مناهج تكميلية لاستجواب تدفق الميتوفاجي في خلايا β البنكرياس
Summary
يحدد هذا البروتوكول طريقتين للتحليل الكمي للميتوفاجي في خلايا β البنكرياس: أولا ، مزيج من الأصباغ الخاصة بالميتوكوندريا المنفذة للخلايا ، وثانيا ، مراسل الميتوفاجي المشفر وراثيا. هاتان التقنيتان متكاملتان ويمكن نشرهما بناء على احتياجات محددة ، مما يسمح بالمرونة والدقة في معالجة مراقبة جودة الميتوكوندريا كميا.
Abstract
Mitophagy هي آلية لمراقبة الجودة ضرورية للحفاظ على وظيفة الميتوكوندريا المثلى. يؤدي خلل الميتوفاجي β الخلايا إلى عدم كفاية إفراز الأنسولين. غالبا ما تتطلب التقييمات الكمية المتقدمة للميوفاجي استخدام تقارير وراثية. تم تحسين نموذج الماوس mt-Keima ، الذي يعبر عن مسبار قياس نسبة الإثارة المزدوجة الحساسة لدرجة الحموضة المستهدفة بالميتوكوندريا لقياس الميتوفاجي عبر قياس التدفق الخلوي ، في خلايا β. يمكن استخدام نسبة انبعاثات الطول الموجي mt-Keima الحمضية إلى المحايدة لتحديد mitophagy بقوة. ومع ذلك ، قد يكون استخدام مراسلي الميتوفاجي الوراثي أمرا صعبا عند العمل مع نماذج الفئران الجينية المعقدة أو الخلايا التي يصعب نقلها ، مثل الجزر البشرية الأولية. يصف هذا البروتوكول طريقة تكميلية جديدة قائمة على الصبغة لتحديد كمية الميتوفاجي β الخلايا في الجزر الأولية باستخدام MtPhagy. MtPhagy عبارة عن صبغة حساسة لدرجة الحموضة ونفاذة للخلايا تتراكم في الميتوكوندريا وتزيد من شدة مضانها عندما تكون الميتوكوندريا في بيئات منخفضة الأس الهيدروجيني ، مثل الجسيمات الحالة أثناء الميتوفاجي. من خلال الجمع بين صبغة MtPhagy و Fluozin-3-AM ، وهو مؤشر Zn2+ يختار الخلايا β ، و Tetramethylrhodamine ، إيثيل استر (TMRE) لتقييم إمكانات غشاء الميتوكوندريا ، يمكن قياس تدفق الميتوفاجي على وجه التحديد في خلايا β عبر قياس التدفق الخلوي. هذان النهجان متكاملان للغاية ، مما يسمح بالمرونة والدقة في تقييم مراقبة جودة الميتوكوندريا في العديد من نماذج الخلايا β.
Introduction
تنتج خلايا β البنكرياس الأنسولين وتفرز لتلبية متطلبات التمثيل الغذائي ، ويكون خلل الخلايا β مسؤولا عن ارتفاع السكر في الدم وظهور مرض السكري في كل من مرض السكري من النوع 1 والنوع 2. تقوم الخلايا β بإقران استقلاب الجلوكوز بإفراز الأنسولين عبر طاقة الميتوكوندريا والإنتاج الأيضي ، والتي تعتمد على احتياطي كتلة الميتوكوندريا الوظيفية1،2،3. للحفاظ على الوظيفة المثلى للخلايا β ، تعتمد الخلايا β على آليات مراقبة جودة الميتوكوندريا لإزالة الميتوكوندريا القديمة أو التالفة والحفاظ على كتلة الميتوكوندريا الوظيفية4. يعد الالتهام الذاتي الانتقائي للميتوكوندريا ، المعروف أيضا باسم الميتوفاجي ، مكونا رئيسيا لمسار مراقبة جودة الميتوكوندريا.
غالبا ما تعتمد تقييمات الميتوفاجي في الخلايا الحية على التغيرات في درجة حموضة الميتوكوندريا التي تحدث أثناء الميتوفاجي. تحتوي الميتوكوندريا على درجة حموضة قلوية قليلا ، وتوجد الميتوكوندريا السليمة عادة في العصارة الخلوية المحايدة الأس الهيدروجيني. أثناء الميتوفاجي ، يتم دمج الميتوكوندريا التالفة أو المختلة وظيفيا بشكل انتقائي في البلعمة الذاتية ويتم إزالتها في النهاية داخل الجسيمات الحالةالحمضية 5. تستخدم العديد من نماذج الفئران المراسل المعدلة وراثيا في الجسم الحي ، مثل mt-Keima6 و mitoQC7 و CMMR8 ، بالإضافة إلى مجسات الميتوفاجي القابلة للنقل ، مثل Cox8-EGFP-mCherryplasmid 9 ، هذا التغيير في الأس الهيدروجيني لتوفير تقييمات كمية للميتوفاجي. تم تحسين استخدام الفئران المعدلة وراثيا التي تعبر عن مسبار نسبة الإثارة المزدوجة الحساسة للأس الهيدروجيني mt-Keima لتقييم الميتوفاجي في الجزر الصغيرة والخلايا β عبر قياس التدفق الخلوي10,11. يمكن استخدام نسبة انبعاثات الطول الموجي mt-Keima الحمضية إلى المحايدة (نسبة الإثارة الحمضية 561 نانومتر إلى الإثارة المحايدة 480 نانومتر) لتحديد حجم الميتوفاجي 6,12 بقوة.
يصف هذا البروتوكول نهجا محسنا لتقييم تدفق الميتوفاجي في الجزر الأولية والخلايا β المعزولة من الفئران المعدلة وراثيا10,11 mt-Keima. في حين أن mt-Keima هو مسبار حساس للغاية ، إلا أنه يتطلب إما مخططات معقدة لتربية أو نقل الخلايا ، والتي يمكن أن تكون صعبة في كثير من الأحيان عند العمل مع نماذج وراثية أخرى أو مع الجزر البشرية الأولية. بالإضافة إلى ذلك ، فإن استخدام أشعة الليزر الفلورية المتعددة وأجهزة الكشف لتحديد مجموعات الخلايا المحايدة والحمضية يمكن أن يحد من الاستخدام التوافقي لمراسلي الفلورسنت الآخرين.
للتغلب على هذه التحديات ، يصف هذا البروتوكول أيضا قناة فلورية واحدة تكميلية ، طريقة قائمة على الصبغة للكشف القوي عن الميتوفاجي في خلايا β من جزر الفئران المعزولة. يستخدم هذا النهج ، المشار إليه باسم طريقة MtPhagy ، مزيجا من ثلاثة أصباغ منفذة للخلايا لاختيار خلايا β ، وتحديد مجموعات الخلايا التي تخضع بنشاط ل mitophagy ، وتقييم إمكانات غشاء الميتوكوندريا (MMP أو Δψm) في وقت واحد.
أول هذه الأصباغ هو Fluozin-3-AM ، وهو مؤشر Zn2+ منفذ للخلايا مع Ex / Em 494/516 nm13. تضم جزر الفأر مجموعة غير متجانسة من الخلايا المتميزة وظيفيا ، بما في ذلك خلايا α و β و δ و PP. تشكل الخلايا β حوالي 80٪ من الخلايا داخل جزيرة الفأر ويمكن تمييزها عن أنواع الخلايا الجزيرية الأخرى نظرا لتركيزها العالي Zn2+ داخل حبيبات الأنسولين14,15 ، مما يسمح بتحديد الخلايا β على أنهاعدد سكان Fluozin-3-AM المرتفع. تستخدم صبغة MtPhagy ، وهي صبغة حساسة لدرجة الحموضة يتم تجميدها على الميتوكوندريا عبر رابطة كيميائية وتنبعث منها مضان ضعيف ، في هذا البروتوكول16. عند تحريض الميتوفاجي ، يتم دمج الميتوكوندريا التالفة في الليزوزوم الحمضي ، وتزيد صبغة MtPhagy من شدة مضانها في بيئة الأس الهيدروجيني المنخفض (Ex / Em 561 / 570-700 نانومتر).
بالإضافة إلى ذلك ، يتم استخدام رباعي ميثيل رودامين ، إيثيل استر (TMRE) ، لتقييم MMP. TMRE عبارة عن صبغة موجبة الشحنة قابلة للنفاذ للخلايا (Ex / Em 552/575 نانومتر) يتم عزلها بواسطة الميتوكوندريا السليمة بسبب الشحنة السالبة النسبية التي تدعمها إمكانات الغشاء17. تعمل الميتوكوندريا التالفة أو غير الصحية على تبديد إمكانات غشائها ، مما يؤدي إلى انخفاض القدرة على عزل TMRE. باستخدام هذه الأصباغ معا ، يمكن تحديد الخلايا β التي تخضع للمريء على أنها FluozinhighMtPhagyعاليةTMREمنخفضة السكان عن طريق قياس التدفق الخلوي. نظرا لأن الميتوفاجي عملية ديناميكية وليست ثابتة ، فقد تم تحسين هذا البروتوكول لتقييم تدفق الميتوفاجي باستخدام فالينومايسين ، وهو K + -ionophore الذي يحفز الميتوفاجي بعد تبديد MMP18. تسمح مقارنة الميتوفاجي في وجود وغياب فالينوميسين بتقييم تدفق الميتوفاجي في مجموعات عينات مختلفة.
تسمح الطبيعة القائمة على الصبغة للنهج الحالي باستقرائه على الجزر البشرية وغيرها من أنواع الخلايا التي يصعب نقلها وتتحايل على الحاجة إلى مخططات معقدة لتربية ، على عكس بروتوكول mt-Keima. الهدف الشامل لهذا البروتوكول هو تحديد حجم الميتوفاجي في الخلايا β على مستوى الخلية الواحدة عبر طريقتين مستقلتين قائمتين على قياس التدفق الخلوي. معا، يصف هذا البروتوكول طريقتين قويتين ومتكاملتين تسمحان بالدقة والمرونة في الدراسة الكمية لمراقبة جودة الميتوكوندريا.
Protocol
Representative Results
Discussion
وصف هذا البروتوكول طريقتين متكاملتين لقياس تدفق الميتوفاجي في جزر الفأر الأولية المنفصلة. باستخدام طريقة mt-Keima ، تم تحديد الزيادة في الميتوفاجي كنسبة متزايدة من الخلايا الحمضية (561 نانومتر) / المحايدة (405 نانومتر) ، بينما في طريقة MtPhagy ، تم قياس زيادة تدفق الميتوفاجي كزيادة فيعدد الخلايا ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
E.L-D. يقر بالدعم المقدم من المعاهد الوطنية للصحة (T32-AI007413 و T32-AG000114). تقر SAS بالدعم المقدم من JDRF (COE-2019-861) ، والمعاهد الوطنية للصحة (R01 DK135268 ، R01 DK108921 ، R01 DK135032 ، R01 DK136547 ، U01 DK127747) ، وزارة شؤون المحاربين القدامى (I01 BX004444) ، عائلة Brehm ، وعائلة أنتوني.
Materials
| Antibiotic-Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| Attune NxT Flow Cytometer | Thermofisher Scientific | A24858 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermofisher Scientific | D1306 | DAPI reconstituted in ddH2O to reach 0.2 µg/mL stock |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | 317275 | |
| Fatty Acid Free heat shock BSA powder | Equitech | BAH66 | |
| Fetal bovine serum | Gemini Bio | 900-108 | |
| Fluozin-3AM | Thermofisher Scientific | F24195 | 100 μg Fluozin-3AM powder reconstituted in 51 μL DMSO and 51 μL Pluronic F-127 to reach 1 mM stock. |
| Gibco RPMI 1640 Medium | Fisher Scientific | 11-875-093 | |
| HEPES (1M) | Life Technologies | 15630-080 | |
| MtPhagy dye | Dojindo | MT02-10 | 5 μg MtPhagy powder reconstituted with 50 μL DMSO to reach 100 μM stock. |
| MtPhagy dye | Dojindo | MT02-10 | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | Life Technologies | 15140-122 | 1x Solution used in procotol by diluting 1:10 in ddH2O |
| Phosphate buffered saline, 10x | Fisher Scientific | BP399-20 | 1x Solution used in procotol by diluting 1:10 in ddH2O |
| Sodium Pyruvate (100x) | Life Technologies | 11360-070 | 5 μg MtPhagy powder reconstituted with 50 μL DMSO to reach 100 μM stock. |
| TMRE [Tetramethylrhodamine, ethyl ester, perchlorate] | Anaspec | AS-88061 | TMRE powder reconstituted in DMSO to reach 100 μM stock. |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermofisher Scientific | 25300054 | |
| Valinomycin | Sigma | V0627 | Valinomycin powder reconsituted in DMSO to reach 250 nM stock. |
References
- Kaufman, B. A., Li, C., Soleimanpour, S. A. Mitochondrial regulation of β-cell function: maintaining the momentum for insulin release. Molecular Aspects of Medicine. 42, 91-104 (2015).
- Soleimanpour, S. A., et al. The diabetes susceptibility gene Clec16a regulates mitophagy. Cell. 157 (7), 1577-1590 (2014).
- Pearson, G., et al. Clec16a, Nrdp1, and USP8 form a ubiquitin-dependent tripartite complex that regulates β-cell mitophagy. Diabetes. 67 (2), 265-277 (2018).
- Hattori, N., Saiki, S., Imai, Y. Regulation by mitophagy. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 53, 147-150 (2014).
- Berezhnov, A. V., et al. Intracellular pH modulates autophagy and mitophagy. Journal of Biological Chemistry. 291 (16), 8701-8708 (2016).
- Sun, N., et al. Measuring in vivo mitophagy. Molecular Cell. 60 (4), 685-696 (2015).
- McWilliams, T. G., et al. mito-QC illuminates mitophagy and mitochondrial architecture in vivo. Journal of Cell Biology. 214 (3), 333-345 (2016).
- Aoyagi, K., et al. A new beta cell-specific mitophagy reporter mouse shows that metabolic stress leads to accumulation of dysfunctional mitochondria despite increased mitophagy. Diabetologia. 66 (1), 147-162 (2023).
- Ma, X., Ding, W. X. A fluorescence imaging based-assay to monitor mitophagy in cultured hepatocytes and mouse liver. Liver Research. 5 (1), 16-20 (2021).
- Sidarala, V., et al. Mitophagy protects β cells from inflammatory damage in diabetes. JCI Insight. 5 (24), 141138 (2020).
- Gingerich, M. A., et al. An intrinsically disordered protein region encoded by the human disease gene CLEC16A regulates mitophagy. Autophagy. 19 (2), 525-543 (2023).
- Sun, N., Malide, D., Liu, J., Rovira, I. I., Combs, C. A., Finkel, T. A fluorescence-based imaging method to measure in vitro and in vivo mitophagy using mt-Keima. Nature Protocols. 12 (8), 1576-1587 (2017).
- Zhao, J., Bertoglio, B. A., Gee, K. R., Kay, A. R. The zinc indicator FluoZin-3 is not perturbed significantly by physiological levels of calcium or magnesium. Cell Calcium. 44 (4), 422-426 (2008).
- Da Silva Xavier, G. The Cells of the Islets of Langerhans. Journal of Clinical Medicine. 7 (3), 54 (2018).
- Thapa, B., et al. Imaging β-cell function using a zinc-responsive MRI contrast agent may identify first responder islets. Frontiers in Endocrinology. 12, 809867 (2022).
- Iwashita, H., et al. Live cell imaging of mitochondrial autophagy with a novel fluorescent small molecule. ACS Chemical Biology. 12 (10), 2546-2551 (2017).
- Crowley, L. C., Christensen, M. E., Waterhouse, N. J. Measuring mitochondrial transmembrane potential by TMRE staining. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (12), 087361 (2016).
- Klein, B., Wörndl, K., Lütz-Meindl, U., Kerschbaum, H. H. Perturbation of intracellular K(+) homeostasis with valinomycin promotes cell death by mitochondrial swelling and autophagic processes. Apoptosis. 16 (11), 1101-1117 (2011).
- Ji, Y., et al. Toll-like receptors TLR2 and TLR4 block the replication of pancreatic β cells in diet-induced obesity. Nature Immunology. 20 (6), 677-686 (2019).
- Sauvat, A., et al. Quantification of cellular viability by automated microscopy and flow cytometry. Oncotarget. 6 (11), 9467-9475 (2015).
- Liu, Y. T., et al. Mt-Keima detects PINK1-PRKN mitophagy in vivo with greater sensitivity than mito-QC. Autophagy. 17 (11), 3753-3762 (2021).
- Mauro-Lizcano, M., et al. New method to assess mitophagy flux by flow cytometry. Autophagy. 11 (5), 833-843 (2015).
