Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Комплементарные подходы к исследованию потока митофагии в β-клетках поджелудочной железы

Published: September 15, 2023 doi: 10.3791/65789
Automatic Translation
1,2, 1, 1,3,4
1Department of Internal Medicine, Division of Metabolism, Endocrinology and Diabetes, University of Michigan, Ann Arbor, 2Graduate Program in Immunology, University of Michigan Medical School, 3Department of Molecular and Integrative Physiology, University of Michigan, Ann Arbor, 4VA Ann Arbor Healthcare System

Summary

В этом протоколе описаны два метода количественного анализа митофагии в β-клетках поджелудочной железы: во-первых, комбинация проницаемых для клеток митохондриально-специфических красителей, и, во-вторых, генетически кодируемый репортер митофагии. Эти два метода дополняют друг друга и могут быть применены в зависимости от конкретных потребностей, что обеспечивает гибкость и точность в количественном контроле качества митохондрий.

Abstract

Митофагия – это механизм контроля качества, необходимый для поддержания оптимальной функции митохондрий. Дисфункциональная β-клеточная митофагия приводит к недостаточному высвобождению инсулина. Расширенная количественная оценка митофагии часто требует использования генетических репортеров. Мышиная модель mt-Keima, которая экспрессирует митохондриально-чувствительный рН-чувствительный ратиометрический зонд с двойным возбуждением для количественной оценки митофагии с помощью проточной цитометрии, была оптимизирована в β-клетках. Соотношение кислотных и нейтральных длин волн mt-Keima может быть использовано для надежной количественной оценки митофагии. Тем не менее, использование репортеров генетической митофагии может быть сложной задачей при работе со сложными генетическими моделями мышей или трудно трансфицируемыми клетками, такими как первичные островки человека. Этот протокол описывает новый комплементарный метод на основе красителя для количественной оценки митофагии β-клеток в первичных островках с использованием MtPhagy. MtPhagy — это pH-чувствительный, проницаемый для клеток краситель, который накапливается в митохондриях и увеличивает интенсивность флуоресценции, когда митохондрии находятся в среде с низким pH, например, лизосомы во время митофагии. Комбинируя краситель MtPhagy с флюозином-3-AM, индикатором Zn2+ , который селекционирует β-клетки, и тетраметилродамином, этиловым эфиром (TMRE) для оценки мембранного потенциала митохондрий, поток митофагии может быть количественно определен конкретно в β-клетках с помощью проточной цитометрии. Эти два подхода в значительной степени дополняют друг друга, обеспечивая гибкость и точность в оценке контроля качества митохондрий в многочисленных моделях β-клеток.

Introduction

β-клетки поджелудочной железы вырабатывают и секретируют инсулин для удовлетворения метаболических потребностей, а дисфункция β-клеток ответственна за гипергликемию и начало диабета как при диабете 1-го, так и 2-го типа. β-клетки связывают метаболизм глюкозы с секрецией инсулина через митохондриальную энергетику и метаболический выход, которые зависят от резерва функциональной митохондриальной массы 1,2,3. Для поддержания оптимального функционирования β-клеток β-клетки полагаются на механизмы контроля качества митохондрий для удаления старых или поврежденных митохондрий и сохранения функциональной митохондриальной массы. Селективная митохондриальная аутофагия, также известная как митофагия, является ключевым компонентом пути контроля качества митохондрий.

Оценка митофагии в живых клетках часто основывается на изменениях рН митохондрий, которые происходят во время митофагии. Митохондрии имеют слабощелочной рН, а здоровые митохондрии обычно находятся в рН-нейтральном цитозоле. Во время митофагии поврежденные или дисфункциональные митохондрии избирательно включаются в аутофагосомы и, в конечном итоге, очищаются в кислых лизосомах5. Несколько моделей репортерных мышей с трансгенной митофагией in vivo, такие как mt-Keima6, mitoQC7 и CMMR8, а также трансфектабельные митофагические зонды, такие как плазмида Cox8-EGFP-mCherry9, используют это изменение рН для количественной оценки митофагии. Использование трансгенных мышей, экспрессирующих pH-чувствительный рН-чувствительный ритиометрический зонд с двойным возбуждением, было оптимизировано для оценки митофагии в островках и β-клетках с помощью проточной цитометрии10,11. Отношение кислотных и нейтральных длин волн mt-Keima (отношение кислотного возбуждения 561 нм к нейтральному возбуждению 480 нм) может быть использовано для надежной количественной оценки митофагии 6,12.

Данный протокол описывает оптимизированный подход к оценке потока митофагии в первичных островках и β-клетках, выделенных от трансгенных мышей mt-Keima10,11. Несмотря на то, что mt-Keima является высокочувствительным зондом, он требует либо сложных схем разведения животных, либо трансфекции клеток, что часто может быть сложной задачей при работе в сочетании с другими генетическими моделями или с первичными островками человека. Кроме того, использование нескольких флуоресцентных лазеров и детекторов для идентификации нейтральных и кислых клеточных популяций может ограничить комбинаторное использование других флуоресцентных репортеров.

Для преодоления этих проблем в этом протоколе также описан комплементарный метод на основе одного флуоресцентного канала на основе красителя для надежного обнаружения митофагии в β-клетках из изолированных островков мыши. Этот подход, называемый методом MtPhagy, использует комбинацию трех проницаемых для клеток красителей для отбора β-клеток, количественной оценки клеточных популяций, активно подвергающихся митофагии, и одновременной оценки мембранного потенциала митохондрий (MMP или Δψm).

Первым из этих красителей является Fluozin-3-AM, проницаемый для клеток индикатор Zn2+ с Ex/Em 494/516 нм13. Островки мышей представляют собой гетерогенную популяцию функционально различных клеток, включая α-, β-, δ- и PP-клетки. β-клетки составляют примерно 80% клеток в островке мыши и могут быть отличимы от других типов островковых клеток из-за их высокой концентрации Zn2+ в гранулах инсулина14,15, что позволяет идентифицировать β-клетки каквысокую популяцию Fluozin-3-AM. Вэтом протоколе также используется краситель MtPhagy, pH-чувствительный краситель, который иммобилизован на митохондриях посредством химической связи и излучает слабую флуоресценцию. При индукции митофагии поврежденные митохондрии включаются в кислую лизосому, и краситель MtPhagy увеличивает интенсивность флуоресценции в среде с низким pH (Ex/Em 561/570-700 нм).

Кроме того, для оценки ММР используется тетраметилродамин, этиловый эфир (TMRE). TMRE представляет собой проницаемый для клеток положительно заряженный краситель (Ex/Em 552/575 нм), который секвестрируется здоровыми митохондриями из-за относительного отрицательного заряда, поддерживаемого их мембранным потенциалом17. Поврежденные или нездоровые митохондрии рассеивают свой мембранный потенциал, что приводит к снижению способности связывать TMRE. Используя эти красители вместе, β-клетки, подвергающиеся митофагии, могут быть идентифицированы какнизкая популяция MtPhagyс высокимсодержанием флюозина MtPhagy high TMRE с помощью проточной цитометрии. Поскольку митофагия является динамическим, а не статическим процессом, этот протокол был оптимизирован для оценки потока митофагии с использованием валиномицина, K+-ионофора, который индуцирует митофагию после диссипации MMP18. Сравнение митофагии в присутствии и отсутствии валиномицина позволяет оценить поток митофагии в разных группах образцов.

Основанный на красителях характер современного подхода позволяет экстраполировать его на островки человека и другие трудно трансфицируемые типы клеток и обходит необходимость в сложных схемах разведения животных, в отличие от протокола mt-Keima. Главной целью этого протокола является количественная оценка митофагии в β-клетках на уровне одной клетки с помощью двух независимых методов, основанных на проточной цитометрии. Взятые вместе, этот протокол описывает два мощных и взаимодополняющих метода, которые обеспечивают как точность, так и гибкость в количественном исследовании контроля качества митохондрий.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Исследования на животных, представленные в этом протоколе, были рассмотрены и одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию Мичиганского университета. Для этого исследования были использованы 20-недельные самцы мышей C57BL/6J, находившиеся либо на 15-недельной диете с регулярным содержанием жиров (RFD), либо на диете с высоким содержанием жиров (HFD).

1. Оценка митофагии с помощью метода MtPhagy на основе красителя (Метод 1)

  1. Подготовка и лечение островков мыши
    1. Проведите посев островков и воздействие валиномицина, выполнив следующие действия.
      1. Изолируют островки от мышей с обычной жировой диетой (RFD) или диетой с высоким содержанием жиров (HFD, 60 ккал% жира19), следуя ранее описанным методам 2,10.
      2. Образцы островковых культур в течение ночи при 37 °C в среде RPMI с добавлением 100 ЕД/мл антимикотического антибиотика, 50 ЕД/мл пенициллина-стрептомицина, 1 мМ пирувата натрия, 10 мМ HEPES и 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) (см. таблицу материалов). Эта среда будет называться "островковой средой".
      3. С помощью пипетки набирают по 100 островков в чашки Петри диаметром 6 см в 2 мл островковой среды.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Условия, используемые для этого протокола: (1) Контроль без пятен: неокрашенные островки RFD; (2) Управление только DAPI: островки RFD, окрашенные DAPI; (3) Контроль только флуозина-3-АМ: островки RFD, окрашенные флуозином-3-АМ; (4) Управление только MtPhagy: островки RFD, окрашенные MtPhagy; (5) Управление только TMRE: островки RFD, окрашенные TMRE; (6) RFD без обработки: островки RFD, окрашенные MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM и DAPI; (7) Островки RFD, подверженные воздействию валиномицина: островки RFD, подвергшиеся воздействию валиномицина и окрашенные MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM и DAPI; (8) HFD необработанные: островки HFD, окрашенные MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM и DAPI; (9) Островки HFD, подверженные воздействию валиномицина: островки HFD, подвергшиеся воздействию валиномицина и окрашенные MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM и DAPI.
      4. Для условий (7) и (9) (см. ПРИМЕЧАНИЕ выше), подвергшихся воздействию валиномицина, добавляют 2 мкл 250 нМк валиномицина (см. таблицу материалов) к островкам в чашке Петри в течение 3 ч, чтобы индуцировать митофагию.
    2. Выполните диссоциацию одиночных клеток.
      1. После 3-часовой экспозиции валиномицина с помощью пипетки отбирают по 100 островков от каждого состояния в отдельные микроцентрифужные пробирки.
      2. Отжим островки при 350 x g в течение 1 мин при 10 °C и выбросьте надосадочную жидкость с помощью пипетки.
      3. Промывайте образцы 2 раза 1 мл 1x фосфатно-солевым буфером (PBS) с этапами отжима (350 x g/1 мин, 10 °C) между каждой промывкой. Выбрасывайте надосадочную жидкость с помощью пипетки после каждой стирки.
      4. Чтобы диссоциировать островки на отдельные клетки, добавьте 500 мкл 0,05% трипсина (предварительно нагретого до 37 °C) в микроцентрифужную пробирку одного образца, чтобы предотвратить чрезмерное переваривание островков. Пипетки поднимайте и опускайте несколько раз до тех пор, пока островки не станут заметно рассеянными.
      5. Немедленно добавьте 1 мл предварительно подогретой островковой среды, чтобы нейтрализовать трипсин. Повторите трипсинизацию и нейтрализацию для каждого образца по одному.
      6. Отжим образцов при 500 x g в течение 5 мин при 10 °C. Удалите надосадочную жидкость пипеткой, стараясь не потревожить гранулу.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Гранулы будут деликатными для образцов, подвергшихся воздействию валиномицина.
      7. Промывают образцы 2 раза средой RPMI, без фенольного красного, с добавлением 100 ЕД/мл антимикотического антибиотика, 50 ЕД/мл пенициллина-стрептомицина, 1 мМ пирувата натрия, 10 мМ HEPES и 10% бычьего сывороточного альбумина (БСА). Эта среда будет называться «средой островкового потока». Включайте этапы отжима (350 x g/1 мин, 10 °C) между каждой стиркой. Выбрасывайте надосадочную жидкость с помощью пипетки после каждой стирки.
    3. Окрасьте клетки MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM и DAPI для подготовки к проточной цитометрии.
      1. Ресуспендируйте островковые образцы в 500 мкл островковой проточной среды.
      2. Добавьте 0,25 мкл 100 мкМ материала MtPhagy (см. Таблицу материалов) в пробирки, получающие краситель MtPhagy (условия 4, 6, 7, 8 и 9, ПРИМЕЧАНИЕ к шагу 1.1.1).
      3. Добавьте 0,25 мкл 100 мкМ материала TMRE (см. таблицу материалов) в пробирки, получающие краситель TMRE (условия 5, 6, 7, 8 и 9).
      4. Добавляют 0,25 мкл 1 мМ препарата Флуозин-3-АМ (см. таблицу материалов) в пробирки, получающие краситель Флуозин-3-АМ (условия 3, 6, 7, 8 и 9).
      5. Вихревые трубки на низкой скорости в течение 5 с для перемешивания.
      6. Заверните пробирки микроцентрифуги в алюминиевую фольгу для защиты от света и инкубируйте при 37 °C в течение 30 мин. В середине инкубации вихревые пробирки на низкой скорости в течение 5-10 с перемешивают.
      7. После инкубации образцы центрифугируют при 350 x g в течение 1 мин при 10 °C. Выбросьте надосадочную жидкость с помощью пипетки.
      8. Ресуспендируйте образцы в проточной среде островков объемом 500 мкл. Добавьте 0,2 мкг/мл DAPI (см. таблицу материалов) к условиям 2, 6, 7, 8 и 9.
      9. Отжим образцы при 350 x g в течение 1 мин при 10 °C. Удалите надосадочную жидкость с помощью пипетки и повторно суспендируйте в 500 мкл островковой проточной среды.
      10. Поместите образцы на лед.
  2. Проточная цитометрия
    1. Запустите прибор (см. Таблицу материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подойдет любой проточный цитометр с соответствующими фильтрами. В данном исследовании использовались следующие фильтры: (1) VL1 для DAPI: Возбуждение/излучение - 405 нм/440 нм (50 нм); (2) BL1 для Fluozin-3-AM: возбуждение/излучение - 488 нм/530 нм (30 нм); (3) BL2 для красителя MtPhagy: возбуждение/излучение - 488 нм/590 нм (40 нм); (4) YL1 для TMRE: возбуждение/излучение - 561 нм/585 нм (16 нм).
    2. Отрегулируйте напряжения для прямого (FSC) и бокового рассеяния (SSC), чтобы убедиться, что популяции ячеек находятся в центре диаграммы рассеяния. Для этого протокола использовалось напряжение 120 В для FSC и 260 В для SSC, чтобы обеспечить равномерное распределение ячеек в пределах FSC-A и SSC. График SSC-A (рис. 1А).
    3. Чтобы исключить неодиночные ячейки, добавьте прямоугольный вентиль для FSC-H vs. FSC-W, за которым следует SSC-H vs. SSC-W (рис. 1B,C).
    4. Отрегулируйте напряжение и компенсацию для DAPI для фильтрации живых β-элементов. Установите флуоресцентные вентили для каждого используемого флуорофора на основе неокрашенного образца RFD (рис. 1D-F).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Напряжение, используемое для каждого канала: (1) VL1: 320-360 В; (2) BL1: 300-340 В; (3) BL2: 260-300 В; (4) YL1: 300-340 В.
    5. После установки шлюзов соберите 10 000 событий на выборку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используя этот подход, уровни митофагии в базальных условиях и при индукции валиномицина оценивали как в RFD, так и в HFD островках (рис. 2).
    6. Сохранение данных в виде файлов FCS для анализа.

2. Оценка митофагии с помощью генетически кодируемого репортера mt-Keima (Метод 2)

  1. Препарирование островков мыши и диссоциация отдельных клеток
    1. Проведите посев островков и воздействие валиномицина, выполнив следующие действия.
      1. Изолировать островки поджелудочной железы от мышей дикого типа (WT) и mt-Keima/+ (mt-Keima)6. В этом методе использовали 20-недельных самцов мышей WT или mt-Keima/+, которых кормили RFD.
      2. Культуральные островковые образцы в течение ночи при 37 °C в островковой среде.
      3. С помощью пипетки наберите 100 островков в чашки Петри диаметром 6 см с 2 мл островковой среды.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Условия, используемые для этого протокола: (1) Неокрашенный контроль: Неокрашенные островки WT; (2) Контроль только DAPI: островки WT, окрашенные DAPI; (3) Контроль только флуозина-3-АМ: островки WT, окрашенные флуозином-3-АМ; (4) Контроль только mt-Keima: Неокрашенные островки mt-Keima/+; (5) Необработанные: островки mt-Keima/+, окрашенные флуозином-3-AM и DAPI; (6) Валиномицин: островки mt-Keima/+, подвергшиеся воздействию валиномицина и окрашенные Fluozin-3-AM и DAPI.
      4. При условии (6) с экспозицией валиномицина добавляют 2 мкл 250 нМ валиномицина к островкам в чашке Петри в течение 3 ч, чтобы индуцировать митофагию.
    2. Выполните диссоциацию одной клетки.
      1. Выполните этапы диссоциации одиночных клеток, как описано в шаге 1.1.2.
    3. Окрашивают клетки препаратами Fluozin-3-AM и DAPI.
      1. Ресуспендируйте островковые образцы в 500 мкл островковой проточной среды.
      2. Добавьте 0,25 мкл 1 мМ препарата Флуозин-3-АМ в пробирки, получающие краситель Флуозин-3-АМ (условия 3, 5 и 6).
      3. Инкубируют клетки при 37 °C и приступают к обработке DAPI, как описано в шагах 1.1.3.5-1.3.10.
  2. Проточная цитометрия
    1. Запустите прибор. Подойдет любой проточный цитометр с соответствующими фильтрами.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании использовались следующие фильтры: (1) VL1 для DAPI: Возбуждение/излучение - 405 нм/440 нм (50 нм); (2) BL1 для Fluozin-3-AM: возбуждение/излучение - 488 нм/530 нм (30 нм); (3) VL3 для нейтрали mt-Keima: возбуждение/излучение - 405 нм/603 нм (48 нм); (4) YL2 для мт-кеймской кислоты: возбуждение/излучение - 561 нм/620 нм (15 нм).
    2. Отрегулируйте напряжения FSC и SSC и исключите неодиночные ячейки, как описано в шагах 1.2.2-1.2.3 (рисунки 3A-C).
    3. Отрегулируйте напряжения и компенсацию для DAPI, Fluozin-3-AM и mt-Keima, используя неокрашенные и одиночные положительные элементы управления (условия 1-4), чтобы убедиться, что флуоресцентно-положительные клеточные популяции можно отличить от неокрашенных. После того, как к каждому каналу применена соответствующая компенсация, настройте отрицательный затвор DAPI и положительный затвор Fluozin-3-AM для фильтрации живых β-ячеек (рис. 3D-E).
    4. Настройте схему треугольного стробирования с использованием положительного образца mt-Keima (условие 4) для идентификации кислых и нейтральных клеточных популяций (рис. 3F).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Напряжения, обычно используемые для каждого канала: (1) VL1: 320-340 В; (2) BL2: 260-280 В; (3) VL3: 280-300 В; (4) YL2: 280-300 В.
    5. После установки шлюзов соберите 10 000 событий на выборку. Литниковые схемы для условий 5 и 6 проиллюстрированы на рисунке 3A-G.
    6. Сохранение данных в виде файлов FCS для анализа.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Оценка митофагии с помощью метода MtPhagy на основе красителя
Этот подход, основанный на красителях, был оптимизирован для анализа потока митофагии в первичных β-клетках мышей без необходимости использования генетического репортера, с использованием Fluozin-3-AM, TMRE и MtPhagy, а также DAPI для исключения мертвых клеток. Соединяя эти красители с валиномицином для индуцирования митофагии, этот протокол описывает метод на основе красителя для селективного измерения потока митофагии в первичных β-клетках мышей18. Для данных, показанных с использованием этого метода MtPhagy, были проанализированы как базальная, так и валиномицин-индуцированная митофагия в островках, изолированных либо от обычной жировой диеты (RFD), либо от диеты с высоким содержанием жиров (HFD, 60 ккал% жира), чтобы оценить влияние метаболического стресса на поток митофагии. Для идентификации интересующей популяции клетки были построены с использованием необработанных островков RFD. Напряжения FSC и SSC сначала были отрегулированы для достижения равномерного распределения ячеек на графике SSC-A и FSC-A (рис. 1A). Для выбора отдельных ячеек необходимо использовать FSC-H и FSC-H FSC-W и SSC-H в сравнении с Использовались графики SSC-W, где мультиплеты были исключены из-за более высоких значений сигнала ширины по сравнению с одиночными ячейками (рис. 1B,C). Затем были отобраны DAPI-отрицательные клетки для исключения мертвых клеток20 (рис. 1D). После установления первичных ворот для создания флуоресцентных вентилей для Fluozin-3-AM, MtPhagy и TMRE (рис. 1E-G) использовали одиночные окрашенные контрольные затворы, а также компенсационные контрольные элементы для многоцветной флуоресцентной проточной цитометрии.

После того, как эти первичные и флуоресцентные ворота были установлены, β-клетки с высокой утилизацией митофагии были определены как флуозинс высокимсодержанием MtPhagyи низкойпопуляцией TMRE в квадранте 3 (Q3) с использованием RFD без воздействия валиномицина (рис. 1H). Используя эту стратегию стробирования, были охарактеризованы уровни базальной и валиномицин-индуцированной митофагии как в RFD, так и в HFD островках (рис. 2). Для количественной оценки потока митофаги, базального и Валиномицин-индуцированные уровни митофагии сравнивали с использованием следующего соотношения:

Equation 1

Используя это соотношение, поток митофагии был количественно оценен и сравнен в RFD и RFD. HFD β-клетки для оценки различий в митофагии после индукции ожирения и периферической инсулинорезистентности. Количественная оценка потока митофагии при РЧД в сравнении с Образцы HFD показаны на рисунке 2E. Этот результат подчеркивает возможность количественного определения митофагии в β-клетках с использованием простого подхода на основе красителя. Этот метод также может быть использован на человеческих островках, трудно трансфицируемых клетках и островках, изолированных из сложных генетических моделей, где скрещивание с трансгенной моделью mt-Keima было бы обременительным.

Оценка митофагии с помощью генетически кодируемого репортера mt-Keima
Mt-Keima представляет собой флуоресцентный белок с двойным возбуждением, соединенный с последовательностью локализации Cox8, что позволяет ему нацеливаться на внутреннюю мембрану митохондрий. Бимодальное флуоресцентное свойство mt-Keima позволяет ему переключать спектры возбуждения с нейтральной (405 нм) на кислую (561 нм) длину волны в зависимости от рН внутриклеточного компартмента6. Это позволяет проводить надежный ратиометрический флуоресцентный анализ митофагии, где увеличение соотношения кислотности и нейтральности указывает на индукцию митофагии. В этом протоколе Fluozin-3-AM также использовался для отбора β-клеток с помощью проточной цитометрии. В этих репрезентативных исследованиях поток митофагии оценивали с использованием островков, выделенных у мышей, получавших диету RFD10,11. Напряжения FSC и SSC сначала были отрегулированы для достижения равномерного распределения ячеек на SSC-A по сравнению с SSC-A. График FSC-A (рис. 3А). Для выбора отдельных ячеек необходимо использовать FSC-H и FSC-H FSC-W и SSC-H в сравнении с Использовались графики SSC-W, в которых мультиплеты были исключены из-за более высоких значений сигнала ширины по сравнению с одиночными ячейками (рис. 3B,C). Напряжение и стратегия стробирования для DAPI и Fluozin-3-AM были определены с помощью одноокрашенных островков (рис. 3D, E). Затем были идентифицированы треугольные ворота для кислой и нейтральной популяций с использованием положительного образца mt-Keima без воздействия валиномицина (рис. 3F).

После того, как эти первичные и флуоресцентные ворота были установлены, поток митофагии оценивали с использованием базальных и валиномицин-индуцированных изменений флуоресценции mt-Keima (рис. 3F, G). Для количественной оценки потока митофагии базальная митофагия в сравнении с Валиномицин-индуцированные уровни сравнивали с использованием следующего соотношения:

Equation 2

Используя это соотношение, поток митофагии был количественно оценен в клетках RFD. Количественная оценка этого результата показана на рисунке 3H. Важно отметить, что эти результаты сопоставимы с результатами на RFD-островках, полученных с использованием подхода MtPhagy (рис. 3H).

Figure 1
Рисунок 1: Схема стробирования для метода MtPhagy. (A) График потока, отображающий схему стробирования для выбора для всех ячеек. (B) Стробирование для выбора синглетов на основе FSC-H vs. FSC-W и (C) SSC-H в сравнении с ССК-В. (D) Стробирование DAPI-отрицательных клеток для исключения мертвых клеток. (E) Стробирование длявысоких клеток Fluozin-3-AM для отбора β-клеток. (F) Схема стробирования для красителя MtPhagy для идентификации популяций клеток свысоким инизким содержанием MtPhagy. (G) Схема стробирования для TMRE для выявления популяций клеток свысоким инизким уровнем TMRE. (H) Схема квадрантного стробирования, установленная с необработанными островками RFD для идентификациинизких клеток с высоким содержанием флюозина MtPhagyhighTMRE в квадранте 3 (Q3) как β-клеток, подвергающихся митофагии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Оценка различий в потоке митофагии в β-клетках мышей после метаболического стресса с использованием схемы стробирования MtPhagy. Репрезентативные графики проточной цитометрии (A) необработанных β-клеток RFD, (B) необработанных β-клеток HFD, (C) β-клеток, подверженных воздействию валиномицина, и (D) β-клеток HFD, экспонированных валиномицином. (E) Количественная оценка потока митофагии в β-клетках, рассчитанная с использованием соотношениянизких клеток MtPhagyhighTMRE, подвергшихся воздействию валиномицина, инизких клеток MtPhagyhighTMRE, не подвергающихся воздействию валиномицина, как для образцов RFD, так и для образцов HFD. *p < 0,05 по непарному t-критерию Стьюдента. n = 3/группа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Схема стробирования для метода mt-Keima и сравнение обоих методов. (A) График потока, отображающий схему стробирования для выбора для всех ячеек. (B) Стробирование для выбора синглетов на основе FSC-H vs. FSC-W и (C) SSC-H в сравнении с ССК-В. (D) Стробирование DAPI-отрицательных клеток для исключения мертвых клеток. (E) Стробирование длявысоких клеток Fluozin-3-AM для отбора β-клеток. (F) Репрезентативные графики проточной цитометрии необработанных клеток mt-Keima/+ и (G) клеток, подвергшихся воздействию валиномицина. (H) Количественная оценка потока митофагии в β-клетках мышей, получавших RFD, рассчитанная с использованием соотношения кислотных/нейтральных клеток, подвергшихся воздействию валиномицина, к соотношению кислотных/нейтральных клеток, не подвергавшихся воздействию валиномицина, с использованием метода mt-Keima и сравнения с методом MtPhagy (данные для протокола MtPhagy, первоначально показанные на рисунке 2E). n = 3/группа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В этом протоколе описаны два взаимодополняющих метода количественной оценки потока митофагии в диссоциированных первичных островках мышей. С помощью метода mt-Keima увеличение митофагии количественно оценивалось как увеличение соотношения кислотных (561 нм)/нейтральных (405 нм) клеток, тогда как в методе MtPhagy увеличение потока митофагии количественно оценивалось как увеличение популяцииклеток с высокимсодержанием флюозина и MtPhagyс высокимсодержанием TMRE. Эти методы позволяют проводить быструю, количественную и β-клеточную оценку потока митофагии.

Оба метода являются прямолинейными подходами. Тем не менее, определенные шаги в рамках этого протокола имеют решающее значение для получения качественных и воспроизводимых результатов. Эти этапы включают: (1) надлежащую диссоциацию островков для получения суспензии одной клетки, но достаточно мягкую, чтобы обеспечить жизнеспособность островков, (2) тщательное установление стробирования для правильной идентификации интересующих популяций и (3) объективную количественную оценку данных проточной цитометрии с помощью программных инструментов для обеспечения объективной оценки потока митофагии.

При выборе метода следует учитывать тип клеток и природу используемых генетических моделей. Метод mt-Keima, используемый in vivo или трансфицированный in vitro, является широко цитируемым и хорошо зарекомендовавшим себя методом оценки митофагии с помощью проточной цитометрии или визуализации живых клеток21. Несмотря на то, что метод MtPhagy на основе красителей является более новым подходом по сравнению с генетическими репортерами, есть случаи, когда его использование может быть предпочтительнее по сравнению с mt-Keima. Действительно, метод MtPhagy преодолевает необходимость трансфекции или сложных схем разведения, а окрашивание MtPhagy занимает всего 30 минут и выполняется непосредственно перед проточной цитометрией. Подход MtPhagy может быть успешно использован и в труднотрансфицируемых образцах первичных островков человека. Этот протокол, который полагается либо на pH-чувствительные митохондриальные красители, либо на зонды для прямого измерения митофагии, отличается от предыдущего подхода Мауро-Лизкано и др. В этом исследовании использовался чувствительный к мембранному потенциалу краситель MitoTracker Deep Red и требовалось использование ингибиторов митофагии и лизосомальных ингибиторов для количественной оценки потока митофагии методом проточной цитометрии22. Как пишет Mauro-Lizcano et. Этот метод не был опробован на островках, его трудно напрямую сравнить с эффективностью описанных здесь методов MtPhagy или mt-Keima. Взятые вместе, комбинация этих методов в совокупности предоставляет все большее количество вариантов для строгой оценки потока митофагии в высококоличественных анализах живых одиночных клеток.

Недостатком обоих методов является их несовместимость с клеточной фиксацией. Несмотря на то, что оба метода совместимы с методами визуализации живых клеток, клеточная фиксация влияет на градиент рН как MtPhagy, так и mt-Keima через лизосомальную мембрану 7,16. В качестве альтернативы ранее применялось использование репортера митофагии mitoQC в фиксированных образцах7. Кроме того, ограничением для обоих методов является необходимость диссоциировать островки перед проточной цитометрией, что может повлиять на жизнеспособность клеток. Поэтому крайне важно окрашивать клетки DAPI для мониторинга жизнеспособности клеток после диссоциации островков и обеспечения последовательной обработки всех образцов. После окрашивания DAPI образцы содержали в среднем 12,7% ± 7,4 мертвых клеток (рис. 1D), что указывает на то, что >80% клеток в каждом образце могут быть использованы для анализа. Мониторинг жизнеспособности клеток на каждом этапе (после изоляции островков, культивирования и последующей диссоциации) может быть дополнительно полезен для получения знаний о выживаемости клеток на каждом этапе процедуры. Вариабельность во времени между выделением островков и диссоциацией отдельных клеток также может влиять на жизнеспособность клеток и результаты. Таким образом, рекомендуется придерживаться последовательности во всех экспериментах.

Поскольку контроль качества митохондрий имеет решающее значение для здоровья и функционирования β клеток, тщательная оценка митофагии с использованием традиционных биохимических или визуализирующих подходов (включая оборот белков внешней мембраны митохондрий, локализацию митохондрий в аутофагосомах или лизосомах и электронную микроскопию) может оказаться сложной и трудоемкой задачей. Таким образом, разработка эффективных и надежных репортерных систем митофагии имеет решающее значение. Методы mt-Keima и MtPhagy эффективны и позволяют количественно оценить поток митофагии. Эти два метода обеспечивают гибкость и точность в контроле качества митохондрий β клеток и исследовании межорганелльных взаимодействий.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Компания SAS получила грантовое финансирование от компании Ono Pharmaceutical Co., Ltd. и является консультантом компании «Ново Нордиск».

Acknowledgments

Э.Л-Д. выражает признательность за поддержку со стороны NIH (T32-AI007413 и T32-AG000114). SAS выражает признательность за поддержку со стороны JDRF (COE-2019-861), NIH (R01 DK135268, R01 DK108921, R01 DK135032, R01 DK136547, U01 DK127747), Департамента по делам ветеранов (I01 BX004444), семьи Брем и семьи Энтони.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibiotic-Antimycotic Life Technologies 15240-062
Attune NxT Flow Cytometer Thermofisher Scientific A24858
Dimethyl Sulfoxide Sigma-Aldrich 317275
Fatty Acid Free heat shock BSA powder Equitech BAH66
Fetal bovine serum Gemini Bio 900-108
Fluozin-3AM  Thermofisher Scientific  F24195 100 μg Fluozin-3AM powder reconstituted in 51 μL DMSO and 51 μL Pluronic F-127 to reach 1 mM stock. 
Gibco RPMI 1640 Medium Fisher Scientific 11-875-093
HEPES (1M) Life Technologies 15630-080
MtPhagy dye Dojindo MT02-10 5 μg MtPhagy powder reconstituted with 50 μL DMSO to reach 100 μM stock. 
MtPhagy dye Dojindo MT02-10
Penicillin-Streptomycin (100x) Life Technologies 15140-122 1x Solution used in procotol by diluting 1:10 in ddH2O
Phosphate buffered saline, 10x Fisher Scientific BP399-20 1x Solution used in procotol by diluting 1:10 in ddH2O
Sodium Pyruvate (100x) Life Technologies 11360-070 5 μg MtPhagy powder reconstituted with 50 μL DMSO to reach 100 μM stock. 
TMRE [Tetramethylrhodamine, ethyl ester, perchlorate] Anaspec AS-88061 TMRE powder reconstituted in DMSO to reach 100 μM stock.
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Thermofisher Scientific 25300054
Valinomycin Sigma V0627 Valinomycin powder reconsituted in DMSO to reach 250 nM stock.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kaufman, B. A., Li, C., Soleimanpour, S. A. Mitochondrial regulation of β-cell function: maintaining the momentum for insulin release. Molecular Aspects of Medicine. 42, 91-104 (2015).
  2. Soleimanpour, S. A., et al. The diabetes susceptibility gene Clec16a regulates mitophagy. Cell. 157 (7), 1577-1590 (2014).
  3. Pearson, G., et al. Clec16a, Nrdp1, and USP8 form a ubiquitin-dependent tripartite complex that regulates β-cell mitophagy. Diabetes. 67 (2), 265-277 (2018).
  4. Hattori, N., Saiki, S., Imai, Y. Regulation by mitophagy. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 53, 147-150 (2014).
  5. Berezhnov, A. V., et al. Intracellular pH modulates autophagy and mitophagy. Journal of Biological Chemistry. 291 (16), 8701-8708 (2016).
  6. Sun, N., et al. Measuring in vivo mitophagy. Molecular Cell. 60 (4), 685-696 (2015).
  7. McWilliams, T. G., et al. mito-QC illuminates mitophagy and mitochondrial architecture in vivo. Journal of Cell Biology. 214 (3), 333-345 (2016).
  8. Aoyagi, K., et al. A new beta cell-specific mitophagy reporter mouse shows that metabolic stress leads to accumulation of dysfunctional mitochondria despite increased mitophagy. Diabetologia. 66 (1), 147-162 (2023).
  9. Ma, X., Ding, W. X. A fluorescence imaging based-assay to monitor mitophagy in cultured hepatocytes and mouse liver. Liver Research. 5 (1), 16-20 (2021).
  10. Sidarala, V., et al. Mitophagy protects β cells from inflammatory damage in diabetes. JCI Insight. 5 (24), 141138 (2020).
  11. Gingerich, M. A., et al. An intrinsically disordered protein region encoded by the human disease gene CLEC16A regulates mitophagy. Autophagy. 19 (2), 525-543 (2023).
  12. Sun, N., Malide, D., Liu, J., Rovira, I. I., Combs, C. A., Finkel, T. A fluorescence-based imaging method to measure in vitro and in vivo mitophagy using mt-Keima. Nature Protocols. 12 (8), 1576-1587 (2017).
  13. Zhao, J., Bertoglio, B. A., Gee, K. R., Kay, A. R. The zinc indicator FluoZin-3 is not perturbed significantly by physiological levels of calcium or magnesium. Cell Calcium. 44 (4), 422-426 (2008).
  14. Da Silva Xavier, G. The Cells of the Islets of Langerhans. Journal of Clinical Medicine. 7 (3), 54 (2018).
  15. Thapa, B., et al. Imaging β-cell function using a zinc-responsive MRI contrast agent may identify first responder islets. Frontiers in Endocrinology. 12, 809867 (2022).
  16. Iwashita, H., et al. Live cell imaging of mitochondrial autophagy with a novel fluorescent small molecule. ACS Chemical Biology. 12 (10), 2546-2551 (2017).
  17. Crowley, L. C., Christensen, M. E., Waterhouse, N. J. Measuring mitochondrial transmembrane potential by TMRE staining. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (12), 087361 (2016).
  18. Klein, B., Wörndl, K., Lütz-Meindl, U., Kerschbaum, H. H. Perturbation of intracellular K(+) homeostasis with valinomycin promotes cell death by mitochondrial swelling and autophagic processes. Apoptosis. 16 (11), 1101-1117 (2011).
  19. Ji, Y., et al. Toll-like receptors TLR2 and TLR4 block the replication of pancreatic β cells in diet-induced obesity. Nature Immunology. 20 (6), 677-686 (2019).
  20. Sauvat, A., et al. Quantification of cellular viability by automated microscopy and flow cytometry. Oncotarget. 6 (11), 9467-9475 (2015).
  21. Liu, Y. T., et al. Mt-Keima detects PINK1-PRKN mitophagy in vivo with greater sensitivity than mito-QC. Autophagy. 17 (11), 3753-3762 (2021).
  22. Mauro-Lizcano, M., et al. New method to assess mitophagy flux by flow cytometry. Autophagy. 11 (5), 833-843 (2015).

Tags

Поток митофагии О²-клетки поджелудочной железы Комплементарные подходы Генетические репортеры Мышиная модель Мт-Кейма Количественная оценка митофагии Проточная цитометрия PH-чувствительный рН-чувствительный двойное возбуждение Ратиометрический зонд Излучение длин волн Mt-Keima от кислоты до нейтралки Репортеры генетической митофагии Сложные генетические модели мышей Труднотрансфицируемые клетки Первичные островки человека Метод на основе красителя Мтфагия Проницаемый для клеток краситель Лизосомы во время митофагии Флуозин-3-АМ Индикатор Zn2+ Этиловый эфир тетраметилродамина (TMRE) Мембранный потенциал митохондрий
Комплементарные подходы к исследованию потока митофагии в β-клетках поджелудочной железы
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Levi-D’Ancona, E., Sidarala,… More

Levi-D’Ancona, E., Sidarala, V., Soleimanpour, S. A. Complementary Approaches to Interrogate Mitophagy Flux in Pancreatic β-Cells. J. Vis. Exp. (199), e65789, doi:10.3791/65789 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter