Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

גישות משלימות לחקירת שטף מיטופגיה בתאי β הלבלב

Published: September 15, 2023 doi: 10.3791/65789
Automatic Translation
1,2, 1, 1,3,4
1Department of Internal Medicine, Division of Metabolism, Endocrinology and Diabetes, University of Michigan, Ann Arbor, 2Graduate Program in Immunology, University of Michigan Medical School, 3Department of Molecular and Integrative Physiology, University of Michigan, Ann Arbor, 4VA Ann Arbor Healthcare System

Summary

פרוטוקול זה מתאר שתי שיטות לניתוח כמותי של מיטופגיה בתאי β של הלבלב: הראשונה, שילוב של צבעים ספציפיים למיטוכונדריה החדירים, ושנית, כתב מיטופגיה מקודד גנטית. שתי טכניקות אלה משלימות זו את זו וניתנות לפריסה על בסיס צרכים ספציפיים, ומאפשרות גמישות ודיוק בטיפול כמותי בבקרת איכות מיטוכונדריאלית.

Abstract

מיטופגיה היא מנגנון בקרת איכות הכרחי לשמירה על תפקוד מיטוכונדריאלי אופטימלי. מיטופגיה לא מתפקדת של תאי β גורמת לשחרור אינסולין לא מספיק. הערכות כמותיות מתקדמות של מיטופגיה דורשות לעתים קרובות שימוש במדווחים גנטיים. מודל העכבר mt-Keima, המבטא בדיקה ממוקדת pH רגישה למיטוכונדריה בעלת יחס עירור כפול לכימות מיטופגיה באמצעות ציטומטריית זרימה, עבר אופטימיזציה בתאי β. ניתן להשתמש ביחס בין פליטות אורכי גל mt-Keima חומציים לנייטרליים כדי לכמת מיטופגיה בצורה איתנה. עם זאת, שימוש בכתבי מיטופגיה גנטית יכול להיות מאתגר כאשר עובדים עם מודלים גנטיים מורכבים של עכברים או תאים קשים להעברה, כגון איים אנושיים ראשוניים. פרוטוקול זה מתאר שיטה חדשנית מבוססת צבע משלימה לכימות מיטופגיה של β תאים באיים ראשוניים באמצעות MtPhagy. MtPhagy הוא צבע רגיש ל-pH וחדיר לתאים שמצטבר במיטוכונדריה ומגביר את עוצמת הפלואורסצנטיות שלו כאשר מיטוכונדריה נמצאים בסביבות pH נמוכות, כמו ליזוזומים במהלך מיטופגיה. על ידי שילוב צבע MtPhagy עם Fluozin-3-AM, מחוון Zn2+ הבוחר עבור תאי β, וטטרמתילרודמין, אתיל אסטר (TMRE) להערכת פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית, ניתן לכמת שטף מיטופגיה באופן ספציפי בתאי β באמצעות ציטומטריית זרימה. שתי גישות אלה משלימות מאוד, ומאפשרות גמישות ודיוק בהערכת בקרת איכות מיטוכונדריאלית במודלים רבים של תאי β.

Introduction

תאי β בלבלב מייצרים ומפרישים אינסולין כדי לעמוד בדרישות המטבוליות, ותפקוד לקוי של תאי β אחראי להתפרצות היפרגליקמיה וסוכרת הן בסוכרת מסוג 1 והן בסוכרת מסוג 2. תאי β משלבים מטבוליזם של גלוקוז עם הפרשת אינסולין באמצעות אנרגיה מיטוכונדריאלית ופלט מטבולי, אשר תלויים בעתודה של מסה מיטוכונדריאלית תפקודית 1,2,3. כדי לשמור על תפקוד מיטבי של תאי β, תאי β מסתמכים על מנגנוני בקרת איכות מיטוכונדריה כדי להסיר מיטוכונדריה מיושנים או פגומים ולשמר את המסה המיטוכונדריאלית התפקודית4. אוטופגיה מיטוכונדריאלית סלקטיבית, הידועה גם בשם מיטופגיה, היא מרכיב מרכזי במסלול בקרת האיכות של המיטוכונדריה.

הערכות של מיטופגיה בתאים חיים מסתמכות לעתים קרובות על שינויים ב- pH המיטוכונדריאלי המתרחשים במהלך מיטופגיה. למיטוכונדריה יש pH בסיסי מעט, ומיטוכונדריה בריאים בדרך כלל שוכנים בציטוזול ניטרלי עם pH. במהלך מיטופגיה, מיטוכונדריה פגומים או לא מתפקדים משולבים באופן סלקטיבי באוטופגוזומים ובסופו של דבר מנוקים בתוך ליזוזומים חומציים5. מספר מודלים של עכברי כתב מיטופגיה טרנסגנית in vivo, כגון mt-Keima6, mitoQC7 ו-CMMR8, כמו גם בדיקות מיטופגיות טרנספקטיות, כגון פלסמיד Cox8-EGFP-mCherry9, משתמשים בשינוי pH זה כדי לספק הערכות כמותיות של מיטופגיה. השימוש בעכברים טרנסגניים המבטאים את ה-mt-Keima pH-sensitive dual-excitation ratiometric probe עבר אופטימיזציה להערכות מיטופגיות באיים ובתאים β באמצעות ציטומטריית זרימה10,11. ניתן להשתמש ביחס בין פליטות אורכי גל חומציים לנייטרליים mt-Keima (היחס בין עירור חומצי של 561 ננומטר לעירור נייטרלי של 480 ננומטר) כדי לכמת בצורה איתנה מיטופגיה 6,12.

פרוטוקול זה מתאר גישה אופטימלית להערכת שטף מיטופגיה באיים ראשוניים ובתאי β שבודדו מעכברים טרנסגניים mt-Keima 10,11. בעוד mt-Keima היא בדיקה רגישה מאוד, זה דורש או תוכניות רבייה מסובכות של בעלי חיים או transfection של תאים, אשר לעתים קרובות יכול להיות מאתגר כאשר עובדים בשילוב עם מודלים גנטיים אחרים או עם איים אנושיים ראשוניים. בנוסף, השימוש במספר לייזרים וגלאים פלואורסצנטיים לזיהוי אוכלוסיות תאים ניטרליים וחומציים יכול להגביל את השימוש הקומבינטורי של כתבים פלואורסצנטיים אחרים.

כדי להתגבר על אתגרים אלה, פרוטוקול זה מתאר גם שיטה משלימה, בעלת תעלה פלואורסצנטית יחידה, מבוססת צבע, לזיהוי חזק של מיטופגיה בתאי β מאיי עכבר מבודדים. גישה זו, המכונה שיטת MtPhagy, משתמשת בשילוב של שלושה צבעים חדירים לתאים כדי לבחור תאים β, לכמת את אוכלוסיות התאים שעוברות מיטופגיה באופן פעיל, ולהעריך את פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית (MMP או Δψm) בו זמנית.

הראשון מבין צבעים אלה הוא Fluozin-3-AM, מחוון Zn2+ חדיר לתאים עם Ex/Em 494/516 nm13. איי עכבר מהווים אוכלוסייה הטרוגנית של תאים נבדלים מבחינה תפקודית, כולל תאי α, β, δ ו- PP. תאי β מהווים כ-80% מהתאים בתוך איון העכבר וניתן להבדיל בינם לבין סוגי תאי איון אחרים בשל ריכוזם הגבוה Zn2+ בגרגרי אינסולין14,15, המאפשר זיהוי של תאי β כאוכלוסייההגבוהה של פלואוזין-3-AM. צבע MtPhagy, צבע רגיש ל- pH המשותק על המיטוכונדריה באמצעות קשר כימי ופולט פלואורסצנטיות חלשה, משמש גם בפרוטוקולזה 16. עם השראת מיטופגיה, מיטוכונדריה פגומה משולבת בליזוזום החומצי, וצבע MtPhagy מגביר את עוצמת הפלואורסצנטיות שלו בסביבת pH נמוכה (Ex/Em 561/570-700 ננומטר).

בנוסף, טטרמתילרודמין, אתיל אסטר (TMRE), משמש להערכת MMP. TMRE הוא צבע בעל מטען חיובי חדיר לתאים (Ex/Em 552/575 nm) אשר נתפס על ידי מיטוכונדריה בריאה בשל המטען השלילי היחסי הנתמך על ידי פוטנציאל הממברנה שלהם17. מיטוכונדריה פגומה או לא בריאה מפזרת את פוטנציאל הממברנה שלהם, וכתוצאה מכך היכולת לבודד TMRE יורדת. באמצעות שימוש בצבעים אלה יחד, ניתן לזהות β תאים שעוברים מיטופגיה כאוכלוסייהנמוכה של פלואוזיןגבוה MtPhagyגבוהTMRE באמצעות ציטומטריית זרימה. מאחר שמיטופגיה היא תהליך דינמי ולא סטטי, פרוטוקול זה עבר אופטימיזציה להערכת שטף מיטופגיה באמצעות Valinomycin, K+-ionophore המשרה מיטופגיה לאחר פיזור MMP18. השוואה של מיטופגיה בנוכחות והיעדר valinomycin מאפשרת הערכה של שטף מיטופגיה בקבוצות מדגם שונות.

האופי מבוסס הצבע של הגישה הנוכחית מאפשר להסיק אותה על איים אנושיים וסוגי תאים קשים אחרים להעברה ולעקוף את הצורך בתוכניות גידול מסובכות של בעלי חיים, בניגוד לפרוטוקול mt-Keima. מטרת העל של פרוטוקול זה היא לכמת מיטופגיה בתאי β ברמת התא הבודד באמצעות שתי שיטות עצמאיות מבוססות ציטומטריית זרימה. יחד, פרוטוקול זה מתאר שתי שיטות חזקות ומשלימות המאפשרות דיוק וגמישות במחקר כמותי של בקרת איכות מיטוכונדריאלית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

המחקרים בבעלי חיים המוצגים בפרוטוקול זה נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת מישיגן. במחקר זה נעשה שימוש בעכברי C57BL/6J זכרים בני עשרים שבועות, שקיבלו דיאטת שומן רגילה של 15 שבועות (RFD) או דיאטה עתירת שומן (HFD).

1. הערכת מיטופגיה באמצעות גישת MtPhagy מבוססת צבע (שיטה 1)

  1. הכנת איון עכבר וטיפול בו
    1. בצע תרבית איים וחשיפה לואלינומיצין לפי השלבים הבאים.
      1. בודדו איים מעכברי דיאטת שומן רגילה (RFD) או דיאטה עתירת שומן (HFD, 60 קק"ל% שומן19),בהתאם לשיטות 2,10 שתוארו קודם לכן.
      2. דגימות איון תרבית למשך הלילה בטמפרטורה של 37°C ב-RPMI בינוני בתוספת 100 יחידות/מ"ל אנטי-מיקוטי-אנטיביוטי, 50 יחידות/מ"ל פניצילין-סטרפטומיצין, 1 מ"מ נתרן פירובט, 10 מ"מ HEPES וסרום בקר עוברי 10% (FBS) (ראו טבלת חומרים). מדיום זה ייקרא "מדיום איון".
      3. בעזרת פיפטה, בוחרים 100 איים בכל מצב לצלחות פטרי בקוטר 6 ס"מ ב-2 מ"ל של איון בינוני.
        הערה: התנאים המשמשים לפרוטוקול זה: (1) בקרה לא מוכתמת: איי RFD לא מוכתמים; (2) בקרת DAPI בלבד: איי RFD מוכתמים ב- DAPI; (3) בקרת Fluozin-3-AM בלבד: איי RFD מוכתמים ב-Fluozin-3-AM; (4) בקרת MtPhagy בלבד: איי RFD מוכתמים ב-MtPhagy; (5) בקרת TMRE בלבד: איי RFD מוכתמים ב-TMRE; (6) RFD לא מטופל: איי RFD מוכתמים ב-MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM ו-DAPI; (7) איי RFD שנחשפו לולינומיצין: איי RFD שנחשפו לוואלינומיצין ומוכתמים ב-MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM ו-DAPI; (8) HFD לא מטופל: איי HFD מוכתמים ב-MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM ו-DAPI; (9) איי HFD שנחשפו לולינומיצין: איי HFD שנחשפו לוואלינומיצין ומוכתמים ב-MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM ו-DAPI.
      4. עבור תנאים (7) ו-(9) (ראה הערה לעיל) שנחשפו לוולינומיצין, הוסף 2 μL של 250 nΜ valinomycin ציר (ראה טבלת חומרים) לאיים בצלחת פטרי למשך 3 שעות כדי לגרום למיטופגיה.
    2. ביצוע דיסוציאציה של תא בודד.
      1. לאחר חשיפה של 3 שעות לוואלינומיצין, בחרו 100 איים מכל מצב לצינורות מיקרוצנטריפוגות נפרדים באמצעות פיפטה.
      2. סובבו איים במהירות של 350 x גרם למשך דקה אחת ב-10°C והשליכו את הסופרנאטנט באמצעות פיפטה.
      3. יש לשטוף דוגמיות 2x עם 1 מ"ל 1x מלח חוצץ פוספט (PBS), עם שלבי סחיטה (350 x גרם/דקה אחת, 10°C) בין כל כביסה. יש להשליך את הסופרנאטנט עם פיפטה לאחר כל כביסה.
      4. כדי לנתק איים לתאים בודדים, הוסף 500 μL של 0.05% טריפסין (מחומם מראש ל 37 ° C) לצינור מיקרוצנטריפוגה של דגימה אחת כדי למנוע עיכול יתר של איונים. פיפטה מעלה ומטה שוב ושוב עד שהאיים מפוזרים באופן גלוי.
      5. הוסף מיד 1 מ"ל של מדיום איון שחומם מראש כדי לנטרל טריפסין. חזור על טריפסיניזציה ונטרול עבור כל דגימה, אחד בכל פעם.
      6. דגימות ספין ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב 10 ° C. מוציאים סופרנאטנט עם פיפטה, נזהרים לא להפריע לכדור.
        הערה: גלולה תהיה עדינה עבור דגימות שנחשפו valinomycin.
      7. יש לשטוף דוגמיות 2x עם RPMI בינוני, ללא פנול אדום, בתוספת 100 יחידות/מ"ל אנטי-אנטי-אנטיביוטי, 50 יחידות/מ"ל פניצילין-סטרפטומיצין, 1 מ"מ נתרן פירובט, 10 mM HEPES ו-10% אלבומין בסרום בקר (BSA). תווך זה ייקרא "תווך זרימת איון". כלול שלבי סחיטה (350 x גרם/דקה אחת, 10° צלזיוס) בין כל כביסה. יש להשליך את הסופרנאטנט עם פיפטה לאחר כל כביסה.
    3. תאי צביעה עם MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM ו-DAPI כדי להתכונן לציטומטריית זרימה.
      1. להשהות דגימות איון ב 500 μL של תווך זרימת איון.
      2. הוסף 0.25 μL של מלאי MtPhagy של 100 מיקרומטר (ראה טבלת חומרים) לצינורות המקבלים צבע MtPhagy (תנאים 4, 6, 7, 8 ו- 9, הערה לשלב 1.1.1).
      3. הוסף 0.25 μL של 100 μM TMRE (ראה טבלת חומרים) לצינורות המקבלים צבע TMRE (תנאים 5, 6, 7, 8 ו- 9).
      4. יש להוסיף 0.25 μL של 1 mM Fluozin-3-AM (ראה טבלת חומרים) לצינורות המקבלים צבע Fluozin-3-AM (תנאים 3, 6, 7, 8 ו-9).
      5. צינורות מערבולת במהירות נמוכה במשך 5 שניות לערבב.
      6. יש לעטוף צינורות מיקרוצנטריפוגות ברדיד אלומיניום כדי להגן מפני אור ולדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות. באמצע הדגירה, מערבולות צינורות במהירות נמוכה עבור 5-10 שניות כדי לערבב.
      7. לאחר הדגירה, דגימות צנטריפוגות ב 350 x גרם במשך דקה אחת ב 10 ° C. יש להשליך סופרנאטנט באמצעות פיפטה.
      8. דגימות השעיה בתווך זרימה של 500 μL איון. הוסף 0.2 מיקרוגרם/מ"ל DAPI (ראה טבלת חומרים) לתנאים 2, 6, 7, 8 ו- 9.
      9. דגימות ספין ב 350 x גרם במשך 1 דקות ב 10 ° C. יש להשליך סופרנאטנט באמצעות פיפטה ולהשהות מחדש ב-500 מיקרוליטר של תווך זרימת איון.
      10. מניחים דוגמאות על קרח.
  2. ציטומטריית זרימה
    1. הפעל את המכשיר (ראה טבלת חומרים).
      הערה: כל ציטומטר זרימה עם המסננים המתאימים יפעל. במחקר זה נעשה שימוש במסננים הבאים: (1) VL1 עבור DAPI: עירור/פליטה - 405 ננומטר/440 ננומטר (50 ננומטר); (2) BL1 עבור Fluozin-3-AM: עירור/פליטה - 488 ננומטר/530 ננומטר (30 ננומטר); (3) BL2 לצבע MtPhagy: עירור/פליטה - 488 ננומטר/590 ננומטר (40 ננומטר); (4) YL1 עבור TMRE: עירור/פליטה - 561 ננומטר/585 ננומטר (16 ננומטר).
    2. התאם את המתחים עבור פיזור קדימה (FSC) ופיזור צדדי (SSC) כדי להבטיח שאוכלוסיות התאים נמצאות במרכז חלקת הפיזור. עבור פרוטוקול זה, המתחים ששימשו היו 120 V עבור FSC ו- 260 V עבור SSC כדי להבטיח שהתאים נופלים באופן שווה בתוך FSC-A לעומת . תרשים SSC-A (איור 1A).
    3. כדי לא לכלול תאים שאינם בודדים, הוסף שער מלבני ב- FSC-H לעומת . FSC-W ואחריו SSC-H לעומת . SSC-W (איור 1B,C).
    4. התאם מתחים ופיצוי עבור DAPI לסינון עבור תאי β חיים. קבעו שערי פלואורסצנטיות עבור כל פלואורופור שנעשה בו שימוש בהתבסס על דגימת RFD לא מוכתמת (איורים 1D-F).
      הערה: מתחים המשמשים עבור כל ערוץ: (1) VL1: 320-360 V; (2) BL1: 300-340 V; (3) BL2: 260-300 V; (4) YL1: 300-340 V.
    5. לאחר הקמת השערים, אספו 10,000 אירועים לכל מדגם.
      הערה: תוך שימוש בגישת ה-gating הזו, רמות מיטופגיה בתנאי בסיס ובהשראת ולינומיצין הוערכו גם באיי RFD וגם באיי HFD (איור 2).
    6. שמור נתונים כקבצי FCS לניתוח.

2. הערכת מיטופגיה באמצעות כתב mt-Keima מקודד גנטית (שיטה 2)

  1. הכנת אי עכבר ודיסוציאציה של תא בודד
    1. בצע תרבית איים וחשיפה לואלינומיצין לפי השלבים הבאים.
      1. בודדו איים בלבלב מעכברי בר (WT) ועכברי mt-Keima/+ (mt-Keima)6. בשיטה זו נעשה שימוש בעכברי WT זכרים בני 20 שבועות או עכברי RFD מוזנים mt-Keima/+.
      2. דגימות איון תרבית לילה ב 37 °C (77 °F) בתווך איון.
      3. בעזרת פיפטה, בוחרים 100 איים בכל מצב לתוך צלחות פטרי בקוטר 6 ס"מ עם 2 מ"ל של איון בינוני.
        הערה: התנאים המשמשים לפרוטוקול זה: (1) בקרה לא מוכתמת: איי WT לא מוכתמים; (2) בקרת DAPI בלבד: איי WT מוכתמים ב- DAPI; (3) בקרת פלוזין-3-AM בלבד: איי WT מוכתמים בפלוזין-3-AM; (4) בקרת mt-Keima בלבד: איים mt-Keima/+ לא מוכתמים; (5) לא מטופלים: mt-Keima/+ איים מוכתמים בפלוזין-3-AM ו-DAPI; (6) Valinomycin: mt-Keima/+ איים שנחשפו לוולינומיצין ומוכתמים בפלוזין-3-AM ו-DAPI.
      4. עבור מצב (6) עם חשיפה valinomycin, להוסיף 2 μL של 250 ננומטר valinomycin ציר לאיים בצלחת פטרי במשך 3 שעות כדי לגרום mitophagy.
    2. ביצוע דיסוציאציה של תא בודד.
      1. בצע שלבי דיסוציאציה של תא בודד, כמתואר בשלב 1.1.2.
    3. תאי צביעה עם Fluozin-3-AM ו-DAPI.
      1. להשהות דגימות איון ב 500 μL של תווך זרימת איון.
      2. הוסף 0.25 μL של 1 mM Fluozin-3-AM לצינורות המקבלים צבע Fluozin-3-AM (תנאים 3, 5 ו- 6).
      3. לדגור על תאים בטמפרטורה של 37°C ולהמשיך לטיפול DAPI, כמתואר בשלבים 1.1.3.5-1.3.10.
  2. ציטומטריית זרימה
    1. הפעל את המכשיר. כל ציטומטר זרימה עם המסננים המתאימים יעבוד.
      הערה: במחקר זה נעשה שימוש במסננים הבאים: (1) VL1 עבור DAPI: עירור/פליטה - 405 ננומטר/440 ננומטר (50 ננומטר); (2) BL1 עבור Fluozin-3-AM: עירור/פליטה - 488 ננומטר/530 ננומטר (30 ננומטר); (3) VL3 עבור mt-Keima נייטרלי: עירור/פליטה - 405 ננומטר/603 ננומטר (48 ננומטר); (4) YL2 עבור חומצת mt-Keima: עירור/פליטה - 561 ננומטר/620 ננומטר (15 ננומטר).
    2. כוונן מתחי FSC ו-SSC ולא כלל תאים שאינם בודדים כמתואר בשלבים 1.2.2-1.2.3 (איורים 3A-C).
    3. התאימו את המתחים והפיצוי עבור DAPI, Fluozin-3-AM ו-mt-Keima באמצעות בקרות לא מוכתמות וחיוביות בודדות (תנאים 1-4) כדי להבטיח שניתן יהיה להבחין בין אוכלוסיות תאים חיוביים פלואורסצנטיים לבין תאים לא מוכתמים. לאחר החלת פיצוי מתאים על כל ערוץ, הגדירו שער שלילי DAPI ושערים חיוביים של Fluozin-3-AM כדי לסנן תאי β חיים (איורים 3D-E).
    4. הגדירו סכמת גטינג משולשת באמצעות הדגימה החיובית mt-Keima (תנאי 4) כדי לזהות אוכלוסיות תאים חומציים וניטרליים (איור 3F).
      הערה: מתחים המשמשים בדרך כלל עבור כל ערוץ: (1) VL1: 320-340 V; (2) BL2: 260-280 V; (3) VL3: 280-300 V; (4) YL2: 280-300 V.
    5. לאחר הקמת השערים, אספו 10,000 אירועים לכל מדגם. סכמות Gating עבור תנאים 5 ו-6 מודגמות באיור 3A-G.
    6. שמור נתונים כקבצי FCS לניתוח.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הערכת מיטופגיה באמצעות גישת MtPhagy מבוססת צבע
גישה מבוססת צבע זו הותאמה לניתוח שטף מיטופגיה בתוך תאי β עכבר ראשוניים ללא צורך בכתב גנטי, תוך שימוש בפלוזין-3-AM, TMRE ו- MtPhagy וכן DAPI כדי להוציא תאים מתים. על ידי זיווג צבעים אלה עם valinomycin כדי לגרום mitophagy, פרוטוקול זה מתאר שיטה מבוססת צבע למדוד באופן סלקטיבי שטף mitophagy בעכבר ראשוני β תאים18. עבור הנתונים המוצגים בשיטת MtPhagy זו, הן מיטופגיה בסיסית והן מיטופגיה הנגרמת על ידי ולינומיצין נותחו באיים שבודדו מדיאטה רגילה של שומן (RFD) או דיאטה עתירת שומן (HFD, 60 קק"ל שומן) שניזונו מעכברים כדי להעריך את ההשפעה של לחץ מטבולי על שטף המיטופגיה. כדי לזהות את אוכלוסיית העניין, התאים גודרו באמצעות איי RFD לא מטופלים. מתחי FSC ו-SSC הותאמו תחילה כדי להשיג התפלגות שווה של תאים בחלקת SSC-A לעומת FSC-A (איור 1A). כדי לבחור תאים בודדים, הן FSC-H לעומת . FSC-W ו- SSC-H לעומת נעשה שימוש בתרשימי SSC-W, שבהם מכפילים לא נכללו בשל ערכי אות הרוחב הגבוהים יותר שלהם בהשוואה לתאים בודדים (איור 1B,C). לאחר מכן, תאים שליליים של DAPI נבחרו להוציא תאים מתים20 (איור 1D). לאחר הקמת שערים ראשיים, נעשה שימוש בבקרות מוכתמות בודדות כדי לבסס שערי פלואורסצנטיות עבור Fluozin-3-AM, MtPhagy ו-TMRE (איור 1E-G), כמו גם בקרות פיצוי עבור ציטומטריית זרימה פלואורסצנטית מרובת צבעים.

ברגע שהשערים הראשוניים והפלואורסצנטיים האלה נוצרו, תאי β עם ניצול גבוה של מיטופגיה הוגדרו כאוכלוסייהנמוכה שלפלואוזין גבוהMtPhagyגבוהTMRE ברביע 3 (Q3) באמצעות RFD ללא חשיפה לוואלינומיצין (איור 1H). באמצעות אסטרטגיית ה-gating הזו, רמות מיטופגיה בסיסיות ורמות של ולינומיצין אופיינו גם באיים RFD וגם באיים HFD (איור 2). כדי לכמת שטף מיטופגיות, בזאלי לעומת רמות מיטופגיה המושרה על ידי ולינומיצין הושוו באמצעות היחס הבא:

Equation 1

באמצעות יחס זה, שטף מיטופגיה כומת והושווה ב- RFD לעומת . HFD β תאים להערכת הבדלים במיטופגיה לאחר השראת השמנת יתר ותנגודת לאינסולין היקפי. כימות שטף מיטופגיה ב- RFD לעומת דגימות HFD מוצגות באיור 2E. תוצאה זו מדגישה את ההיתכנות של בדיקה זו לכימות מיטופגיה בתאי β באמצעות גישה פשוטה מבוססת צבע. שיטה זו יכולה לשמש גם באיים אנושיים, תאים קשים להעברה ואיונים מבודדים ממודלים גנטיים מורכבים שבהם המעבר למודל המהונדס של הר קיימה יהיה מסורבל.

הערכת מיטופגיה באמצעות כתב mt-Keima מקודד גנטית
Mt-Keima הוא חלבון פלואורסצנטי בעירור כפול המאוחה עם רצף לוקליזציה Cox8 המאפשר את התמקדותו בקרום המיטוכונדריאלי הפנימי. התכונה הפלואורסצנטית הבימודאלית של mt-Keima מאפשרת לו להחליף את ספקטרום העירור שלו מאורך גל נייטרלי (405 ננומטר) לחומצי (561 ננומטר), בהתאם ל- pH של התא התוך-תאי6. זה מאפשר ניתוח פלואורסצנטי יחסי חזק של מיטופגיה, כאשר עלייה ביחס חומצי לניטרלי מצביעה על השראת מיטופגיה. בפרוטוקול זה, Fluozin-3-AM שימש גם לבחירה עבור תאים β באמצעות ציטומטריית זרימה. במחקרים מייצגים אלה, שטף מיטופגיה הוערך באמצעות איים שבודדו מעכברים שניזונו מתזונת RFD10,11. מתחי FSC ו-SSC הותאמו תחילה כדי להשיג התפלגות שווה של תאים על SSC-A לעומת . תרשים FSC-A (איור 3A). כדי לבחור תאים בודדים, הן FSC-H לעומת . FSC-W ו- SSC-H לעומת נעשה שימוש בחלקות SSC-W, שבהן לא נכללו מכפילים בשל ערכי אות הרוחב הגבוהים יותר שלהם בהשוואה לתאים בודדים (איור 3B,C). אסטרטגיית המתח וה-gating עבור DAPI ו-Fluozin-3-AM נקבעה באמצעות איים מוכתמים בודדים (איור 3D,E). שערים משולשים עבור אוכלוסיות חומציות וניטרליות זוהו לאחר מכן באמצעות הדגימה החיובית mt-Keima ללא חשיפה לוואלינומיצין (איור 3F).

לאחר שהשערים הראשוניים והפלואורסצנטיים האלה נוצרו, שטף המיטופגיה הוערך באמצעות שינויים בזאליים וולינומיצינים הנגרמים בפלואורסצנטיות mt-Keima (איור 3F,G). כדי לכמת את שטף המיטופגיה, מיטופגיה בזאלית לעומת הושוו רמות המושרות על ידי ולינומיצין באמצעות היחס הבא:

Equation 2

באמצעות יחס זה, שטף מיטופגיה כומת בתאי RFD. כימות של תוצאה זו מוצג באיור 3H. חשוב לציין שהתוצאות האלה דומות לתוצאות באיי RFD שנוצרו באמצעות גישת MtPhagy (איור 3H).

Figure 1
איור 1: סכימת Gating עבור שיטת MtPhagy. (A) תרשים זרימה המציג סכימת gating לבחירה עבור כל התאים. (B) Gating לבחירה עבור סינגלים בהתבסס על FSC-H לעומת . FSC-W ו- (C) SSC-H לעומת SSC-W. (D) Gating עבור תאים שליליים של DAPI כדי להוציא תאים מתים. (E) Gating עבור תאיםגבוהים Fluozin-3-AM לבחירה עבור β-תאים. (F) תוכנית Gating לצביעת MtPhagy לזיהוי אוכלוסיות תאיםMtPhagy גבוהות ו-MtPhagy נמוכות. (G) תוכנית Gating עבור TMRE לזיהוי אוכלוסיות תאיםגבוהות TMREו-TMRE נמוכות. (H) תוכנית רביע gating שנקבעה עם איי RFD לא מטופלים כדי לזהות תאיםנמוכים מסוג FluozinhighMtPhagyHighTMRE ברביע 3 (Q3) כתאי β העוברים מיטופגיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: הערכת הבדלי שטף מיטופגיה בתאי β עכברים בעקבות עקה מטבולית באמצעות סכמת MtPhagy gating. תרשימי ציטומטריה של זרימה מייצגת של (A) תאי RFD β לא מטופלים, (B) תאי β HFD לא מטופלים, (C) תאי RFD RF β D שנחשפו לולינומיצין, ו-(D) תאי HFD β שנחשפו לוואלינומיצין. (E) כימות שטף המיטופגי בתאי β, המחושב באמצעות יחסבין תאי MtPhagyHighTMRE נמוכים שנחשפו לוואלינומיצין לבין תאי MtPhagyHighTMREנמוכים שלא נחשפו לוואלינומיצין, הן עבור דגימות RFD והן עבור דגימות HFD. *p < 0.05 על ידי מבחן t לא מזווג של סטודנט. n = 3/קבוצה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: סכימת Gating לשיטת mt-Keima והשוואה בין שתי השיטות. (A) תרשים זרימה המציג סכימת gating לבחירה עבור כל התאים. (B) Gating לבחירה עבור סינגלים בהתבסס על FSC-H לעומת . FSC-W ו- (C) SSC-H לעומת SSC-W. (D) Gating עבור תאים שליליים של DAPI כדי להוציא תאים מתים. (E) Gating עבור תאיםגבוהים Fluozin-3-AM לבחירה עבור β-תאים. (F) חלקות ציטומטריה של זרימה מייצגת של mt-Keima/+ תאים לא מטופלים ו-(G) mt-Keima/+ תאים שנחשפו לולינומיצין. (H) כימות שטף מיטופגיה בתאי β מעכברים שניזונו מ-RFD, שחושב באמצעות יחס בין התאים החומציים/ניטרליים שנחשפו לוואלינומיצין לבין היחס בין התאים החומציים/ניטרליים שלא נחשפו לוואלינומיצין בשיטת mt-Keima והושווה לשיטת MtPhagy (נתונים עבור פרוטוקול MtPhagy שהוצגו במקור באיור 2E). n = 3/קבוצה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקול זה תיאר שתי שיטות משלימות לכימות שטף מיטופגיה באיים עכבריים ראשוניים מנותקים. בשיטת mt-Keima כומתה עלייה במיטופגיה כיחס מוגבר של תאים חומציים (561 ננומטר)/ניטרליים (405 ננומטר), ואילו בשיטת MtPhagy כומתה שטף מיטופגיה מוגבר כגידול באוכלוסייתהתאים הגבוהה MtPhagyHighTMRE. שיטות אלה מאפשרות הערכות מהירות, כמותיות וספציפיות לתאים β של שטף המיטופגיה.

שתי השיטות הן גישות פשוטות. עם זאת, שלבים מסוימים בפרוטוקול זה חיוניים להשגת תוצאות איכותיות וניתנות לשחזור. צעדים אלה כוללים: (1) דיסוציאציה נכונה של איון כדי להשיג השעיה של תא בודד, אך מתונה מספיק כדי להבטיח את קיום האיון, (2) ביסוס זהיר של גאטינג כדי לזהות נכונה אוכלוסיות מעניינות, ו-(3) כימות אובייקטיבי של נתוני ציטומטריית זרימה באמצעות כלי תוכנה כדי להבטיח הערכה בלתי משוחדת של שטף המיטופגיה.

בעת בחירת השיטה שבה להשתמש, יש לקחת בחשבון את סוג התא ואת אופי המודלים הגנטיים המשמשים. שיטת mt-Keima, המשמשת in vivo או transfected in vitro, היא שיטה מצוטטת מאוד ונחשבת להערכת מיטופגיה על ידי ציטומטריית זרימה או הדמיה של תאים חיים21. בעוד ששיטת MtPhagy מבוססת הצבע היא גישה חדשה יותר בהשוואה לכתבים גנטיים, ישנם מקרים שבהם השימוש בה עשוי להיות מועדף על פני mt-Keima. ואכן, שיטת MtPhagy מתגברת על הצורך בטרנספקציה או בתוכניות רבייה מורכבות, והצבעת MtPhagy אורכת 30 דקות בלבד ומבוצעת מיד לפני ציטומטריית הזרימה. ניתן ליישם בהצלחה את גישת MtPhagy גם בדגימות איים אנושיים ראשוניים קשים להדבקה. פרוטוקול זה, המסתמך על צבעים מיטוכונדריאליים רגישים ל-pH או על בדיקות למדידה ישירה של מיטופגיה, שונה מגישה קודמת של Mauro-Lizcano et. al שהשתמש בצבע MitoTracker Deep Red רגיש פוטנציאלי לממברנה ודרש שימוש במעכבי מיטופגיה וליזוזומליים כדי לכמת שטף מיטופגיה על ידי ציטומטריית זרימה22. כמו Mauro-Lizcano et. שיטת al לא נבדקה באיונים, קשה להשוות אותה ישירות ליעילות של שיטות MtPhagy או mt-Keima המתוארות כאן. יחד, השילוב של שיטות אלה מספק בסך הכל מספר גדל והולך של אפשרויות להעריך בקפדנות שטף מיטופגיה בבדיקות כמותיות ביותר של תאים בודדים חיים.

חסרון עבור שתי השיטות הוא חוסר תאימות שלהם עם קיבוע התא. למרות ששתי השיטות תואמות לגישות הדמיה של תאים חיים, קיבוע התא מפריע לשיפוע ה- pH של MtPhagy ו- mt-Keima על פני הממברנה הליזוזומלית 7,16. כחלופה, השימוש בכתב מיטופגיה מיטו-QC בדגימות קבועות שימש בעבר7. בנוסף, מגבלה עבור שתי השיטות היא הצורך לנתק איים לפני ציטומטריית זרימה, אשר עשוי להשפיע על כדאיות התא. לכן, קריטי להכתים תאים עם DAPI כדי לפקח על כדאיות התא לאחר דיסוציאציה של איון ולהבטיח שכל הדגימות מטופלות באופן עקבי. לאחר צביעת DAPI, הדגימות הכילו בממוצע 12.7% ±-7.4 תאים מתים (איור 1D), מה שמצביע על כך ש->80% מהתאים בכל דגימה יכולים לשמש לניתוח. ניטור של כדאיות התא בכל שלב (לאחר בידוד איונים, תרבית, ולאחר מכן דיסוציאציה) עשוי להיות שימושי גם כדי לקבל ידע על הישרדות התא בכל שלב של ההליך. שונות בתזמון בין בידוד איונים ודיסוציאציה של תא בודד עשויה גם היא להשפיע על כדאיות התא ותוצאותיו. לכן, מומלץ לשמור על עקביות בתזמון בכל הניסויים.

מכיוון שבקרת איכות מיטוכונדריאלית היא קריטית לבריאות ולתפקוד β של תאים, הערכות קפדניות של מיטופגיה באמצעות גישות ביוכימיות או דימות מסורתיות (כולל תחלופה של חלבוני הממברנה החיצונית של המיטוכונדריה, לוקליזציה של המיטוכונדריה לאוטופגוזומים או ליזוזומים, ומיקרוסקופ אלקטרונים) יכולות להיות מאתגרות וגוזלות זמן. לכן, פיתוח מערכות דיווח מיטופגיות יעילות וחזקות הוא קריטי. הן גישת mt-Keima והן גישת MtPhagy יעילות ומאפשרות הערכות כמותיות של שטף המיטופגיה. שתי טכניקות אלה מאפשרות גמישות ודיוק בטיפול בבקרת איכות מיטוכונדריאלית של תאי β ובחקירת אינטראקציות בין אברונים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

SAS קיבלה מימון מענקים מחברת Ono Pharmaceutical Co., Ltd. והיא יועצת עבור Novo Nordisk.

Acknowledgments

א.ל-ד. מאשר תמיכה מה-NIH (T32-AI007413 ו-T32-AG000114). SAS מודה על תמיכתם של JDRF (COE-2019-861), NIH (R01 DK135268, R01 DK108921, R01 DK135032, R01 DK136547, U01 DK127747), המחלקה לענייני חיילים משוחררים (I01 BX004444), משפחת ברהם ומשפחת אנתוני.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibiotic-Antimycotic Life Technologies 15240-062
Attune NxT Flow Cytometer Thermofisher Scientific A24858
Dimethyl Sulfoxide Sigma-Aldrich 317275
Fatty Acid Free heat shock BSA powder Equitech BAH66
Fetal bovine serum Gemini Bio 900-108
Fluozin-3AM  Thermofisher Scientific  F24195 100 μg Fluozin-3AM powder reconstituted in 51 μL DMSO and 51 μL Pluronic F-127 to reach 1 mM stock. 
Gibco RPMI 1640 Medium Fisher Scientific 11-875-093
HEPES (1M) Life Technologies 15630-080
MtPhagy dye Dojindo MT02-10 5 μg MtPhagy powder reconstituted with 50 μL DMSO to reach 100 μM stock. 
MtPhagy dye Dojindo MT02-10
Penicillin-Streptomycin (100x) Life Technologies 15140-122 1x Solution used in procotol by diluting 1:10 in ddH2O
Phosphate buffered saline, 10x Fisher Scientific BP399-20 1x Solution used in procotol by diluting 1:10 in ddH2O
Sodium Pyruvate (100x) Life Technologies 11360-070 5 μg MtPhagy powder reconstituted with 50 μL DMSO to reach 100 μM stock. 
TMRE [Tetramethylrhodamine, ethyl ester, perchlorate] Anaspec AS-88061 TMRE powder reconstituted in DMSO to reach 100 μM stock.
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Thermofisher Scientific 25300054
Valinomycin Sigma V0627 Valinomycin powder reconsituted in DMSO to reach 250 nM stock.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kaufman, B. A., Li, C., Soleimanpour, S. A. Mitochondrial regulation of β-cell function: maintaining the momentum for insulin release. Molecular Aspects of Medicine. 42, 91-104 (2015).
  2. Soleimanpour, S. A., et al. The diabetes susceptibility gene Clec16a regulates mitophagy. Cell. 157 (7), 1577-1590 (2014).
  3. Pearson, G., et al. Clec16a, Nrdp1, and USP8 form a ubiquitin-dependent tripartite complex that regulates β-cell mitophagy. Diabetes. 67 (2), 265-277 (2018).
  4. Hattori, N., Saiki, S., Imai, Y. Regulation by mitophagy. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 53, 147-150 (2014).
  5. Berezhnov, A. V., et al. Intracellular pH modulates autophagy and mitophagy. Journal of Biological Chemistry. 291 (16), 8701-8708 (2016).
  6. Sun, N., et al. Measuring in vivo mitophagy. Molecular Cell. 60 (4), 685-696 (2015).
  7. McWilliams, T. G., et al. mito-QC illuminates mitophagy and mitochondrial architecture in vivo. Journal of Cell Biology. 214 (3), 333-345 (2016).
  8. Aoyagi, K., et al. A new beta cell-specific mitophagy reporter mouse shows that metabolic stress leads to accumulation of dysfunctional mitochondria despite increased mitophagy. Diabetologia. 66 (1), 147-162 (2023).
  9. Ma, X., Ding, W. X. A fluorescence imaging based-assay to monitor mitophagy in cultured hepatocytes and mouse liver. Liver Research. 5 (1), 16-20 (2021).
  10. Sidarala, V., et al. Mitophagy protects β cells from inflammatory damage in diabetes. JCI Insight. 5 (24), 141138 (2020).
  11. Gingerich, M. A., et al. An intrinsically disordered protein region encoded by the human disease gene CLEC16A regulates mitophagy. Autophagy. 19 (2), 525-543 (2023).
  12. Sun, N., Malide, D., Liu, J., Rovira, I. I., Combs, C. A., Finkel, T. A fluorescence-based imaging method to measure in vitro and in vivo mitophagy using mt-Keima. Nature Protocols. 12 (8), 1576-1587 (2017).
  13. Zhao, J., Bertoglio, B. A., Gee, K. R., Kay, A. R. The zinc indicator FluoZin-3 is not perturbed significantly by physiological levels of calcium or magnesium. Cell Calcium. 44 (4), 422-426 (2008).
  14. Da Silva Xavier, G. The Cells of the Islets of Langerhans. Journal of Clinical Medicine. 7 (3), 54 (2018).
  15. Thapa, B., et al. Imaging β-cell function using a zinc-responsive MRI contrast agent may identify first responder islets. Frontiers in Endocrinology. 12, 809867 (2022).
  16. Iwashita, H., et al. Live cell imaging of mitochondrial autophagy with a novel fluorescent small molecule. ACS Chemical Biology. 12 (10), 2546-2551 (2017).
  17. Crowley, L. C., Christensen, M. E., Waterhouse, N. J. Measuring mitochondrial transmembrane potential by TMRE staining. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (12), 087361 (2016).
  18. Klein, B., Wörndl, K., Lütz-Meindl, U., Kerschbaum, H. H. Perturbation of intracellular K(+) homeostasis with valinomycin promotes cell death by mitochondrial swelling and autophagic processes. Apoptosis. 16 (11), 1101-1117 (2011).
  19. Ji, Y., et al. Toll-like receptors TLR2 and TLR4 block the replication of pancreatic β cells in diet-induced obesity. Nature Immunology. 20 (6), 677-686 (2019).
  20. Sauvat, A., et al. Quantification of cellular viability by automated microscopy and flow cytometry. Oncotarget. 6 (11), 9467-9475 (2015).
  21. Liu, Y. T., et al. Mt-Keima detects PINK1-PRKN mitophagy in vivo with greater sensitivity than mito-QC. Autophagy. 17 (11), 3753-3762 (2021).
  22. Mauro-Lizcano, M., et al. New method to assess mitophagy flux by flow cytometry. Autophagy. 11 (5), 833-843 (2015).

Tags

שטף מיטופגיה תאי β של הלבלב גישות משלימות כתבים גנטיים מודל עכבר Mt-Keima כימות מיטופגיה ציטומטריית זרימה בדיקה ביחס עירור כפול רגישה ל-PH פליטת אורכי גל חומציים לניטרליים Mt-Keima מדווחי מיטופגיה גנטית מודלים גנטיים של עכברים תאים קשים להעברה איים אנושיים ראשוניים שיטה מבוססת צבע MtPhagy צבע חדיר לתאים ליזוזומים במהלך מיטופגיה פלוזין-3-AM מחוון Zn2+ טטרמתילרודאמין אתיל אסטר (TMRE) פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית
גישות משלימות לחקירת שטף מיטופגיה בתאי β הלבלב
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Levi-D’Ancona, E., Sidarala,… More

Levi-D’Ancona, E., Sidarala, V., Soleimanpour, S. A. Complementary Approaches to Interrogate Mitophagy Flux in Pancreatic β-Cells. J. Vis. Exp. (199), e65789, doi:10.3791/65789 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter