoZin-3 is not perturbed significantly by physiological levels of calcium or magnesium. Cell Calcium. 44 (4), 422-426 (2008).
- Da Silva Xavier, G. The Cells of the Islets of Langerhans. Journal of Clinical Medicine. 7 (3), 54 (2018).
- Thapa, B., et al. Imaging β-cell function using a zinc-responsive MRI contrast agent may identify first responder islets. Frontiers in Endocrinology. 12, 809867 (2022).
- Iwashita, H., et al. Live cell imaging of mitochondrial autophagy with a novel fluorescent small molecule. ACS Chemical Biology. 12 (10), 2546-2551 (2017).
- Crowley, L. C., Christensen, M. E., Waterhouse, N. J. Measuring mitochondrial transmembrane potential by TMRE staining. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (12), 087361 (2016).
- Klein, B., Wörndl, K., Lütz-Meindl, U., Kerschbaum, H. H. Perturbation of intracellular K(+) homeostasis with valinomycin promotes cell death by mitochondrial swelling and autophagic processes. Apoptosis. 16 (11), 1101-1117 (2011).
- Ji, Y., et al. Toll-like receptors TLR2 and TLR4 block the replication of pancreatic β cells in diet-induced obesity. Nature Immunology. 20 (6), 677-686 (2019).
- Sauvat, A., et al. Quantification of cellular viability by automated microscopy and flow cytometry. Oncotarget. 6 (11), 9467-9475 (2015).
- Liu, Y. T., et al. Mt-Keima detects PINK1-PRKN mitophagy in vivo with greater sensitivity than mito-QC. Autophagy. 17 (11), 3753-3762 (2021).
- Mauro-Lizcano, M., et al. New method to assess mitophagy flux by flow cytometry. Autophagy. 11 (5), 833-843 (2015).
