Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

अग्नाशयी β-कोशिकाओं में माइटोफैगी फ्लक्स से पूछताछ करने के लिए पूरक दृष्टिकोण

Published: September 15, 2023 doi: 10.3791/65789
Automatic Translation
1,2, 1, 1,3,4
1Department of Internal Medicine, Division of Metabolism, Endocrinology and Diabetes, University of Michigan, Ann Arbor, 2Graduate Program in Immunology, University of Michigan Medical School, 3Department of Molecular and Integrative Physiology, University of Michigan, Ann Arbor, 4VA Ann Arbor Healthcare System

Summary

यह प्रोटोकॉल अग्नाशयी β-कोशिकाओं में माइटोफैगी के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए दो तरीकों की रूपरेखा तैयार करता है: पहला, सेल-पारगम्य माइटोकॉन्ड्रिया-विशिष्ट रंगों का संयोजन, और दूसरा, एक आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड माइटोफैगी रिपोर्टर। ये दो तकनीकें पूरक हैं और विशिष्ट आवश्यकताओं के आधार पर तैनात की जा सकती हैं, जिससे माइटोकॉन्ड्रियल गुणवत्ता नियंत्रण को मात्रात्मक रूप से संबोधित करने में लचीलापन और सटीकता की अनुमति मिलती है।

Abstract

माइटोफैगी एक गुणवत्ता नियंत्रण तंत्र है जो इष्टतम माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन को बनाए रखने के लिए आवश्यक है। डिसफंक्शनल β-सेल माइटोफैगी के परिणामस्वरूप अपर्याप्त इंसुलिन रिलीज होता है। माइटोफैगी के उन्नत मात्रात्मक आकलन के लिए अक्सर आनुवंशिक पत्रकारों के उपयोग की आवश्यकता होती है। एमटी-कीमा माउस मॉडल, जो प्रवाह साइटोमेट्री के माध्यम से माइटोफैगी की मात्रा निर्धारित करने के लिए माइटोकॉन्ड्रिया-लक्षित पीएच-संवेदनशील दोहरी-उत्तेजना अनुपातमितीय जांच को व्यक्त करता है, को β-कोशिकाओं में अनुकूलित किया गया है। अम्लीय-से-तटस्थ mt-Keima तरंग दैर्ध्य उत्सर्जन के अनुपात का उपयोग माइटोफैगी को मजबूती से निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। हालांकि, जटिल आनुवंशिक माउस मॉडल या मुश्किल-से-ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं, जैसे प्राथमिक मानव आइलेट्स के साथ काम करते समय आनुवंशिक माइटोफैगी पत्रकारों का उपयोग करना चुनौतीपूर्ण हो सकता है। यह प्रोटोकॉल MtPhagy का उपयोग करके प्राथमिक आइलेट्स में β-सेल माइटोफैगी की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक उपन्यास पूरक डाई-आधारित विधि का वर्णन करता है। MtPhagy एक पीएच-संवेदनशील, सेल-पारगम्य डाई है जो माइटोकॉन्ड्रिया में जमा होती है और इसकी प्रतिदीप्ति तीव्रता बढ़ जाती है जब माइटोकॉन्ड्रिया कम पीएच वातावरण में होते हैं, जैसे कि माइटोफैगी के दौरान लाइसोसोम। Fluozin-3-AM के साथ MtPhagy डाई के संयोजन से, एक Zn2+ संकेतक जो β-कोशिकाओं के लिए चयन करता है, और टेट्रामेथिलरोडामाइन, एथिल एस्टर (TMRE) माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता का आकलन करने के लिए, माइटोफैगी फ्लक्स को विशेष रूप से प्रवाह साइटोमेट्री के माध्यम से β-कोशिकाओं में निर्धारित किया जा सकता है। ये दो दृष्टिकोण अत्यधिक पूरक हैं, जो कई β-सेल मॉडल में माइटोकॉन्ड्रियल गुणवत्ता नियंत्रण का आकलन करने में लचीलेपन और सटीकता की अनुमति देते हैं।

Introduction

अग्नाशयी β-कोशिकाएं चयापचय मांगों को पूरा करने के लिए इंसुलिन का उत्पादन और स्राव करती हैं, और β-सेल डिसफंक्शन टाइप 1 और टाइप 2 मधुमेह दोनों में हाइपरग्लाइसेमिया और मधुमेह की शुरुआत के लिए जिम्मेदार है। β-कोशिकाएं माइटोकॉन्ड्रियल ऊर्जावान और चयापचय उत्पादन के माध्यम से इंसुलिन स्राव के साथ ग्लूकोज चयापचय को जोड़ती हैं, जो कार्यात्मक माइटोकॉन्ड्रियल द्रव्यमान 1,2,3 के रिजर्व पर निर्भर करती हैं। इष्टतम β-सेल फ़ंक्शन को बनाए रखने के लिए, β-कोशिकाएं वृद्ध या क्षतिग्रस्त माइटोकॉन्ड्रिया को हटाने और कार्यात्मक माइटोकॉन्ड्रियल द्रव्यमानको संरक्षित करने के लिए माइटोकॉन्ड्रियल गुणवत्ता नियंत्रण तंत्र पर भरोसा करती हैं। चयनात्मक माइटोकॉन्ड्रियल ऑटोफैगी, जिसे माइटोफैगी के रूप में भी जाना जाता है, माइटोकॉन्ड्रियल गुणवत्ता नियंत्रण मार्ग का एक प्रमुख घटक है।

जीवित कोशिकाओं में माइटोफैगी का आकलन अक्सर माइटोकॉन्ड्रियल पीएच में परिवर्तन पर निर्भर करता है जो माइटोफैगी के दौरान होता है। माइटोकॉन्ड्रिया में थोड़ा क्षारीय पीएच होता है, और स्वस्थ माइटोकॉन्ड्रिया सामान्य रूप से पीएच-तटस्थ साइटोसोल में रहते हैं। माइटोफैगी के दौरान, क्षतिग्रस्त या शिथिल माइटोकॉन्ड्रिया को चुनिंदा रूप से ऑटोफैगोसोम में शामिल किया जाता है और अंततः अम्लीय लाइसोसोमके भीतर साफ किया जाता है। विवो ट्रांसजेनिक माइटोफैगी रिपोर्टर माउस मॉडल में कई, जैसे एमटी-कीमा6, माइटोक्यूसी7, और सीएमएमआर8, साथ ही ट्रांसफेक्टेबल माइटोफैगी जांच, जैसे कि कॉक्स 8-ईजीएफपी-एमचेरी प्लास्मिड9, माइटोफैगी के मात्रात्मक आकलन प्रदान करने के लिए इस पीएच परिवर्तन का उपयोग करते हैं। एमटी-कीमा पीएच-संवेदनशील दोहरी-उत्तेजना अनुपातमितीय जांच को व्यक्त ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग प्रवाह साइटोमेट्री10,11के माध्यम से आइलेट्स और β-कोशिकाओं में माइटोफैगी आकलन के लिए अनुकूलित किया गया है। अम्लीय-से-तटस्थ एमटी-कीमा तरंग दैर्ध्य उत्सर्जन (अम्लीय 561 एनएम से तटस्थ 480 एनएम उत्तेजना का अनुपात) का अनुपात माइटोफैगी 6,12 को मजबूती से निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

यह प्रोटोकॉल प्राथमिक आइलेट्स और β-कोशिकाओं में माइटोफैगी प्रवाह का आकलन करने के लिए एक अनुकूलित दृष्टिकोण का वर्णन करता है जो एमटी-कीमा ट्रांसजेनिक चूहों 10,11से अलग है। जबकि एमटी-कीमा एक अत्यधिक संवेदनशील जांच है, इसके लिए या तो जटिल पशु प्रजनन योजनाओं या कोशिकाओं के अभिकर्मक की आवश्यकता होती है, जो अक्सर अन्य आनुवंशिक मॉडल या प्राथमिक मानव आइलेट्स के साथ संयोजन में काम करते समय चुनौतीपूर्ण हो सकते हैं। इसके अतिरिक्त, तटस्थ और अम्लीय सेल आबादी की पहचान करने के लिए कई प्रतिदीप्ति लेज़रों और डिटेक्टरों का उपयोग अन्य फ्लोरोसेंट पत्रकारों के दहनशील उपयोग को सीमित कर सकता है।

इन चुनौतियों पर काबू पाने के लिए, इस प्रोटोकॉल भी एक पूरक, एकल फ्लोरोसेंट चैनल, अलग माउस आइलेट्स से β कोशिकाओं में mitophagy के मजबूत पता लगाने के लिए डाई आधारित विधि का वर्णन करता है. यह दृष्टिकोण, जिसे MtPhagy विधि के रूप में संदर्भित किया जाता है, β-कोशिकाओं के लिए चयन करने के लिए तीन सेल-पारगम्य रंगों के संयोजन का उपयोग करता है, सक्रिय रूप से माइटोफैगी से गुजरने वाली सेल आबादी की मात्रा निर्धारित करता है, और एक साथ माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता (MMP या Δψm) का आकलन करता है।

इन रंगों में से पहला फ्लोज़िन-3-एएम है, जो एक सेल-पारगम्य Zn2+ संकेतक है जिसमें Ex/Em 494/516 nm13 है। माउस आइलेट्स में कार्यात्मक रूप से अलग-अलग कोशिकाओं की एक विषम आबादी शामिल है, जिसमें α-, β-, δ- और पीपी कोशिकाएं शामिल हैं। β-कोशिकाओं माउस आइलेट के भीतर कोशिकाओं के लगभग 80% शामिल हैं और इंसुलिन कणिकाओं14,15 के भीतर उनके उच्च Zn2+ एकाग्रता के कारण अन्य आइलेट सेल प्रकार से अलग किया जा सकता है, Fluozin-3 AMउच्च आबादी के रूप में β कोशिकाओं की पहचान के लिए अनुमति देता है. MtPhagy डाई, एक पीएच संवेदनशील डाई है कि एक रासायनिक बंधन के माध्यम से mitochondria पर immobilized है और कमजोर प्रतिदीप्ति का उत्सर्जन करता है, भी इस प्रोटोकॉल16 में प्रयोग किया जाता है. माइटोफैगी प्रेरण पर, क्षतिग्रस्त माइटोकॉन्ड्रिया को अम्लीय लाइसोसोम में शामिल किया जाता है, और MtPhagy डाई कम पीएच वातावरण (Ex/Em 561/570-700 nm) के भीतर इसकी प्रतिदीप्ति तीव्रता को बढ़ाती है।

इसके अतिरिक्त, टेट्रामेथिलरोडामाइन, एथिल एस्टर (टीएमआरई), का उपयोग एमएमपी का आकलन करने के लिए किया जाता है। टीएमआरई एक सेल-पारगम्य सकारात्मक चार्ज डाई (पूर्व / ईएम 552/575 एनएम) है जो स्वस्थ माइटोकॉन्ड्रिया द्वारा अनुक्रमित है क्योंकि उनके झिल्ली क्षमता17 द्वारा बनाए गए सापेक्ष नकारात्मक चार्ज के कारण। क्षतिग्रस्त या अस्वास्थ्यकर माइटोकॉन्ड्रिया उनकी झिल्ली क्षमता को नष्ट कर देते हैं, जिसके परिणामस्वरूप टीएमआरई को अनुक्रमित करने की क्षमता कम हो जाती है। इन रंगों का एक साथ उपयोग करते हुए, माइटोफैगी से गुजरने वाली β-कोशिकाओं को फ्लोटिन साइटोमेट्री के माध्यम से फ्लुओज़िनउच्चएमटीफैगीउच्चटीएमआरईकम आबादी के रूप में पहचाना जा सकता है। चूंकि माइटोफैगी स्थैतिक प्रक्रिया के बजाय एक गतिशील है, इसलिए इस प्रोटोकॉल को वैलिनोमाइसिन का उपयोग करके माइटोफैगी फ्लक्स का आकलन करने के लिए अनुकूलित किया गया था, एक के +-आयनोफोर जो एमएमपी18 के अपव्यय के बाद माइटोफैगी को प्रेरित करता है। वैलिनोमाइसिन की उपस्थिति और अनुपस्थिति में माइटोफैगी की तुलना विभिन्न नमूना समूहों में माइटोफैगी प्रवाह के आकलन की अनुमति देती है।

वर्तमान दृष्टिकोण की डाई-आधारित प्रकृति इसे मानव आइलेट्स और अन्य कठिन-से-ट्रांसफ़ेक्ट सेल प्रकारों के लिए एक्सट्रपलेशन करने की अनुमति देती है और एमटी-कीमा प्रोटोकॉल के विपरीत, जटिल पशु प्रजनन योजनाओं की आवश्यकता को दरकिनार करती है। इस प्रोटोकॉल का व्यापक लक्ष्य दो स्वतंत्र प्रवाह साइटोमेट्री-आधारित विधियों के माध्यम से एकल-कोशिका स्तर पर β-कोशिकाओं में माइटोफैगी की मात्रा निर्धारित करना है। एक साथ लिया, इस प्रोटोकॉल दो शक्तिशाली और पूरक तरीकों है कि दोनों परिशुद्धता और माइटोकॉन्ड्रियल गुणवत्ता नियंत्रण के मात्रात्मक अध्ययन में लचीलापन के लिए अनुमति का वर्णन करता है.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत पशु अध्ययन की समीक्षा की और मिशिगन संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति के विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया. बीस सप्ताह के पुरुष C57BL/6J चूहों, या तो 15 सप्ताह के नियमित वसा वाले आहार (RFD) या उच्च वसा वाले आहार (HFD) पर, इस अध्ययन के लिए उपयोग किए गए थे।

1. डाई-आधारित MtPhagy दृष्टिकोण के माध्यम से माइटोफैगी का आकलन (विधि 1)

  1. माउस आइलेट तैयारी और उपचार
    1. नीचे दिए गए चरणों का पालन आइलेट संस्कृति और valinomycin जोखिम प्रदर्शन.
      1. या तो नियमित वसा आहार (आरएफडी) या उच्च वसा वाले आहार (एचएफडी, 60 किलो कैलोरी% वसा19) चूहों से अलग आइलेट, पहले वर्णित तरीकों 2,10 के बाद।
      2. संस्कृति आइलेट नमूने आरपीएमआई माध्यम में 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात 100 इकाइयों / एमएल antimycotic-एंटीबायोटिक, 50 इकाइयों / एमएल पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन, 1 मिमी सोडियम pyruvate, 10 मिमी HEPES और 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) ( सामग्री की तालिकादेखें) के साथ पूरक. इस माध्यम को "आइलेट माध्यम" के रूप में संदर्भित किया जाएगा।
      3. एक विंदुक का प्रयोग, आइलेट माध्यम के 2 एमएल में 6 सेमी पेट्री व्यंजन में हालत प्रति 100 टापू उठाओ.
        नोट: इस प्रोटोकॉल के लिए उपयोग की जाने वाली शर्तें: (1) बेदाग नियंत्रण: बिना दाग वाले आरएफडी आइलेट; (2) DAPI केवल नियंत्रण: DAPI के साथ दाग वाले RFD आइलेट; (3) फ्लोज़िन-3-एएम केवल नियंत्रण: आरएफडी आइलेट्स फ्लोज़िन-3-एएम के साथ दाग; (4) MtPhagy केवल नियंत्रण: MtPhagy के साथ दाग आरएफडी आइलेट; (5) टीएमआरई केवल नियंत्रण: टीएमआरई के साथ दाग वाले आरएफडी आइलेट; (6) आरएफडी अनुपचारित: आरएफडी आइलेट्स एमटीफैगी, टीएमआरई, फ्लुओज़िन -3-एएम और डीएपीआई के साथ दाग; (7) वैलिनोमाइसिन-उजागर आरएफडी आइलेट्स: आरएफडी आइलेट्स वैलिनोमाइसिन के संपर्क में आते हैं और एमटीफैगी, टीएमआरई, फ्लोज़िन -3-एएम और डीएपीआई के साथ दाग होते हैं; (8) HFD अनुपचारित: MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM, और DAPI के साथ दाग वाले HFD आइलेट; (9) वैलिनोमाइसिन-उजागर एचएफडी आइलेट्स: एचएफडी आइलेट्स वैलिनोमाइसिन के संपर्क में आते हैं और एमटीफैगी, टीएमआरई, फ्लोज़िन -3-एएम और डीएपीआई के साथ दाग देते हैं।
      4. वैलिनोमाइसिन के संपर्क में आने वाली स्थितियों (7) और (9) (ऊपर नोट देखें) के लिए, माइटोफैगी को प्रेरित करने के लिए 3 घंटे के लिए पेट्री डिश में आइलेट्स में 250 nΜ वैलिनोमाइसिन स्टॉक ( सामग्री की तालिका देखें) के 2 माइक्रोन जोड़ें।
    2. एकल कक्ष पृथक्करण करें।
      1. 3 घंटे valinomycin जोखिम के बाद, एक विंदुक का उपयोग कर अलग microcentrifuge ट्यूबों में प्रत्येक हालत से 100 टापू उठाओ.
      2. 10 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिन के लिए 350 x ग्राम पर आइलेट्स स्पिन करें और एक विंदुक का उपयोग करके सतह पर तैरनेवाला को त्याग दें।
      3. प्रत्येक धोने के बीच स्पिन चरणों (350 x ग्राम/1 मिनट, 10 डिग्री सेल्सियस) के साथ 1 एमएल 1x फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के साथ नमूने 2x धो लें। प्रत्येक धोने के बाद एक विंदुक के साथ सतह पर तैरनेवाला त्यागें.
      4. एकल कोशिकाओं में आइलेट्स को अलग करने के लिए, आइलेट्स के अति-पाचन को रोकने के लिए एक नमूने के माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 0.05% ट्रिप्सिन (37 डिग्री सेल्सियस तक पूर्व-गर्म) के 500 माइक्रोन जोड़ें। पिपेट ऊपर और नीचे बार-बार जब तक टापू स्पष्ट रूप से फैल रहे हैं.
      5. तुरंत पूर्व गर्म आइलेट माध्यम के 1 एमएल जोड़ने के लिए trypsin बेअसर. प्रत्येक नमूने के लिए ट्रिप्सिनाइजेशन और न्यूट्रलाइजेशन दोहराएं, एक समय में एक।
      6. 10 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 500 x ग्राम पर नमूने स्पिन करें। एक विंदुक के साथ सतह पर तैरनेवाला निकालें, गोली परेशान नहीं सावधान करें.
        नोट: गोली valinomycin के संपर्क में नमूने के लिए नाजुक हो जाएगा.
      7. RPMI माध्यम के साथ नमूने 2x धोएं, कोई फिनोल लाल नहीं, 100 इकाइयों / एमएल एंटीमायोटिक-एंटीबायोटिक, 50 इकाइयों / एमएल पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन, 1 मिमी सोडियम पाइरूवेट, 10 मिमी HEPES, और 10% गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (बीएसए) के साथ पूरक। इस माध्यम को "आइलेट प्रवाह माध्यम" के रूप में संदर्भित किया जाएगा। प्रत्येक धोने के बीच स्पिन कदम (350 x ग्राम/1 मिनट, 10 डिग्री सेल्सियस) शामिल करें। प्रत्येक धोने के बाद एक विंदुक के साथ सतह पर तैरनेवाला त्यागें.
    3. फ्लो साइटोमेट्री की तैयारी के लिए MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM, और DAPI के साथ दाग कोशिकाएं।
      1. आइलेट प्रवाह माध्यम के 500 माइक्रोन में आइलेट नमूनों को फिर से निलंबित करें।
      2. MtPhagy डाई (शर्तों 4, 6, 7, 8, और 9, चरण 1.1.1 पर ध्यान दें) प्राप्त करने वाली ट्यूबों में 100 माइक्रोन MtPhagy स्टॉक ( सामग्री की तालिकादेखें) के 0.25 माइक्रोन जोड़ें।
      3. टीएमआरई डाई (शर्तों 5, 6, 7, 8, और 9) प्राप्त करने वाली ट्यूबों में 100 माइक्रोन टीएमआरई स्टॉक ( सामग्री की तालिकादेखें) के 0.25 माइक्रोन जोड़ें।
      4. फ्लोज़िन-3-एएम डाई (शर्तों 3, 6, 7, 8, और 9) प्राप्त करने वाली ट्यूबों में 1 एमएम फ्लुओज़िन-3-एएम स्टॉक ( सामग्री की तालिकादेखें) के 0.25 माइक्रोन जोड़ें।
      5. मिश्रण करने के लिए 5 एस के लिए कम गति पर भंवर ट्यूबों.
      6. प्रकाश से बचाने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी में माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों को लपेटें और 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन के माध्यम से आधे रास्ते, मिश्रण करने के लिए 5-10 एस के लिए कम गति पर भंवर ट्यूबों.
      7. इनक्यूबेशन बाद, 10 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए 350 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र नमूने। एक विंदुक का उपयोग सतह पर तैरनेवाला त्यागें.
      8. 500 माइक्रोन आइलेट प्रवाह माध्यम में नमूनों को फिर से निलंबित करें। शर्तों 2, 6, 7, 8 और 9 में 0.2 μg/mL DAPI (सामग्री की तालिका देखें) जोड़ें।
      9. 10 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए 350 x ग्राम पर नमूने स्पिन करें। एक विंदुक का उपयोग सतह पर तैरनेवाला त्यागें और आइलेट प्रवाह माध्यम के 500 माइक्रोन में फिर से निलंबित करें।
      10. बर्फ पर नमूने रखें।
  2. फ्लो साइटोमेट्री
    1. उपकरण को स्टार्टअप करें ( सामग्री की तालिकादेखें)।
      नोट: उपयुक्त फिल्टर के साथ कोई भी प्रवाह साइटोमीटर काम करेगा। इस अध्ययन में निम्नलिखित फिल्टर का उपयोग किया गया था: (1) डीएपीआई के लिए वीएल 1: उत्तेजना/उत्सर्जन - 405 एनएम/440 एनएम (50 एनएम); (2) फ्लोज़िन-3-एएम के लिए बीएल 1: उत्तेजना/उत्सर्जन - 488 एनएम/530 एनएम (30 एनएम); (3) MtPhagy डाई के लिए BL2: उत्तेजना/उत्सर्जन - 488 एनएम/590 एनएम (40 एनएम); (4) टीएमआरई के लिए वाईएल 1: उत्तेजना/उत्सर्जन - 561 एनएम/585 एनएम (16 एनएम)।
    2. सेल आबादी स्कैटर प्लॉट के केंद्र में हैं यह सुनिश्चित करने के लिए फॉरवर्ड (एफएससी) और साइड स्कैटर (एसएससी) के लिए वोल्टेज समायोजित करें। इस प्रोटोकॉल के लिए, उपयोग किए जाने वाले वोल्टेज एफएससी के लिए 120 वी और एसएससी के लिए 260 वी थे ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि कोशिकाएं एफएससी-ए बनाम के भीतर समान रूप से आती हैं। एसएससी-ए प्लॉट (चित्रा 1 ए)।
    3. गैर-एकल कोशिकाओं को बाहर करने के लिए, एफएससी-एच बनाम पर एक आयताकार गेट जोड़ें। एफएससी-डब्ल्यू के बाद एसएससी-एच वी.एस. एसएससी-डब्ल्यू (चित्रा 1 बी, सी)।
    4. लाइव β-कोशिकाओं के लिए फ़िल्टर करने के लिए DAPI के लिए वोल्टेज और क्षतिपूर्ति समायोजित करें। प्रत्येक फ्लोरोफोर के लिए प्रतिदीप्ति फाटकों सेट बेदाग आरएफडी नमूना (आंकड़े 1 डी-एफ) के आधार पर इस्तेमाल किया.
      NOTE: प्रत्येक च्यानलको लागि प्रयोग गरिएको भोल्टेजहरू: (1) VL1: 320-360 V; (2) बीएल 1: 300-340 वी; (3) बीएल 2: 260-300 वी; (4) वाईएल 1: 300-340 वी।
    5. एक बार द्वार स्थापित हो जाने के बाद, प्रति नमूना 10,000 घटनाओं को इकट्ठा करें।
      नोट: इस गेटिंग दृष्टिकोण का उपयोग करते हुए, बेसल शर्तों के तहत माइटोफैगी स्तर और वेलिनोमाइसिन प्रेरण पर आरएफडी और एचएफडी आइलेट्स (चित्रा 2) दोनों में मूल्यांकन किया गया था।
    6. विश्लेषण के लिए FCS फ़ाइलों के रूप में डेटा सहेजें।

2. आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड mt-Keima रिपोर्टर (विधि 2) का उपयोग करके माइटोफैगी का आकलन करना

  1. माउस आइलेट तैयारी और एकल सेल पृथक्करण
    1. नीचे दिए गए चरणों का पालन आइलेट संस्कृति और valinomycin जोखिम प्रदर्शन.
      1. जंगली प्रकार (WT) और mt-Keima/+ (mt-Keima) चूहों से अग्नाशय टापूअलग 6. इस विधि में, 20 सप्ताह के पुरुष WT या mt-Keima/+ खिलाए गए RFD चूहों का उपयोग किया गया था।
      2. आइलेट माध्यम में 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात संस्कृति आइलेट नमूने.
      3. एक विंदुक का प्रयोग, आइलेट माध्यम के 2 एमएल के साथ 6 सेमी पेट्री व्यंजन में हालत प्रति 100 टापू उठाओ.
        नोट: इस प्रोटोकॉल के लिए उपयोग की जाने वाली शर्तें: (1) बेदाग नियंत्रण: बिना दाग वाले WT आइलेट; (2) DAPI केवल नियंत्रण: WT आइलेट्स DAPI के साथ दाग; (3) फ्लोज़िन-3-एएम केवल नियंत्रण: फ्लोज़िन-3-एएम के साथ दाग वाले डब्ल्यूटी आइलेट; (4) एमटी-कीमा केवल नियंत्रण: बिना दाग वाले एमटी-कीमा / + आइलेट्स; (5) अनुपचारित: एमटी-कीमा/+ फ्लोज़िन-3-एएम और डीएपीआई के साथ दाग वाले आइलेट; (6) वैलिनोमाइसिन: एमटी-कीमा/+ आइलेट्स वैलिनोमाइसिन के संपर्क में आते हैं और फ्लुओज़िन-3-एएम और डीएपीआई से सने होते हैं।
      4. वैलिनोमाइसिन एक्सपोजर के साथ स्थिति (6) के लिए, माइटोफैगी को प्रेरित करने के लिए 3 घंटे के लिए पेट्री डिश में आइलेट्स में 250 एनएम वैलिनोमाइसिन स्टॉक के 2 माइक्रोन जोड़ें।
    2. एकल-कोशिका पृथक्करण करें।
      1. एकल कक्ष पृथक्करण चरण निष्पादित करें, जैसा कि चरण 1.1.2 में वर्णित है।
    3. फ्लूज़िन-3-एएम और डीएपीआई के साथ दाग कोशिकाएं।
      1. आइलेट प्रवाह माध्यम के 500 माइक्रोन में आइलेट नमूनों को फिर से निलंबित करें।
      2. Fluozin-3-AM डाई (शर्तों 3, 5, और 6) प्राप्त ट्यूबों के लिए 1 मिमी Fluozin-3 AM स्टॉक के 0.25 माइक्रोन जोड़ें.
      3. 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को सेते हैं और 1.1.3.5-1.3.10 चरणों में वर्णित के रूप में DAPI उपचार के लिए आगे बढ़ना.
  2. फ्लो साइटोमेट्री
    1. साधन को स्टार्ट करें। उपयुक्त फिल्टर के साथ कोई भी फ्लो साइटोमीटर काम करेगा।
      नोट: इस अध्ययन में निम्नलिखित फिल्टर का उपयोग किया गया था: (1) डीएपी के लिए वीएल 1: उत्तेजना/उत्सर्जन - 405 एनएम/440 एनएम (50 एनएम); (2) फ्लोज़िन-3-एएम के लिए बीएल 1: उत्तेजना/उत्सर्जन - 488 एनएम/530 एनएम (30 एनएम); (3) एमटी-कीमा तटस्थ के लिए वीएल 3: उत्तेजना/उत्सर्जन - 405 एनएम/603 एनएम (48 एनएम); (4) एमटी-कीमा एसिड के लिए YL2: उत्तेजना/उत्सर्जन - 561 एनएम/620 एनएम (15 एनएम)।
    2. एफएससी और एसएससी वोल्टेज समायोजित करें और गैर-एकल कोशिकाओं को बाहर करें जैसा कि चरण 1.2.2-1.2.3 (आंकड़े 3 ए-सी) में वर्णित है।
    3. वोल्टेज और DAPI के लिए मुआवजे को समायोजित करें, Fluozin-3 AM और mt-Keima बेदाग और एकल सकारात्मक नियंत्रण (शर्तों 1-4) का उपयोग यह सुनिश्चित करने के लिए कि प्रतिदीप्ति सकारात्मक सेल आबादी बेदाग कोशिकाओं से अलग कर रहे हैं. एक बार प्रत्येक चैनल के लिए उचित मुआवजा लागू किया गया है, डीएपीआई नकारात्मक गेट और Fluozin-3 AM सकारात्मक गेट्स लाइव β कोशिकाओं (आंकड़े 3 डी-ई) के लिए फिल्टर करने के लिए स्थापित करें.
    4. अम्लीय और तटस्थ सेल आबादी(चित्रा 3एफ)की पहचान करने के लिए एमटी-कीमा पॉजिटिव नमूना (शर्त 4) का उपयोग करके एक त्रिकोण गेटिंग योजना स्थापित करें।
      नोट: वोल्टेज आमतौर पर प्रत्येक चैनल के लिए उपयोग किया जाता है: (1) वीएल 1: 320-340 वी; (2) बीएल 2: 260-280 वी; (3) वीएल 3: 280-300 वी; (4) वाईएल 2: 280-300 वी।
    5. एक बार द्वार स्थापित हो जाने के बाद, प्रति नमूना 10,000 घटनाओं को इकट्ठा करें। शर्तों 5 और 6 के लिए गेटिंग योजनाओं चित्रा 3 ए-जी में सचित्र हैं.
    6. विश्लेषण के लिए FCS फ़ाइलों के रूप में डेटा सहेजें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

डाई-आधारित MtPhagy दृष्टिकोण के माध्यम से माइटोफैगी का आकलन करना
इस डाई-आधारित दृष्टिकोण को मृत कोशिकाओं को बाहर करने के लिए फ्लुओज़िन -3-एएम, टीएमआरई और एमटीफैगी के साथ-साथ डीएपीआई का उपयोग करके आनुवंशिक रिपोर्टर की आवश्यकता के बिना प्राथमिक माउस β-कोशिकाओं के भीतर माइटोफैगी प्रवाह का विश्लेषण करने के लिए अनुकूलित किया गया था। माइटोफैगी को प्रेरित करने के लिए वैलिनोमाइसिन के साथ इन रंगों को जोड़कर, यह प्रोटोकॉल प्राथमिक माउस β-कोशिकाओं18 में माइटोफैगी फ्लक्स को चुनिंदा रूप से मापने के लिए एक डाई-आधारित विधि की रूपरेखा तैयार करता है। इस MtPhagy विधि का उपयोग करके दिखाए गए आंकड़ों के लिए, बेसल और वैलिनोमाइसिन-प्रेरित माइटोफैगी दोनों का विश्लेषण नियमित वसा आहार (RFD) या उच्च वसा वाले आहार (HFD, 60 kcal% वसा) से अलग आइलेट्स में किया गया था, जो माइटोफैगी प्रवाह पर चयापचय तनाव के प्रभाव का आकलन करने के लिए चूहों को खिलाया गया था। ब्याज की आबादी की पहचान करने के लिए, कोशिकाओं अनुपचारित आरएफडी आइलेट्स का उपयोग कर gated थे. एफएससी और एसएससी वोल्टेज को पहले एसएससी-ए बनाम एफएससी-ए प्लॉट(चित्रा 1ए)पर कोशिकाओं का एक समान वितरण प्राप्त करने के लिए समायोजित किया गया था। एकल कोशिकाओं के लिए चयन करने के लिए, दोनों एफएससी-एच वी.एस. एफएससी-डब्ल्यू और एसएससी-एच बनाम एसएससी-डब्ल्यू भूखंडों का उपयोग किया गया था, जहां मल्टीपलेट्स को एकल कोशिकाओं(चित्रा 1बी,सी)की तुलना में उनके उच्च चौड़ाई संकेत मूल्यों के कारण बाहर रखा गया था। अगला, डीएपीआई नकारात्मक कोशिकाओं मृत कोशिकाओं20 (चित्रा 1 डी) को बाहर करने के लिए चुना गया था. प्राथमिक फाटकों की स्थापना के बाद, एकल सना हुआ नियंत्रण फ्लोज़िन-3-एएम, एमटीफैगी, और टीएमआरई(चित्रा 1ई-जी)के साथ-साथ बहु-रंग प्रतिदीप्ति प्रवाह साइटोमेट्री के लिए मुआवजा नियंत्रण के लिए प्रतिदीप्ति द्वार स्थापित करने के लिए उपयोग किया गया था।

एक बार इन प्राथमिक और प्रतिदीप्ति फाटकों की स्थापना के बाद, माइटोफैगी के उच्च उपयोग वाले β-कोशिकाओं को वैलिनोमाइसिन एक्सपोजर(चित्रा 1एच)के बिना आरएफडी का उपयोग करके चतुर्थांश 3 (क्यू 3) में फ्लुओज़िनउच्चएमटीफैगीउच्चटीएमआरईकम आबादी के रूप में परिभाषित किया गया था। इस गेटिंग रणनीति का उपयोग करते हुए, बेसल और वैलिनोमाइसिन-प्रेरित माइटोफैगी स्तरों को आरएफडी और एचएफडी आइलेट्स (चित्रा 2) दोनों में विशेषता थी। माइटोफैगी फ्लक्स की मात्रा निर्धारित करने के लिए, बेसल वी.एस. वैलिनोमाइसिन-प्रेरित माइटोफैगी स्तरों की तुलना निम्नलिखित अनुपात का उपयोग करके की गई थी:

Equation 1

इस अनुपात का उपयोग करते हुए, माइटोफैगी फ्लक्स की मात्रा निर्धारित की गई और आरएफडी बनाम में तुलना की गई। "एचएफडी β-कोशिकाओं को मोटापे और परिधीय इंसुलिन प्रतिरोध के प्रेरण के बाद माइटोफैगी में अंतर का आकलन करने के लिए"। आरएफडी बनाम आरएफडी में माइटोफैगी फ्लक्स का परिमाणीकरण। एचएफडी नमूने चित्रा 2 ई में दिखाया गया है। यह परिणाम एक सीधा डाई-आधारित दृष्टिकोण का उपयोग करके β-कोशिकाओं में माइटोफैगी की मात्रा निर्धारित करने के लिए इस परख की व्यवहार्यता पर प्रकाश डालता है। इस विधि को मानव आइलेट्स, मुश्किल-से-ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं और जटिल आनुवंशिक मॉडल से अलग आइलेट्स में भी नियोजित किया जा सकता है जहां एमटी-कीमा ट्रांसजेनिक मॉडल के लिए इंटरक्रॉसिंग बोझिल होगा।

आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड एमटी-कीमा रिपोर्टर का उपयोग करके माइटोफैगी का आकलन करना
माउंट-कीमा एक दोहरी उत्तेजना फ्लोरोसेंट प्रोटीन है जो कॉक्स 8-स्थानीयकरण अनुक्रम के साथ जुड़ा हुआ है जो आंतरिक माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली को लक्षित करने में सक्षम बनाता है। एमटी-कीमा की बिमोडल फ्लोरोसेंट संपत्ति इसे इंट्रासेल्युलर डिब्बे6 के पीएच के आधार पर तटस्थ (405 एनएम) से अम्लीय (561 एनएम) तरंग दैर्ध्य तक अपने उत्तेजना स्पेक्ट्रा को स्विच करने की अनुमति देती है। यह माइटोफैगी के एक मजबूत अनुपातमितीय प्रतिदीप्ति विश्लेषण को सक्षम बनाता है, जहां अम्लीय-से-तटस्थ अनुपात में वृद्धि माइटोफैगी प्रेरण को इंगित करती है। इस प्रोटोकॉल में, फ्लोज़िन-3-एएम का उपयोग फ्लो साइटोमेट्री के माध्यम से β-कोशिकाओं के लिए चयन करने के लिए भी किया गया था। इन प्रतिनिधि अध्ययनों में, माइटोफैगी फ्लक्स का मूल्यांकन चूहों से अलग आइलेट्स का उपयोग करके आरएफडी आहार10,11 खिलाया गया था। एफएससी और एसएससी वोल्टेज को पहले एसएससी-ए बनाम कोशिकाओं के समान वितरण को प्राप्त करने के लिए समायोजित किया गया था। एफएससी-ए प्लॉट (चित्रा 3ए)। एकल कोशिकाओं के लिए चयन करने के लिए, दोनों एफएससी-एच वी.एस. एफएससी-डब्ल्यू और एसएससी-एच बनाम एसएससी-डब्ल्यू भूखंडों का उपयोग किया गया था, जहां मल्टीपलेट्स को एकल कोशिकाओं(चित्रा 3बी,सी)की तुलना में उनकी उच्च चौड़ाई सिग्नल मूल्यों के कारण बाहर रखा गया था। डीएपीआई और फ्लोज़िन-3-एएम के लिए वोल्टेज और गेटिंग रणनीति एकल-दाग वाले आइलेट(चित्रा 3डी,ई)का उपयोग करके निर्धारित की गई थी। अम्लीय और तटस्थ आबादी के लिए त्रिभुज फाटकों तो वालिनोमाइसिन जोखिम (चित्रा 3F) के बिना mt-Keima सकारात्मक नमूना का उपयोग कर की पहचान की गई.

एक बार इन प्राथमिक और प्रतिदीप्ति फाटकों की स्थापना के बाद, माइटोफैगी फ्लक्स का मूल्यांकन एमटी-कीमा प्रतिदीप्ति(चित्रा 3एफ,जी)में बेसल और वैलिनोमाइसिन-प्रेरित परिवर्तनों का उपयोग करके किया गया था। माइटोफैगी फ्लक्स की मात्रा निर्धारित करने के लिए, बेसल माइटोफैगी वी। Valinomycin-प्रेरित स्तरों की तुलना निम्नलिखित अनुपात का उपयोग करके की गई थी:

Equation 2

इस अनुपात का उपयोग करके, आरएफडी कोशिकाओं में माइटोफैगी फ्लक्स की मात्रा निर्धारित की गई थी। इस परिणाम की मात्रा चित्रा 3 एच में दिखाया गया है. महत्वपूर्ण रूप से, ये परिणाम MtPhagy दृष्टिकोण(चित्रा 3H)का उपयोग करके उत्पन्न RFD आइलेट्स के परिणामों के बराबर हैं।

Figure 1
चित्रा 1: MtPhagy विधि के लिए गेटिंग योजना। (ए) सभी कोशिकाओं के लिए चयन करने के लिए गेटिंग योजना प्रदर्शित करने वाला फ्लो प्लॉट। (बी) एफएससी-एच बनाम के आधार पर सिंगलेट्स के लिए चयन करने के लिए गेटिंग। एफएससी-डब्ल्यू और (सी) एसएससी-एच बनाम एसएससी-डब्ल्यू। (डी) मृत कोशिकाओं को बाहर करने के लिए डीएपीआई नकारात्मक कोशिकाओं के लिए गेटिंग। (ई) β-कोशिकाओं के लिए चयन करने के लिए फ्लोज़िन-3-एएमउच्च कोशिकाओं के लिए गेटिंग। (च) MtPhagyउच्च और MtPhagy निम्न सेल आबादी की पहचान करने के लिए MtPhagyडाई के लिए गेटिंग योजना। (छ) टीएमआरईउच्च और टीएमआरईनिम्न सेल आबादी की पहचान करने के लिए टीएमआरई के लिए गेटिंग योजना। (ज) चतुर्थांश गेटिंग स्कीम की स्थापना अनुपचारित आरएफडी आइलेट्स के साथ की गई ताकि चतुर्थांश 3 (क्यू 3) में फ्लोजीनउच्चएमटीफैगीउच्चटीएमआरईनिम्न कोशिकाओं की पहचान माइटोफैगी से गुजरने वाली β-कोशिकाओं के रूप में की जा सके। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: MtPhagy गेटिंग योजना का उपयोग चयापचय तनाव के बाद माउस β कोशिकाओं में mitophagy प्रवाह मतभेद का आकलन. (ए) अनुपचारित आरएफडी β-कोशिकाओं, (बी) अनुपचारित एचएफडी β-कोशिकाओं, (सी) वैलिनोमाइसिन-उजागर आरएफडी β-कोशिकाओं, और (डी) वैलिनोमाइसिन-उजागर एचएफडी β-कोशिकाओं के प्रतिनिधि प्रवाह साइटोमेट्री भूखंड। (ई) β कोशिकाओं में माइटोफैगी प्रवाह की मात्रा, आरएफडी और एचएफडी दोनों नमूनों के लिए, वालिनोमाइसिन के संपर्क में आने वाले एमटीफैगीउच्चटीएमआरईकम कोशिकाओं के अनुपात का उपयोग करके गणना की जाती है। * पी < 0.05 छात्र के अयुग्मित टी-टेस्ट द्वारा। n = 3/समूह। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: एमटी-कीमा विधि के लिए गेटिंग योजना और दोनों तरीकों के बीच तुलना। (ए) सभी कोशिकाओं के लिए चयन करने के लिए गेटिंग योजना प्रदर्शित करने वाला फ्लो प्लॉट। (बी) एफएससी-एच बनाम के आधार पर सिंगलेट्स के लिए चयन करने के लिए गेटिंग। एफएससी-डब्ल्यू और (सी) एसएससी-एच बनाम एसएससी-डब्ल्यू। (डी) मृत कोशिकाओं को बाहर करने के लिए डीएपीआई नकारात्मक कोशिकाओं के लिए गेटिंग। (ई) β-कोशिकाओं के लिए चयन करने के लिए फ्लोज़िन-3-एएमउच्च कोशिकाओं के लिए गेटिंग। (एफ) एमटी-कीमा / + अनुपचारित कोशिकाओं और (जी) एमटी-कीमा / + वैलिनोमाइसिन-उजागर कोशिकाओं के प्रतिनिधि प्रवाह साइटोमेट्री भूखंड। (एच)आरएफडी-फेड चूहों से β-कोशिकाओं में माइटोफैगी फ्लक्स की मात्रा का ठहराव, एमटी-कीमा विधि का उपयोग करके वालिनोमाइसिन के संपर्क में नहीं आने वाले अम्लीय / तटस्थ कोशिकाओं के अनुपात में वैलिनोमाइसिन के संपर्क में आने वाले अम्लीय/तटस्थ कोशिकाओं के अनुपात का उपयोग करके गणना की जाती है और एमटीफैगी विधि की तुलना में (मूल रूप से चित्रा 2ई में दिखाए गए एमटीफैगी प्रोटोकॉल के लिए डेटा)। n = 3/समूह। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

इस प्रोटोकॉल ने अलग-अलग प्राथमिक माउस आइलेट्स में माइटोफैगी प्रवाह की मात्रा निर्धारित करने के लिए दो पूरक तरीकों का वर्णन किया। एमटी-कीमा विधि का उपयोग करते हुए, माइटोफैगी में वृद्धि को अम्लीय (561 एनएम) / तटस्थ (405 एनएम) कोशिकाओं के बढ़े हुए अनुपात के रूप में निर्धारित किया गया था, जबकि एमटीफैगी विधि में, माइटोफैगी प्रवाह में वृद्धि को फ्लोज़िनउच्चएमटीफैगीउच्चटीएमआरईकम सेल आबादी में वृद्धि के रूप में निर्धारित किया गया था। ये विधियां माइटोफैगी प्रवाह के तेजी से, मात्रात्मक और β-सेल-विशिष्ट आकलन की अनुमति देती हैं।

दोनों विधियां सीधे दृष्टिकोण हैं। हालांकि, इस प्रोटोकॉल के भीतर कुछ कदम गुणवत्ता और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण हैं. इन चरणों में शामिल हैं: (1) एक एकल कोशिका निलंबन प्राप्त करने के लिए उचित आइलेट पृथक्करण, लेकिन आइलेट व्यवहार्यता सुनिश्चित करने के लिए पर्याप्त हल्का, (2) ब्याज की आबादी की सही पहचान करने के लिए गेटिंग की सावधानीपूर्वक स्थापना, और (3) माइक्रोफैगी प्रवाह का निष्पक्ष मूल्यांकन सुनिश्चित करने के लिए सॉफ्टवेयर टूल के माध्यम से प्रवाह साइटोमेट्री डेटा का उद्देश्य परिमाणीकरण।

किस विधि का उपयोग करना है, इसका चयन करते समय, सेल प्रकार और उपयोग किए जाने वाले आनुवंशिक मॉडल की प्रकृति पर विचार किया जाना चाहिए। एमटी-कीमा विधि, या तो विवो में उपयोग की जाती है या इन विट्रो में ट्रांसफ़ेक्ट की जाती है, फ्लो साइटोमेट्री या लाइव सेल इमेजिंग21 द्वारा माइटोफैगी मूल्यांकन के लिए एक अत्यधिक उद्धृत और अच्छी तरह से माना जाने वाला तरीका है। जबकि डाई-आधारित MtPhagy विधि आनुवंशिक पत्रकारों की तुलना में एक नया दृष्टिकोण है, ऐसे उदाहरण हैं जब इसके उपयोग को mt-Keima पर पसंद किया जा सकता है। दरअसल, MtPhagy विधि अभिकर्मक या जटिल प्रजनन योजनाओं की आवश्यकता पर काबू पाती है, और MtPhagy धुंधला केवल 30 मिनट लेता है और प्रवाह साइटोमेट्री से तुरंत पहले किया जाता है। MtPhagy दृष्टिकोण को कठिन-से-ट्रांसफ़ेक्ट प्राथमिक मानव आइलेट नमूनों में भी सफलतापूर्वक नियोजित किया जा सकता है। यह प्रोटोकॉल, जो पीएच-संवेदनशील माइटोकॉन्ड्रियल रंगों या माइटोफैगी को सीधे मापने के लिए जांच पर निर्भर करता है, मौरो-लिज़कानो एट से पिछले दृष्टिकोण से अलग है। अल कि झिल्ली संभावित संवेदनशील MitoTracker गहरी लाल डाई कार्यरत और mitophagy और लाइसोसोमल अवरोधकों के उपयोग की आवश्यकता प्रवाह cytometry22 द्वारा mitophagy प्रवाह यों करने के लिए. मौरो-लिज़कानो एट के रूप में। आइलेट्स में अल विधि का परीक्षण नहीं किया गया है, यहां वर्णित माउंटफैगी या एमटी-कीमा विधियों की प्रभावकारिता से सीधे इसकी तुलना करना मुश्किल है। एक साथ लिया, इन तरीकों के संयोजन अत्यधिक मात्रात्मक रहते एकल सेल assays में कड़ाई से mitophagy प्रवाह का आकलन करने के लिए विकल्पों की एक बढ़ती संख्या में समग्रता में प्रदान करता है.

दोनों विधियों के लिए एक दोष सेल निर्धारण के साथ उनकी असंगति है। हालांकि दोनों तरीकों लाइव सेल इमेजिंग दृष्टिकोण के साथ संगत हैं, सेल निर्धारण लाइसोसोमल झिल्ली 7,16 भर में MtPhagy और mt-Keima दोनों के पीएच ढाल के साथ हस्तक्षेप. एक विकल्प के रूप में, निश्चित नमूनों में मिटोक्यूसी माइटोफैगी रिपोर्टर का उपयोग पहले7 नियोजित किया गया है। इसके अतिरिक्त, दोनों विधियों के लिए एक सीमा प्रवाह साइटोमेट्री से पहले आइलेट्स को अलग करने की आवश्यकता है, जो सेल व्यवहार्यता को प्रभावित कर सकती है। इसलिए, आइलेट पृथक्करण के बाद सेल व्यवहार्यता की निगरानी करने और सभी नमूनों को लगातार इलाज सुनिश्चित करने के लिए DAPI के साथ कोशिकाओं को दाग करना महत्वपूर्ण है। डीएपीआई धुंधला होने के बाद, नमूनों में 7.4 मृत कोशिकाओं(चित्रा 1डी)± औसतन 12.7% था, यह दर्शाता है कि प्रत्येक नमूने में >80% कोशिकाओं का विश्लेषण के लिए उपयोग किया जा सकता है। प्रत्येक चरण में सेल व्यवहार्यता की निगरानी (आइलेट अलगाव, संस्कृति, और फिर पृथक्करण के बाद) प्रक्रिया के प्रत्येक चरण में सेल अस्तित्व का ज्ञान प्राप्त करने के लिए अतिरिक्त रूप से उपयोगी हो सकता है। आइलेट अलगाव और एकल सेल पृथक्करण के बीच समय में परिवर्तनशीलता भी सेल व्यवहार्यता और परिणाम को प्रभावित कर सकते हैं. इस प्रकार, यह सभी प्रयोगों भर में समय के साथ संगत रहने के लिए सिफारिश की है.

चूंकि माइटोकॉन्ड्रियल गुणवत्ता नियंत्रण β-सेल स्वास्थ्य और कार्य के लिए महत्वपूर्ण है, पारंपरिक जैव रासायनिक या इमेजिंग दृष्टिकोण (माइटोकॉन्ड्रियल बाहरी झिल्ली प्रोटीन के कारोबार सहित, ऑटोफैगोसोम या लाइसोसोम के लिए माइटोकॉन्ड्रियल स्थानीयकरण, और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी) का उपयोग करके माइटोफैगी के कठोर आकलन चुनौतीपूर्ण और समय लेने वाले साबित हो सकते हैं। इस प्रकार, प्रभावी और मजबूत माइटोफैगी रिपोर्टर सिस्टम का विकास महत्वपूर्ण है। mt-Keima और MtPhagy दोनों दृष्टिकोण कुशल हैं और माइटोफैगी प्रवाह के मात्रात्मक आकलन की अनुमति देते हैं। ये दो तकनीकें β-सेल माइटोकॉन्ड्रियल गुणवत्ता नियंत्रण को संबोधित करने और अंतर-ऑर्गेनेल इंटरैक्शन की जांच करने में लचीलापन और सटीकता दोनों के लिए अनुमति देती हैं।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

एसएएस को ओनो फार्मास्युटिकल कं, लिमिटेड से अनुदान निधि प्राप्त हुई है और यह नोवो नॉर्डिस्क के लिए एक सलाहकार है।

Acknowledgments

ई.एल.डी. एनआईएच (टी 32-AI007413 और टी 32-AG000114) से समर्थन स्वीकार करता है। SAS JDRF (COE-2019-861), NIH (R01 DK135268, R01 DK108921, R01 DK135032, R01 DK136547, U01 DK127747), वयोवृद्ध मामलों के विभाग (I01 BX004444), ब्रेहम परिवार और एंथोनी परिवार से समर्थन स्वीकार करता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibiotic-Antimycotic Life Technologies 15240-062
Attune NxT Flow Cytometer Thermofisher Scientific A24858
Dimethyl Sulfoxide Sigma-Aldrich 317275
Fatty Acid Free heat shock BSA powder Equitech BAH66
Fetal bovine serum Gemini Bio 900-108
Fluozin-3AM  Thermofisher Scientific  F24195 100 μg Fluozin-3AM powder reconstituted in 51 μL DMSO and 51 μL Pluronic F-127 to reach 1 mM stock. 
Gibco RPMI 1640 Medium Fisher Scientific 11-875-093
HEPES (1M) Life Technologies 15630-080
MtPhagy dye Dojindo MT02-10 5 μg MtPhagy powder reconstituted with 50 μL DMSO to reach 100 μM stock. 
MtPhagy dye Dojindo MT02-10
Penicillin-Streptomycin (100x) Life Technologies 15140-122 1x Solution used in procotol by diluting 1:10 in ddH2O
Phosphate buffered saline, 10x Fisher Scientific BP399-20 1x Solution used in procotol by diluting 1:10 in ddH2O
Sodium Pyruvate (100x) Life Technologies 11360-070 5 μg MtPhagy powder reconstituted with 50 μL DMSO to reach 100 μM stock. 
TMRE [Tetramethylrhodamine, ethyl ester, perchlorate] Anaspec AS-88061 TMRE powder reconstituted in DMSO to reach 100 μM stock.
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Thermofisher Scientific 25300054
Valinomycin Sigma V0627 Valinomycin powder reconsituted in DMSO to reach 250 nM stock.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kaufman, B. A., Li, C., Soleimanpour, S. A. Mitochondrial regulation of β-cell function: maintaining the momentum for insulin release. Molecular Aspects of Medicine. 42, 91-104 (2015).
  2. Soleimanpour, S. A., et al. The diabetes susceptibility gene Clec16a regulates mitophagy. Cell. 157 (7), 1577-1590 (2014).
  3. Pearson, G., et al. Clec16a, Nrdp1, and USP8 form a ubiquitin-dependent tripartite complex that regulates β-cell mitophagy. Diabetes. 67 (2), 265-277 (2018).
  4. Hattori, N., Saiki, S., Imai, Y. Regulation by mitophagy. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 53, 147-150 (2014).
  5. Berezhnov, A. V., et al. Intracellular pH modulates autophagy and mitophagy. Journal of Biological Chemistry. 291 (16), 8701-8708 (2016).
  6. Sun, N., et al. Measuring in vivo mitophagy. Molecular Cell. 60 (4), 685-696 (2015).
  7. McWilliams, T. G., et al. mito-QC illuminates mitophagy and mitochondrial architecture in vivo. Journal of Cell Biology. 214 (3), 333-345 (2016).
  8. Aoyagi, K., et al. A new beta cell-specific mitophagy reporter mouse shows that metabolic stress leads to accumulation of dysfunctional mitochondria despite increased mitophagy. Diabetologia. 66 (1), 147-162 (2023).
  9. Ma, X., Ding, W. X. A fluorescence imaging based-assay to monitor mitophagy in cultured hepatocytes and mouse liver. Liver Research. 5 (1), 16-20 (2021).
  10. Sidarala, V., et al. Mitophagy protects β cells from inflammatory damage in diabetes. JCI Insight. 5 (24), 141138 (2020).
  11. Gingerich, M. A., et al. An intrinsically disordered protein region encoded by the human disease gene CLEC16A regulates mitophagy. Autophagy. 19 (2), 525-543 (2023).
  12. Sun, N., Malide, D., Liu, J., Rovira, I. I., Combs, C. A., Finkel, T. A fluorescence-based imaging method to measure in vitro and in vivo mitophagy using mt-Keima. Nature Protocols. 12 (8), 1576-1587 (2017).
  13. Zhao, J., Bertoglio, B. A., Gee, K. R., Kay, A. R. The zinc indicator FluoZin-3 is not perturbed significantly by physiological levels of calcium or magnesium. Cell Calcium. 44 (4), 422-426 (2008).
  14. Da Silva Xavier, G. The Cells of the Islets of Langerhans. Journal of Clinical Medicine. 7 (3), 54 (2018).
  15. Thapa, B., et al. Imaging β-cell function using a zinc-responsive MRI contrast agent may identify first responder islets. Frontiers in Endocrinology. 12, 809867 (2022).
  16. Iwashita, H., et al. Live cell imaging of mitochondrial autophagy with a novel fluorescent small molecule. ACS Chemical Biology. 12 (10), 2546-2551 (2017).
  17. Crowley, L. C., Christensen, M. E., Waterhouse, N. J. Measuring mitochondrial transmembrane potential by TMRE staining. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (12), 087361 (2016).
  18. Klein, B., Wörndl, K., Lütz-Meindl, U., Kerschbaum, H. H. Perturbation of intracellular K(+) homeostasis with valinomycin promotes cell death by mitochondrial swelling and autophagic processes. Apoptosis. 16 (11), 1101-1117 (2011).
  19. Ji, Y., et al. Toll-like receptors TLR2 and TLR4 block the replication of pancreatic β cells in diet-induced obesity. Nature Immunology. 20 (6), 677-686 (2019).
  20. Sauvat, A., et al. Quantification of cellular viability by automated microscopy and flow cytometry. Oncotarget. 6 (11), 9467-9475 (2015).
  21. Liu, Y. T., et al. Mt-Keima detects PINK1-PRKN mitophagy in vivo with greater sensitivity than mito-QC. Autophagy. 17 (11), 3753-3762 (2021).
  22. Mauro-Lizcano, M., et al. New method to assess mitophagy flux by flow cytometry. Autophagy. 11 (5), 833-843 (2015).

Tags

माइटोफैगी फ्लक्स अग्नाशयी कोशिकाएं पूरक दृष्टिकोण जेनेटिक रिपोर्टर माउंट-कीमा माउस मॉडल माइटोफैगी की मात्रा निर्धारित करना फ्लो साइटोमेट्री पीएच-संवेदनशील दोहरी-उत्तेजना अनुपातमितीय जांच अम्लीय-से-तटस्थ माउंट-कीमा तरंग दैर्ध्य उत्सर्जन आनुवंशिक माइटोफैगी रिपोर्टर्स जटिल आनुवंशिक माउस मॉडल मुश्किल-से-ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाएं प्राथमिक मानव आइलेट्स डाई-आधारित विधि एमटीफैगी सेल-पारगम्य डाई माइटोफैगी के दौरान लाइसोसोम फ्लुओज़िन-3-एएम जेडएन 2+ इंडिकेटर टेट्रामेथिलरोडामाइन एथिल एस्टर (टीएमआरई) माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता
अग्नाशयी β-कोशिकाओं में माइटोफैगी फ्लक्स से पूछताछ करने के लिए पूरक दृष्टिकोण
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Levi-D’Ancona, E., Sidarala,… More

Levi-D’Ancona, E., Sidarala, V., Soleimanpour, S. A. Complementary Approaches to Interrogate Mitophagy Flux in Pancreatic β-Cells. J. Vis. Exp. (199), e65789, doi:10.3791/65789 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter