Комплементарные подходы к исследованию потока митофагии в β-клетках поджелудочной железы
Summary
В этом протоколе описаны два метода количественного анализа митофагии в β-клетках поджелудочной железы: во-первых, комбинация проницаемых для клеток митохондриально-специфических красителей, и, во-вторых, генетически кодируемый репортер митофагии. Эти два метода дополняют друг друга и могут быть применены в зависимости от конкретных потребностей, что обеспечивает гибкость и точность в количественном контроле качества митохондрий.
Abstract
Митофагия – это механизм контроля качества, необходимый для поддержания оптимальной функции митохондрий. Дисфункциональная β-клеточная митофагия приводит к недостаточному высвобождению инсулина. Расширенная количественная оценка митофагии часто требует использования генетических репортеров. Мышиная модель mt-Keima, которая экспрессирует митохондриально-чувствительный рН-чувствительный ратиометрический зонд с двойным возбуждением для количественной оценки митофагии с помощью проточной цитометрии, была оптимизирована в β-клетках. Соотношение кислотных и нейтральных длин волн mt-Keima может быть использовано для надежной количественной оценки митофагии. Тем не менее, использование репортеров генетической митофагии может быть сложной задачей при работе со сложными генетическими моделями мышей или трудно трансфицируемыми клетками, такими как первичные островки человека. Этот протокол описывает новый комплементарный метод на основе красителя для количественной оценки митофагии β-клеток в первичных островках с использованием MtPhagy. MtPhagy — это pH-чувствительный, проницаемый для клеток краситель, который накапливается в митохондриях и увеличивает интенсивность флуоресценции, когда митохондрии находятся в среде с низким pH, например, лизосомы во время митофагии. Комбинируя краситель MtPhagy с флюозином-3-AM, индикатором Zn2+ , который селекционирует β-клетки, и тетраметилродамином, этиловым эфиром (TMRE) для оценки мембранного потенциала митохондрий, поток митофагии может быть количественно определен конкретно в β-клетках с помощью проточной цитометрии. Эти два подхода в значительной степени дополняют друг друга, обеспечивая гибкость и точность в оценке контроля качества митохондрий в многочисленных моделях β-клеток.
Introduction
β-клетки поджелудочной железы вырабатывают и секретируют инсулин для удовлетворения метаболических потребностей, а дисфункция β-клеток ответственна за гипергликемию и начало диабета как при диабете 1-го, так и 2-го типа. β-клетки связывают метаболизм глюкозы с секрецией инсулина через митохондриальную энергетику и метаболический выход, которые зависят от резерва функциональной митохондриальной массы 1,2,3. Для поддержания оптимального функционирования β-клеток β-клетки полагаются на механизмы контроля качества митохондрий для удаления старых или поврежденных митохондрий и сохранения функциональной митохондриальной массы. Селективная митохондриальная аутофагия, также известная как митофагия, является ключевым компонентом пути контроля качества митохондрий.
Оценка митофагии в живых клетках часто основывается на изменениях рН митохондрий, которые происходят во время митофагии. Митохондрии имеют слабощелочной рН, а здоровые митохондрии обычно находятся в рН-нейтральном цитозоле. Во время митофагии поврежденные или дисфункциональные митохондрии избирательно включаются в аутофагосомы и, в конечном итоге, очищаются в кислых лизосомах5. Несколько моделей репортерных мышей с трансгенной митофагией in vivo, такие как mt-Keima6, mitoQC7 и CMMR8, а также трансфектабельные митофагические зонды, такие как плазмида Cox8-EGFP-mCherry9, используют это изменение рН для количественной оценки митофагии. Использование трансгенных мышей, экспрессирующих pH-чувствительный рН-чувствительный ритиометрический зонд с двойным возбуждением, было оптимизировано для оценки митофагии в островках и β-клетках с помощью проточной цитометрии10,11. Отношение кислотных и нейтральных длин волн mt-Keima (отношение кислотного возбуждения 561 нм к нейтральному возбуждению 480 нм) может быть использовано для надежной количественной оценки митофагии 6,12.
Данный протокол описывает оптимизированный подход к оценке потока митофагии в первичных островках и β-клетках, выделенных от трансгенных мышей mt-Keima10,11. Несмотря на то, что mt-Keima является высокочувствительным зондом, он требует либо сложных схем разведения животных, либо трансфекции клеток, что часто может быть сложной задачей при работе в сочетании с другими генетическими моделями или с первичными островками человека. Кроме того, использование нескольких флуоресцентных лазеров и детекторов для идентификации нейтральных и кислых клеточных популяций может ограничить комбинаторное использование других флуоресцентных репортеров.
Для преодоления этих проблем в этом протоколе также описан комплементарный метод на основе одного флуоресцентного канала на основе красителя для надежного обнаружения митофагии в β-клетках из изолированных островков мыши. Этот подход, называемый методом MtPhagy, использует комбинацию трех проницаемых для клеток красителей для отбора β-клеток, количественной оценки клеточных популяций, активно подвергающихся митофагии, и одновременной оценки мембранного потенциала митохондрий (MMP или Δψm).
Первым из этих красителей является Fluozin-3-AM, проницаемый для клеток индикатор Zn2+ с Ex/Em 494/516 нм13. Островки мышей представляют собой гетерогенную популяцию функционально различных клеток, включая α-, β-, δ- и PP-клетки. β-клетки составляют примерно 80% клеток в островке мыши и могут быть отличимы от других типов островковых клеток из-за их высокой концентрации Zn2+ в гранулах инсулина14,15, что позволяет идентифицировать β-клетки каквысокую популяцию Fluozin-3-AM. Вэтом протоколе также используется краситель MtPhagy, pH-чувствительный краситель, который иммобилизован на митохондриях посредством химической связи и излучает слабую флуоресценцию. При индукции митофагии поврежденные митохондрии включаются в кислую лизосому, и краситель MtPhagy увеличивает интенсивность флуоресценции в среде с низким pH (Ex/Em 561/570-700 нм).
Кроме того, для оценки ММР используется тетраметилродамин, этиловый эфир (TMRE). TMRE представляет собой проницаемый для клеток положительно заряженный краситель (Ex/Em 552/575 нм), который секвестрируется здоровыми митохондриями из-за относительного отрицательного заряда, поддерживаемого их мембранным потенциалом17. Поврежденные или нездоровые митохондрии рассеивают свой мембранный потенциал, что приводит к снижению способности связывать TMRE. Используя эти красители вместе, β-клетки, подвергающиеся митофагии, могут быть идентифицированы какнизкая популяция MtPhagyс высокимсодержанием флюозина MtPhagy high TMRE с помощью проточной цитометрии. Поскольку митофагия является динамическим, а не статическим процессом, этот протокол был оптимизирован для оценки потока митофагии с использованием валиномицина, K+-ионофора, который индуцирует митофагию после диссипации MMP18. Сравнение митофагии в присутствии и отсутствии валиномицина позволяет оценить поток митофагии в разных группах образцов.
Основанный на красителях характер современного подхода позволяет экстраполировать его на островки человека и другие трудно трансфицируемые типы клеток и обходит необходимость в сложных схемах разведения животных, в отличие от протокола mt-Keima. Главной целью этого протокола является количественная оценка митофагии в β-клетках на уровне одной клетки с помощью двух независимых методов, основанных на проточной цитометрии. Взятые вместе, этот протокол описывает два мощных и взаимодополняющих метода, которые обеспечивают как точность, так и гибкость в количественном исследовании контроля качества митохондрий.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом протоколе описаны два взаимодополняющих метода количественной оценки потока митофагии в диссоциированных первичных островках мышей. С помощью метода mt-Keima увеличение митофагии количественно оценивалось как увеличение соотношения кислотных (561 нм)/нейтральных (405 нм) клеток, тог…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Э.Л-Д. выражает признательность за поддержку со стороны NIH (T32-AI007413 и T32-AG000114). SAS выражает признательность за поддержку со стороны JDRF (COE-2019-861), NIH (R01 DK135268, R01 DK108921, R01 DK135032, R01 DK136547, U01 DK127747), Департамента по делам ветеранов (I01 BX004444), семьи Брем и семьи Энтони.
Materials
| Antibiotic-Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| Attune NxT Flow Cytometer | Thermofisher Scientific | A24858 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermofisher Scientific | D1306 | DAPI reconstituted in ddH2O to reach 0.2 µg/mL stock |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | 317275 | |
| Fatty Acid Free heat shock BSA powder | Equitech | BAH66 | |
| Fetal bovine serum | Gemini Bio | 900-108 | |
| Fluozin-3AM | Thermofisher Scientific | F24195 | 100 μg Fluozin-3AM powder reconstituted in 51 μL DMSO and 51 μL Pluronic F-127 to reach 1 mM stock. |
| Gibco RPMI 1640 Medium | Fisher Scientific | 11-875-093 | |
| HEPES (1M) | Life Technologies | 15630-080 | |
| MtPhagy dye | Dojindo | MT02-10 | 5 μg MtPhagy powder reconstituted with 50 μL DMSO to reach 100 μM stock. |
| MtPhagy dye | Dojindo | MT02-10 | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | Life Technologies | 15140-122 | 1x Solution used in procotol by diluting 1:10 in ddH2O |
| Phosphate buffered saline, 10x | Fisher Scientific | BP399-20 | 1x Solution used in procotol by diluting 1:10 in ddH2O |
| Sodium Pyruvate (100x) | Life Technologies | 11360-070 | 5 μg MtPhagy powder reconstituted with 50 μL DMSO to reach 100 μM stock. |
| TMRE [Tetramethylrhodamine, ethyl ester, perchlorate] | Anaspec | AS-88061 | TMRE powder reconstituted in DMSO to reach 100 μM stock. |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermofisher Scientific | 25300054 | |
| Valinomycin | Sigma | V0627 | Valinomycin powder reconsituted in DMSO to reach 250 nM stock. |
References
- Kaufman, B. A., Li, C., Soleimanpour, S. A. Mitochondrial regulation of β-cell function: maintaining the momentum for insulin release. Molecular Aspects of Medicine. 42, 91-104 (2015).
- Soleimanpour, S. A., et al. The diabetes susceptibility gene Clec16a regulates mitophagy. Cell. 157 (7), 1577-1590 (2014).
- Pearson, G., et al. Clec16a, Nrdp1, and USP8 form a ubiquitin-dependent tripartite complex that regulates β-cell mitophagy. Diabetes. 67 (2), 265-277 (2018).
- Hattori, N., Saiki, S., Imai, Y. Regulation by mitophagy. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 53, 147-150 (2014).
- Berezhnov, A. V., et al. Intracellular pH modulates autophagy and mitophagy. Journal of Biological Chemistry. 291 (16), 8701-8708 (2016).
- Sun, N., et al. Measuring in vivo mitophagy. Molecular Cell. 60 (4), 685-696 (2015).
- McWilliams, T. G., et al. mito-QC illuminates mitophagy and mitochondrial architecture in vivo. Journal of Cell Biology. 214 (3), 333-345 (2016).
- Aoyagi, K., et al. A new beta cell-specific mitophagy reporter mouse shows that metabolic stress leads to accumulation of dysfunctional mitochondria despite increased mitophagy. Diabetologia. 66 (1), 147-162 (2023).
- Ma, X., Ding, W. X. A fluorescence imaging based-assay to monitor mitophagy in cultured hepatocytes and mouse liver. Liver Research. 5 (1), 16-20 (2021).
- Sidarala, V., et al. Mitophagy protects β cells from inflammatory damage in diabetes. JCI Insight. 5 (24), 141138 (2020).
- Gingerich, M. A., et al. An intrinsically disordered protein region encoded by the human disease gene CLEC16A regulates mitophagy. Autophagy. 19 (2), 525-543 (2023).
- Sun, N., Malide, D., Liu, J., Rovira, I. I., Combs, C. A., Finkel, T. A fluorescence-based imaging method to measure in vitro and in vivo mitophagy using mt-Keima. Nature Protocols. 12 (8), 1576-1587 (2017).
- Zhao, J., Bertoglio, B. A., Gee, K. R., Kay, A. R. The zinc indicator FluoZin-3 is not perturbed significantly by physiological levels of calcium or magnesium. Cell Calcium. 44 (4), 422-426 (2008).
- Da Silva Xavier, G. The Cells of the Islets of Langerhans. Journal of Clinical Medicine. 7 (3), 54 (2018).
- Thapa, B., et al. Imaging β-cell function using a zinc-responsive MRI contrast agent may identify first responder islets. Frontiers in Endocrinology. 12, 809867 (2022).
- Iwashita, H., et al. Live cell imaging of mitochondrial autophagy with a novel fluorescent small molecule. ACS Chemical Biology. 12 (10), 2546-2551 (2017).
- Crowley, L. C., Christensen, M. E., Waterhouse, N. J. Measuring mitochondrial transmembrane potential by TMRE staining. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (12), 087361 (2016).
- Klein, B., Wörndl, K., Lütz-Meindl, U., Kerschbaum, H. H. Perturbation of intracellular K(+) homeostasis with valinomycin promotes cell death by mitochondrial swelling and autophagic processes. Apoptosis. 16 (11), 1101-1117 (2011).
- Ji, Y., et al. Toll-like receptors TLR2 and TLR4 block the replication of pancreatic β cells in diet-induced obesity. Nature Immunology. 20 (6), 677-686 (2019).
- Sauvat, A., et al. Quantification of cellular viability by automated microscopy and flow cytometry. Oncotarget. 6 (11), 9467-9475 (2015).
- Liu, Y. T., et al. Mt-Keima detects PINK1-PRKN mitophagy in vivo with greater sensitivity than mito-QC. Autophagy. 17 (11), 3753-3762 (2021).
- Mauro-Lizcano, M., et al. New method to assess mitophagy flux by flow cytometry. Autophagy. 11 (5), 833-843 (2015).
