Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

مناهج تكميلية لاستجواب تدفق الميتوفاجي في خلايا β البنكرياس

Published: September 15, 2023 doi: 10.3791/65789
Automatic Translation
1,2, 1, 1,3,4
1Department of Internal Medicine, Division of Metabolism, Endocrinology and Diabetes, University of Michigan, Ann Arbor, 2Graduate Program in Immunology, University of Michigan Medical School, 3Department of Molecular and Integrative Physiology, University of Michigan, Ann Arbor, 4VA Ann Arbor Healthcare System

Summary

يحدد هذا البروتوكول طريقتين للتحليل الكمي للميتوفاجي في خلايا β البنكرياس: أولا ، مزيج من الأصباغ الخاصة بالميتوكوندريا المنفذة للخلايا ، وثانيا ، مراسل الميتوفاجي المشفر وراثيا. هاتان التقنيتان متكاملتان ويمكن نشرهما بناء على احتياجات محددة ، مما يسمح بالمرونة والدقة في معالجة مراقبة جودة الميتوكوندريا كميا.

Abstract

Mitophagy هي آلية لمراقبة الجودة ضرورية للحفاظ على وظيفة الميتوكوندريا المثلى. يؤدي خلل الميتوفاجي β الخلايا إلى عدم كفاية إفراز الأنسولين. غالبا ما تتطلب التقييمات الكمية المتقدمة للميوفاجي استخدام تقارير وراثية. تم تحسين نموذج الماوس mt-Keima ، الذي يعبر عن مسبار قياس نسبة الإثارة المزدوجة الحساسة لدرجة الحموضة المستهدفة بالميتوكوندريا لقياس الميتوفاجي عبر قياس التدفق الخلوي ، في خلايا β. يمكن استخدام نسبة انبعاثات الطول الموجي mt-Keima الحمضية إلى المحايدة لتحديد mitophagy بقوة. ومع ذلك ، قد يكون استخدام مراسلي الميتوفاجي الوراثي أمرا صعبا عند العمل مع نماذج الفئران الجينية المعقدة أو الخلايا التي يصعب نقلها ، مثل الجزر البشرية الأولية. يصف هذا البروتوكول طريقة تكميلية جديدة قائمة على الصبغة لتحديد كمية الميتوفاجي β الخلايا في الجزر الأولية باستخدام MtPhagy. MtPhagy عبارة عن صبغة حساسة لدرجة الحموضة ونفاذة للخلايا تتراكم في الميتوكوندريا وتزيد من شدة مضانها عندما تكون الميتوكوندريا في بيئات منخفضة الأس الهيدروجيني ، مثل الجسيمات الحالة أثناء الميتوفاجي. من خلال الجمع بين صبغة MtPhagy و Fluozin-3-AM ، وهو مؤشر Zn2+ يختار الخلايا β ، و Tetramethylrhodamine ، إيثيل استر (TMRE) لتقييم إمكانات غشاء الميتوكوندريا ، يمكن قياس تدفق الميتوفاجي على وجه التحديد في خلايا β عبر قياس التدفق الخلوي. هذان النهجان متكاملان للغاية ، مما يسمح بالمرونة والدقة في تقييم مراقبة جودة الميتوكوندريا في العديد من نماذج الخلايا β.

Introduction

تنتج خلايا β البنكرياس الأنسولين وتفرز لتلبية متطلبات التمثيل الغذائي ، ويكون خلل الخلايا β مسؤولا عن ارتفاع السكر في الدم وظهور مرض السكري في كل من مرض السكري من النوع 1 والنوع 2. تقوم الخلايا β بإقران استقلاب الجلوكوز بإفراز الأنسولين عبر طاقة الميتوكوندريا والإنتاج الأيضي ، والتي تعتمد على احتياطي كتلة الميتوكوندريا الوظيفية1،2،3. للحفاظ على الوظيفة المثلى للخلايا β ، تعتمد الخلايا β على آليات مراقبة جودة الميتوكوندريا لإزالة الميتوكوندريا القديمة أو التالفة والحفاظ على كتلة الميتوكوندريا الوظيفية4. يعد الالتهام الذاتي الانتقائي للميتوكوندريا ، المعروف أيضا باسم الميتوفاجي ، مكونا رئيسيا لمسار مراقبة جودة الميتوكوندريا.

غالبا ما تعتمد تقييمات الميتوفاجي في الخلايا الحية على التغيرات في درجة حموضة الميتوكوندريا التي تحدث أثناء الميتوفاجي. تحتوي الميتوكوندريا على درجة حموضة قلوية قليلا ، وتوجد الميتوكوندريا السليمة عادة في العصارة الخلوية المحايدة الأس الهيدروجيني. أثناء الميتوفاجي ، يتم دمج الميتوكوندريا التالفة أو المختلة وظيفيا بشكل انتقائي في البلعمة الذاتية ويتم إزالتها في النهاية داخل الجسيمات الحالةالحمضية 5. تستخدم العديد من نماذج الفئران المراسل المعدلة وراثيا في الجسم الحي ، مثل mt-Keima6 و mitoQC7 و CMMR8 ، بالإضافة إلى مجسات الميتوفاجي القابلة للنقل ، مثل Cox8-EGFP-mCherryplasmid 9 ، هذا التغيير في الأس الهيدروجيني لتوفير تقييمات كمية للميتوفاجي. تم تحسين استخدام الفئران المعدلة وراثيا التي تعبر عن مسبار نسبة الإثارة المزدوجة الحساسة للأس الهيدروجيني mt-Keima لتقييم الميتوفاجي في الجزر الصغيرة والخلايا β عبر قياس التدفق الخلوي10,11. يمكن استخدام نسبة انبعاثات الطول الموجي mt-Keima الحمضية إلى المحايدة (نسبة الإثارة الحمضية 561 نانومتر إلى الإثارة المحايدة 480 نانومتر) لتحديد حجم الميتوفاجي 6,12 بقوة.

يصف هذا البروتوكول نهجا محسنا لتقييم تدفق الميتوفاجي في الجزر الأولية والخلايا β المعزولة من الفئران المعدلة وراثيا10,11 mt-Keima. في حين أن mt-Keima هو مسبار حساس للغاية ، إلا أنه يتطلب إما مخططات معقدة لتربية أو نقل الخلايا ، والتي يمكن أن تكون صعبة في كثير من الأحيان عند العمل مع نماذج وراثية أخرى أو مع الجزر البشرية الأولية. بالإضافة إلى ذلك ، فإن استخدام أشعة الليزر الفلورية المتعددة وأجهزة الكشف لتحديد مجموعات الخلايا المحايدة والحمضية يمكن أن يحد من الاستخدام التوافقي لمراسلي الفلورسنت الآخرين.

للتغلب على هذه التحديات ، يصف هذا البروتوكول أيضا قناة فلورية واحدة تكميلية ، طريقة قائمة على الصبغة للكشف القوي عن الميتوفاجي في خلايا β من جزر الفئران المعزولة. يستخدم هذا النهج ، المشار إليه باسم طريقة MtPhagy ، مزيجا من ثلاثة أصباغ منفذة للخلايا لاختيار خلايا β ، وتحديد مجموعات الخلايا التي تخضع بنشاط ل mitophagy ، وتقييم إمكانات غشاء الميتوكوندريا (MMP أو Δψm) في وقت واحد.

أول هذه الأصباغ هو Fluozin-3-AM ، وهو مؤشر Zn2+ منفذ للخلايا مع Ex / Em 494/516 nm13. تضم جزر الفأر مجموعة غير متجانسة من الخلايا المتميزة وظيفيا ، بما في ذلك خلايا α و β و δ و PP. تشكل الخلايا β حوالي 80٪ من الخلايا داخل جزيرة الفأر ويمكن تمييزها عن أنواع الخلايا الجزيرية الأخرى نظرا لتركيزها العالي Zn2+ داخل حبيبات الأنسولين14,15 ، مما يسمح بتحديد الخلايا β على أنهاعدد سكان Fluozin-3-AM المرتفع. تستخدم صبغة MtPhagy ، وهي صبغة حساسة لدرجة الحموضة يتم تجميدها على الميتوكوندريا عبر رابطة كيميائية وتنبعث منها مضان ضعيف ، في هذا البروتوكول16. عند تحريض الميتوفاجي ، يتم دمج الميتوكوندريا التالفة في الليزوزوم الحمضي ، وتزيد صبغة MtPhagy من شدة مضانها في بيئة الأس الهيدروجيني المنخفض (Ex / Em 561 / 570-700 نانومتر).

بالإضافة إلى ذلك ، يتم استخدام رباعي ميثيل رودامين ، إيثيل استر (TMRE) ، لتقييم MMP. TMRE عبارة عن صبغة موجبة الشحنة قابلة للنفاذ للخلايا (Ex / Em 552/575 نانومتر) يتم عزلها بواسطة الميتوكوندريا السليمة بسبب الشحنة السالبة النسبية التي تدعمها إمكانات الغشاء17. تعمل الميتوكوندريا التالفة أو غير الصحية على تبديد إمكانات غشائها ، مما يؤدي إلى انخفاض القدرة على عزل TMRE. باستخدام هذه الأصباغ معا ، يمكن تحديد الخلايا β التي تخضع للمريء على أنها FluozinhighMtPhagyعاليةTMREمنخفضة السكان عن طريق قياس التدفق الخلوي. نظرا لأن الميتوفاجي عملية ديناميكية وليست ثابتة ، فقد تم تحسين هذا البروتوكول لتقييم تدفق الميتوفاجي باستخدام فالينومايسين ، وهو K + -ionophore الذي يحفز الميتوفاجي بعد تبديد MMP18. تسمح مقارنة الميتوفاجي في وجود وغياب فالينوميسين بتقييم تدفق الميتوفاجي في مجموعات عينات مختلفة.

تسمح الطبيعة القائمة على الصبغة للنهج الحالي باستقرائه على الجزر البشرية وغيرها من أنواع الخلايا التي يصعب نقلها وتتحايل على الحاجة إلى مخططات معقدة لتربية ، على عكس بروتوكول mt-Keima. الهدف الشامل لهذا البروتوكول هو تحديد حجم الميتوفاجي في الخلايا β على مستوى الخلية الواحدة عبر طريقتين مستقلتين قائمتين على قياس التدفق الخلوي. معا، يصف هذا البروتوكول طريقتين قويتين ومتكاملتين تسمحان بالدقة والمرونة في الدراسة الكمية لمراقبة جودة الميتوكوندريا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت مراجعة الدراسات على المقدمة في هذا البروتوكول والموافقة عليها من قبل لجنة رعاية واستخدام المؤسسية بجامعة ميشيغان. تم استخدام ذكور الفئران C57BL / 6J البالغة من العمر عشرين أسبوعا ، إما على نظام غذائي منتظم للدهون لمدة 15 أسبوعا (RFD) أو نظام غذائي عالي الدهون (HFD) ، لهذه الدراسة.

1. تقييم الميتوفاجي عبر نهج MtPhagy القائم على الصبغة (الطريقة 1)

  1. إعداد جزيرة الفأر والعلاج
    1. قم بإجراء استزراع الجزر والتعرض للفالينوميسين باتباع الخطوات أدناه.
      1. عزل الجزر من إما اتباع نظام غذائي منتظم للدهون (RFD) أو نظام غذائي عالي الدهون (HFD ، 60 سعرة حرارية ٪ الدهون19) الفئران ، باتباع الطرق الموصوفة سابقا2،10.
      2. عينات جزيرة المستنبتة طوال الليل عند 37 درجة مئوية في وسط RPMI مكملة ب 100 وحدة / مل مضاد حيوي مضاد حيوي ، 50 وحدة / مل بنسلين - ستربتومايسين ، 1 مللي مول بيروفات الصوديوم ، 10 مللي مول HEPES و 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) (انظر جدول المواد). سيشار إلى هذه الوسيلة باسم "وسط الجزيرة".
      3. باستخدام ماصة ، اختر 100 جزيرة لكل حالة في أطباق بتري 6 سم في 2 مل من وسط الجزيرة.
        ملاحظة: الشروط المستخدمة لهذا البروتوكول: (1) التحكم غير الملوث: جزر RFD غير الملوثة ؛ (2) التحكم في DAPI فقط: جزر RFD ملطخة ب DAPI ؛ (3) التحكم في Fluozin-3-AM فقط: جزر RFD ملطخة ب Fluozin-3-AM ؛ (4) التحكم في MtPhagy فقط: جزر RFD ملطخة ب MtPhagi ؛ (5) التحكم في TMRE فقط: جزر RFD الملطخة ب TMRE ؛ (6) RFD غير معالج: جزر RFD ملطخة ب MtPhagy و TMRE و Fluozin-3-AM و DAPI ؛ (7) جزر RFD المعرضة للفالينوميسين: جزر RFD المعرضة للفالينوميسين وملطخة ب MtPhagy و TMRE و Fluozin-3-AM و DAPI ؛ (8) HFD غير معالج: جزر HFD ملطخة ب MtPhagy و TMRE و Fluozin-3-AM و DAPI ؛ (9) جزر HFD المعرضة للفالينومايسين: جزر HFD المعرضة للفالينوميسين وملطخة ب MtPhagy و TMRE و Fluozin-3-AM و DAPI.
      4. بالنسبة للحالتين (7) و (9) (انظر الملاحظة أعلاه) المعرضتين للفالينومايسين ، أضف 2 ميكرولتر من مخزون 250 nΜ valinomycin (انظر جدول المواد) إلى الجزر الصغيرة في طبق بتري لمدة 3 ساعات للحث على الميتوفاجي.
    2. أداء تفكك خلية واحدة.
      1. بعد التعرض للفالينوميسين لمدة 3 ساعات ، اختر 100 جزيرة من كل حالة في أنابيب طرد مركزي منفصلة باستخدام ماصة.
      2. قم بتدوير الجزر عند 350 × جم لمدة 1 دقيقة عند 10 درجات مئوية وتخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة.
      3. اغسل العينات 2x ب 1 مل 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ، مع خطوات دوران (350 × جم / 1 دقيقة ، 10 درجات مئوية) بين كل غسلة. تخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة بعد كل غسلة.
      4. لفصل الجزر إلى خلايا مفردة ، أضف 500 ميكرولتر من 0.05٪ تربسين (تم تسخينه مسبقا إلى 37 درجة مئوية) إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق لعينة واحدة لمنع الإفراط في هضم الجزر. ماصة صعودا وهبوطا بشكل متكرر حتى يتم تفريق الجزر بشكل واضح.
      5. أضف على الفور 1 مل من وسط الجزيرة المسخن مسبقا لتحييد التربسين. كرر التربسين وتحييده لكل عينة ، واحدة تلو الأخرى.
      6. قم بتدوير العينات عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 10 درجات مئوية. إزالة طافية مع ماصة ، والحرص على عدم إزعاج بيليه.
        ملاحظة: ستكون الحبيبات حساسة للعينات المعرضة للفالينوميسين.
      7. اغسل العينات 2x بوسط RPMI ، بدون فينول أحمر ، مكمل ب 100 وحدة / مل مضاد حيوي مضاد حيوي ، 50 وحدة / مل بنسلين ستربتومايسين ، 1 مللي مول بيروفات الصوديوم ، 10 مللي مول HEPES ، و 10٪ ألبومين مصل بقري (BSA). سيشار إلى هذا الوسيط باسم "وسط تدفق الجزيرة". قم بتضمين خطوات الدوران (350 × جم / 1 دقيقة ، 10 درجات مئوية) بين كل غسلة. تخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة بعد كل غسلة.
    3. قم بتلطيخ الخلايا باستخدام MtPhagy و TMRE و Fluozin-3-AM و DAPI للتحضير لقياس التدفق الخلوي.
      1. إعادة تعليق عينات الجزر في 500 ميكرولتر من وسط تدفق الجزيرة.
      2. أضف 0.25 ميكرولتر من مخزون MtPhagy 100 ميكرومتر (انظر جدول المواد) إلى الأنابيب التي تتلقى صبغة MtPhagy (الشروط 4 و 6 و 7 و 8 و 9 ، ملاحظة إلى الخطوة 1.1.1).
      3. أضف 0.25 ميكرولتر من مخزون TMRE 100 ميكرومتر (انظر جدول المواد) إلى الأنابيب التي تتلقى صبغة TMRE (الشروط 5 و 6 و 7 و 8 و 9).
      4. أضف 0.25 ميكرولتر من مخزون 1 mM Fluozin-3-AM (انظر جدول المواد) إلى الأنابيب التي تتلقى صبغة Fluozin-3-AM (الشروط 3 و 6 و 7 و 8 و 9).
      5. أنابيب دوامة بسرعة منخفضة لمدة 5 ثوان لخلط.
      6. لف أنابيب الطرد المركزي الدقيقة بورق الألمنيوم للحماية من الضوء واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. في منتصف الطريق من خلال الحضانة ، أنابيب دوامة بسرعة منخفضة لمدة 5-10 ثوان للخلط.
      7. بعد الحضانة ، عينات الطرد المركزي عند 350 × جم لمدة 1 دقيقة عند 10 درجة مئوية. تخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة.
      8. أعد تعليق العينات في وسط تدفق جزيرة 500 ميكرولتر. أضف 0.2 ميكروغرام / مل DAPI (انظر جدول المواد) إلى الشروط 2 و 6 و 7 و 8 و 9.
      9. قم بتدوير العينات عند 350 × جم لمدة 1 دقيقة عند 10 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة وأعد تعليقها في 500 ميكرولتر من وسط تدفق الجزيرة.
      10. ضع العينات على الجليد.
  2. قياس التدفق الخلوي
    1. بدء تشغيل الأداة (انظر جدول المواد).
      ملاحظة: سيعمل أي مقياس خلوي للتدفق مع المرشحات المناسبة. تم استخدام المرشحات التالية في هذه الدراسة: (1) VL1 ل DAPI: الإثارة / الانبعاث - 405 نانومتر / 440 نانومتر (50 نانومتر) ؛ (2) BL1 ل Fluozin-3-AM: الإثارة / الانبعاث - 488 نانومتر / 530 نانومتر (30 نانومتر) ؛ (3) BL2 لصبغة MtPhagi: الإثارة / الانبعاث - 488 نانومتر / 590 نانومتر (40 نانومتر) ؛ (4) YL1 ل TMRE: الإثارة/الانبعاث - 561 نانومتر/585 نانومتر (16 نانومتر).
    2. اضبط الفولتية للأمام (FSC) والتشتت الجانبي (SSC) لضمان وجود مجموعات الخلايا في مركز مخطط التشتت. بالنسبة لهذا البروتوكول ، كانت الفولتية المستخدمة 120 فولت ل FSC و 260 فولت ل SSC لضمان سقوط الخلايا بالتساوي داخل FSC-A مقابل. مؤامرة SSC-A (الشكل 1 أ).
    3. لاستبعاد الخلايا غير المفردة ، أضف بوابة مستطيلة على FSC-H مقابل. FSC-W متبوعا ب SSC-H مقابل SSC-W (الشكل 1B ، C).
    4. اضبط الفولتية والتعويض ل DAPI لتصفية الخلايا β الحية. قم بتعيين بوابات مضان لكل فلوروفور يستخدم بناء على عينة RFD غير الملوثة (الأشكال 1D-F).
      ملاحظة: الفولتية المستخدمة لكل قناة: (1) VL1: 320-360 فولت ؛ (2) BL1: 300-340 فولت ؛ (3) BL2: 260-300 فولت ؛ (4) YL1: 300-340 فولت.
    5. بمجرد إنشاء البوابات ، اجمع 10000 حدث لكل عينة.
      ملاحظة: باستخدام نهج البوابة هذا ، تم تقييم مستويات الميتوفاجي تحت الظروف القاعدية وعند تحريض الفالينومايسين في كل من جزر RFD و HFD (الشكل 2).
    6. حفظ البيانات كملفات FCS للتحليل.

2. تقييم الميتوفاجي باستخدام مراسل mt-Keima المشفر وراثيا (الطريقة 2)

  1. إعداد جزيرة الفأر وتفكك الخلية الواحدة
    1. قم بإجراء استزراع الجزر والتعرض للفالينوميسين باتباع الخطوات أدناه.
      1. عزل جزر البنكرياس من الفئران البرية (WT) و mt-Keima/+ (mt-Keima)6. في هذه الطريقة ، تم استخدام ذكور WT أو mt-Keima/+ التي تبلغ من العمر 20 أسبوعا من الفئران RFD.
      2. عينات جزيرة الاستزراع بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية في وسط الجزيرة.
      3. باستخدام ماصة ، اختر 100 جزيرة لكل حالة في أطباق بتري 6 سم مع 2 مل من وسط الجزيرة.
        ملاحظة: الشروط المستخدمة لهذا البروتوكول: (1) التحكم غير الملوث: جزر WT غير الملوثة ؛ (2) تحكم DAPI فقط: جزر WT ملطخة ب DAPI ؛ (3) التحكم في Fluozin-3-AM فقط: جزر WT ملطخة ب Fluozin-3-AM ؛ (4) جبل كيما السيطرة فقط: غير ملوثة جبل كيما / + الجزر. (5) غير معالجة: mt-Keima/+ جزر ملطخة ب Fluozin-3-AM و DAPI ؛ (6) فالينومايسين: جبل كيما / + جزر معرضة للفالينوميسين وملطخة ب Fluozin-3-AM و DAPI.
      4. للحالة (6) مع التعرض للفالينومايسين ، أضف 2 ميكرولتر من 250 نانومتر من مرق فالينوميسين إلى الجزر في طبق بتري لمدة 3 ساعات للحث على الميتوفاجي.
    2. أداء تفكك خلية واحدة.
      1. قم بتنفيذ خطوات تفكك الخلية المفردة، كما هو موضح في الخطوة 1.1.2.
    3. خلايا وصمة عار مع Fluozin-3-AM و DAPI.
      1. إعادة تعليق عينات الجزر في 500 ميكرولتر من وسط تدفق الجزيرة.
      2. أضف 0.25 ميكرولتر من 1 mM Fluozin-3-AM إلى الأنابيب التي تتلقى صبغة Fluozin-3-AM (الشروط 3 و 5 و 6).
      3. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية وانتقل إلى علاج DAPI ، كما هو موضح في الخطوات 1.1.3.5-1.3.10.
  2. قياس التدفق الخلوي
    1. بدء تشغيل الأداة. سيعمل أي مقياس خلوي للتدفق مع المرشحات المناسبة.
      ملاحظة: استخدمت المرشحات التالية في هذه الدراسة: (1) VL1 ل DAPI: الإثارة/الانبعاث - 405 نانومتر/440 نانومتر (50 نانومتر)؛ (2) BL1 ل Fluozin-3-AM: الإثارة / الانبعاث - 488 نانومتر / 530 نانومتر (30 نانومتر) ؛ (3) VL3 لجبل كيما محايد: الإثارة / الانبعاث - 405 نانومتر / 603 نانومتر (48 نانومتر) ؛ (4) YL2 لحمض mt-Keima: الإثارة / الانبعاث - 561 نانومتر / 620 نانومتر (15 نانومتر).
    2. اضبط جهد FSC و SSC واستبعد الخلايا غير المفردة كما هو موضح في الخطوات 1.2.2-1.2.3 (الأشكال 3A-C).
    3. اضبط الفولتية والتعويض ل DAPI و Fluozin-3-AM و mt-Keima باستخدام عناصر تحكم غير ملوثة وأحادية موجبة (الشروط 1-4) لضمان تمييز مجموعات الخلايا الإيجابية الفلورية عن الخلايا غير الملوثة. بمجرد تطبيق التعويض المناسب على كل قناة ، قم بإعداد بوابة DAPI السالبة والبوابات الإيجابية Fluozin-3-AM للتصفية بحثا عن خلايا β الحية (الأشكال 3D-E).
    4. قم بإعداد مخطط بوابة مثلث باستخدام عينة mt-Keima الإيجابية (الحالة 4) لتحديد مجموعات الخلايا الحمضية والمحايدة (الشكل 3F).
      ملاحظة: الفولتية المستخدمة عادة لكل قناة: (1) VL1: 320-340 فولت ؛ (2) BL2: 260-280 فولت ؛ (3) VL3: 280-300 فولت ؛ (4) YL2: 280-300 فولت.
    5. بمجرد إنشاء البوابات ، اجمع 10000 حدث لكل عينة. مخططات البوابات للشرطين 5 و 6 موضحة في الشكل 3A-G.
    6. حفظ البيانات كملفات FCS للتحليل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تقييم الميتوفاجي من خلال نهج MtPhagy القائم على الصبغة
تم تحسين هذا النهج القائم على الصبغة لتحليل تدفق الميتوفاجي داخل خلايا β الفأر الأولية دون الحاجة إلى مراسل وراثي ، باستخدام Fluozin-3-AM و TMRE و MtPhagy بالإضافة إلى DAPI لاستبعاد الخلايا الميتة. من خلال إقران هذه الأصباغ مع فالينوميسين للحث على الميتوفاجي ، يحدد هذا البروتوكول طريقة قائمة على الصبغة لقياس تدفق الميتوفاجي بشكل انتقائي في خلايا β الفأرالأولية 18. بالنسبة للبيانات الموضحة باستخدام طريقة MtPhagy هذه ، تم تحليل كل من الميتوفاجي القاعدي والناجم عن الفالينومايسين في الجزر المعزولة إما من النظام الغذائي العادي للدهون (RFD) أو النظام الغذائي عالي الدهون (HFD ، 60 سعرة حرارية ٪ دهون) الفئران المغذية لتقييم تأثير الإجهاد الأيضي على تدفق الميتوفاجي. لتحديد السكان محل الاهتمام ، تم إغلاق الخلايا باستخدام جزر RFD غير المعالجة. تم ضبط الفولتية FSC و SSC أولا لتحقيق توزيع متساو للخلايا على مخطط SSC-A مقابل FSC-A (الشكل 1A). لتحديد الخلايا المفردة ، كل من FSC-H مقابل. FSC-W و SSC-H مقابل. تم استخدام مخططات SSC-W ، حيث تم استبعاد المضاعفات بسبب قيم إشارة العرض الأعلى مقارنة بالخلايا المفردة (الشكل 1B ، C). بعد ذلك ، تم اختيار الخلايا السالبة DAPI لاستبعاد الخلايا الميتة20 (الشكل 1D). بعد إنشاء البوابات الأولية ، تم استخدام أدوات التحكم الملطخة الفردية لإنشاء بوابات مضان ل Fluozin-3-AM و MtPhagy و TMRE (الشكل 1E-G) بالإضافة إلى ضوابط التعويض لقياس التدفق الخلوي متعدد الألوان.

بمجرد إنشاء هذه البوابات الأولية والفلورية ، تم تعريف الخلايا β ذات الاستخدام العالي للمريء على أنها FluozinhighMtPhagy High TMRELow Population في الربع 3 (Q3) باستخدام RFD دون التعرض للفالينوميسين (الشكل 1H). باستخدام استراتيجية البوابات هذه ، تم تمييز مستويات الميتوفاجي القاعدية والميتومايسين في كل من جزر RFD و HFD (الشكل 2). لتحديد تدفق الميتوفاجي ، القاعدية مقابل. تمت مقارنة مستويات الميتوفاجي التي يسببها الفالينومايسين باستخدام النسبة التالية:

Equation 1

باستخدام هذه النسبة ، تم تحديد تدفق الميتوفاجي ومقارنته في RFD مقابل. HFD β الخلايا لتقييم الاختلافات في الميتوفاجي بعد تحريض السمنة ومقاومة الأنسولين المحيطية. القياس الكمي لتدفق الميتوفاجي في RFD مقابل. تظهر عينات HFD في الشكل 2E. تسلط هذه النتيجة الضوء على جدوى هذا الفحص لتحديد حجم الميتوفاجي في الخلايا β باستخدام نهج مباشر قائم على الصبغة. يمكن أيضا استخدام هذه الطريقة في الجزر البشرية والخلايا التي يصعب نقلها والجزر الصغيرة المعزولة من النماذج الجينية المعقدة حيث يكون التهجين مع نموذج mt-Keima المعدل وراثيا مرهقا.

تقييم الميتوفاجي باستخدام مراسل mt-Keima المشفر وراثيا
Mt-Keima هو بروتين فلوري مزدوج الإثارة ينصهر مع تسلسل توطين Cox8 الذي يتيح استهدافه لغشاء الميتوكوندريا الداخلي. تسمح خاصية الفلورسنت ثنائية النمط ل mt-Keima بتبديل أطياف الإثارة من الطول الموجي المحايد (405 نانومتر) إلى الطول الموجي الحمضي (561 نانومتر) ، اعتمادا على الرقم الهيدروجيني للمقصورة داخل الخلايا6. يتيح ذلك إجراء تحليل مضان نسبي قوي للميتوفاجي ، حيث تشير الزيادة في النسبة الحمضية إلى المحايدة إلى تحريض الميتوفاجي. في هذا البروتوكول ، تم استخدام Fluozin-3-AM أيضا لاختيار الخلايا β عبر قياس التدفق الخلوي. في هذه الدراسات التمثيلية ، تم تقييم تدفق الميتوفاجي باستخدام الجزر المعزولة من الفئران التي تغذت على نظام غذائي RFD10،11. تم ضبط الفولتية FSC و SSC أولا لتحقيق توزيع متساو للخلايا على SSC-A مقابل. مؤامرة FSC-A (الشكل 3 أ). لتحديد الخلايا المفردة ، كل من FSC-H مقابل. FSC-W و SSC-H مقابل. تم استخدام مخططات SSC-W ، حيث تم استبعاد المضاعفات بسبب قيم إشارة العرض الأعلى مقارنة بالخلايا المفردة (الشكل 3B ، C). تم تحديد استراتيجية الجهد والبوابات ل DAPI و Fluozin-3-AM باستخدام جزر أحادية اللون (الشكل 3D ، E). ثم تم تحديد بوابات المثلث للسكان الحمضية والمحايدة باستخدام عينة جبل كيما الإيجابية دون التعرض للفالينوميسين (الشكل 3F).

بمجرد إنشاء هذه البوابات الأولية والفلورية ، تم تقييم تدفق الميتوفاجي باستخدام التغيرات القاعدية والتغيرات التي يسببها الفالينومايسين في مضان mt-Keima (الشكل 3F ، G). لتحديد تدفق الميتوفاجي ، الميتوفاجي القاعدي مقابل. تمت مقارنة المستويات المستحثة بالفالينوميسين باستخدام النسبة التالية:

Equation 2

باستخدام هذه النسبة ، تم قياس تدفق الميتوفاجي في خلايا RFD. يظهر القياس الكمي لهذه النتيجة في الشكل 3H. الأهم من ذلك ، أن هذه النتائج قابلة للمقارنة مع النتائج في جزر RFD التي تم إنشاؤها باستخدام نهج MtPhagy (الشكل 3H).

Figure 1
الشكل 1: مخطط البوابات لطريقة MtPhagy. (أ) مخطط التدفق يعرض مخطط البوابة للاختيار لجميع الخلايا. (B) بوابات للاختيار للمفردات بناء على FSC-H مقابل FSC-W و (C) SSC-H مقابل SSC-W. د: بوابة للخلايا السالبة لمؤشر دابي لاستبعاد الخلايا الميتة. (ه) بوابات للخلاياالعالية Fluozin-3-AM لاختيارها للخلايا β. (F) مخطط بوابة لصبغة MtPhagy لتحديد مجموعات خلايا MtPhagyالعالية و MtPhagyالمنخفضة. (ز) مخطط بوابات ل TMRE لتحديد تجمعات الخلاياالعالية TMRE و TMREالمنخفضة. (ح) مخطط بوابة رباعي تم إنشاؤه مع جزر RFD غير المعالجة لتحديد الخلاياالمنخفضة FluozinhighMtPhagy عالية TMRE في الربع 3 (Q3) كخلايا β تخضع للميتوفاجي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: تقييم اختلافات تدفق الميتوفاجي في خلايا β الفئران بعد الإجهاد الأيضي باستخدام مخطط بوابات MtPhaggy. مخططات قياس التدفق الخلوي التمثيلية ل (أ) خلايا β RFD غير المعالجة ، (ب) خلايا β HFD غير المعالجة ، (ج) خلايا RFD β المعرضة للفالينومايسين ، و (د) خلايا HFD β المعرضة للفالينومايسين. (ه) القياس الكمي لتدفق الميتوفاجي في الخلايا β ، محسوبة باستخدام نسبة الخلاياالمنخفضة MtPhagyعاليةTMRE المعرضة للفالينوميسين إلى الخلاياالمنخفضة MtPhagyعاليةTMRE غير المعرضة للفالينومايسين ، لكل من عينات RFD و HFD. * p < 0.05 بواسطة اختبار t غير المزاوج للطالب. ن = 3 / مجموعة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: مخطط البوابات لطريقة mt-Keima والمقارنة بين الطريقتين. (أ) مخطط التدفق الذي يعرض مخطط البوابة للاختيار لجميع الخلايا. (B) بوابات للاختيار للمفردات بناء على FSC-H مقابل FSC-W و (C) SSC-H مقابل SSC-W. د: بوابة للخلايا السالبة لمؤشر دابي لاستبعاد الخلايا الميتة. (ه) بوابات للخلاياالعالية Fluozin-3-AM لاختيارها للخلايا β. (F) مخططات قياس التدفق الخلوي التمثيلية لخلايا mt-Keima/+ غير المعالجة و (G) mt-Keima/+ الخلايا المعرضة للفالينومايسين. (ح) القياس الكمي لتدفق الميتوفاجي في الخلايا β من الفئران التي تغذت على RFD ، محسوبة باستخدام نسبة الخلايا الحمضية / المحايدة المعرضة للفالينوميسين إلى نسبة الخلايا الحمضية / المحايدة غير المعرضة للفالينوميسين باستخدام طريقة mt-Keima ومقارنتها بطريقة MtPhagy (بيانات بروتوكول MtPhagy الموضحة أصلا في الشكل 2E). ن = 3 / مجموعة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وصف هذا البروتوكول طريقتين متكاملتين لقياس تدفق الميتوفاجي في جزر الفأر الأولية المنفصلة. باستخدام طريقة mt-Keima ، تم تحديد الزيادة في الميتوفاجي كنسبة متزايدة من الخلايا الحمضية (561 نانومتر) / المحايدة (405 نانومتر) ، بينما في طريقة MtPhagy ، تم قياس زيادة تدفق الميتوفاجي كزيادة فيعدد الخلايا المنخفضة FluozinhighMtPhagyعاليةTMRE. تسمح هذه الطرق بإجراء تقييمات سريعة وكمية ومحددة للخلايا β لتدفق المريء.

كلتا الطريقتين هي نهج مباشر. ومع ذلك ، فإن بعض الخطوات داخل هذا البروتوكول ضرورية للحصول على نتائج عالية الجودة وقابلة للتكرار. تتضمن هذه الخطوات: (1) تفكك الجزيرة المناسب للحصول على تعليق خلية واحدة ، ولكنه معتدل بما يكفي لضمان صلاحية الجزيرة ، (2) إنشاء بوابة بعناية لتحديد السكان محل الاهتمام بشكل صحيح ، و (3) التحديد الكمي الموضوعي لبيانات قياس التدفق الخلوي عبر أدوات برمجية لضمان تقييم غير متحيز لتدفق الميتوفاجي.

عند اختيار الطريقة التي يجب استخدامها ، يجب مراعاة نوع الخلية وطبيعة النماذج الجينية المستخدمة. طريقة mt-Keima ، إما المستخدمة في الجسم الحي أو المنقولة في المختبر ، هي طريقة مستشهد بها للغاية وتحظى بتقدير كبير لتقييم الميتوفاجي عن طريق قياس التدفق الخلوي أو تصوير الخلايا الحية21. في حين أن طريقة MtPhagy القائمة على الصبغة هي نهج أحدث مقارنة بالمراسلين الجينيين ، إلا أن هناك حالات قد يفضل فيها استخدامها على mt-Keima. في الواقع ، تتغلب طريقة MtPhagy على الحاجة إلى النقل أو مخططات التربية المعقدة ، ويستغرق تلطيخ MtPhagy 30 دقيقة فقط ويتم إجراؤه مباشرة قبل قياس التدفق الخلوي. يمكن استخدام نهج MtPhagy بنجاح في عينات الجزر البشرية الأولية التي يصعب نقلها أيضا. هذا البروتوكول ، الذي يعتمد إما على أصباغ الميتوكوندريا الحساسة لدرجة الحموضة أو المجسات لقياس الميتوفاجي مباشرة ، يختلف عن النهج السابق من Mauro-Lizcano et. al التي استخدمت صبغة MitoTracker Deep Red الحساسة المحتملة للغشاء وتطلب استخدام مثبطات الميتوفاجي والليزوزومات لتحديد تدفق الميتوفاجي عن طريق قياس التدفق الخلوي22. كما ماورو ليزكانو وآخرون. لم يتم اختبار طريقة al في الجزر الصغيرة ، فمن الصعب مقارنتها مباشرة بفعالية طرق MtPhagy أو mt-Keima الموضحة هنا. مجتمعة ، يوفر الجمع بين هذه الأساليب في مجمله عددا متزايدا من الخيارات لتقييم تدفق الميتوفاجي بدقة في فحوصات الخلية المفردة الحية الكمية للغاية.

عيب لكلتا الطريقتين هو عدم توافقها مع تثبيت الخلية. على الرغم من أن كلتا الطريقتين متوافقتان مع طرق تصوير الخلايا الحية ، إلا أن تثبيت الخلية يتداخل مع تدرج الأس الهيدروجيني لكل من MtPhagy و mt-Keima عبر الغشاء الليزوزومي 7,16. كبديل ، تم استخدام مراسل الميتوفاجي mitoQC في عينات ثابتة سابقا7. بالإضافة إلى ذلك ، فإن أحد القيود على كلتا الطريقتين هو الحاجة إلى فصل الجزر قبل قياس التدفق الخلوي ، مما قد يؤثر على صلاحية الخلية. لذلك ، من الأهمية بمكان تلطيخ الخلايا باستخدام DAPI لمراقبة صلاحية الخلية بعد تفكك الجزيرة وضمان معالجة جميع العينات باستمرار. بعد تلطيخ DAPI ، كان متوسط العينات 12.7٪ ± 7.4 خلية ميتة (الشكل 1 د) ، مما يشير إلى أنه يمكن استخدام >80٪ من الخلايا في كل عينة للتحليل. قد تكون مراقبة صلاحية الخلية في كل مرحلة (بعد عزل الجزيرة ، والثقافة ، ثم التفكك) مفيدة أيضا للحصول على معرفة ببقاء الخلية في كل خطوة من خطوات الإجراء. قد يؤثر التباين في التوقيت بين عزل الجزيرة وتفكك الخلية المفردة أيضا على صلاحية الخلية ونتائجها. وبالتالي ، يوصى بالبقاء متسقا مع التوقيت في جميع التجارب.

نظرا لأن مراقبة جودة الميتوكوندريا أمر بالغ الأهمية لصحة الخلايا β ووظيفتها ، فإن التقييمات الصارمة للميتوفاجي باستخدام الأساليب الكيميائية الحيوية أو التصوير التقليدية (بما في ذلك دوران بروتينات الغشاء الخارجي للميتوكوندريا ، وتوطين الميتوكوندريا إلى البلعمة الذاتية أو الجسيمات الحالة ، والمجهر الإلكتروني) يمكن أن تكون صعبة وتستغرق وقتا طويلا. وبالتالي ، فإن تطوير أنظمة مراسل فعالة وقوية للميتوفاجي أمر بالغ الأهمية. يتميز كل من نهج mt-Keima و MtPhagy بالكفاءة ويسمحان بإجراء تقييمات كمية لتدفق الميتوفاجي. تسمح هاتان التقنيتان بالمرونة والدقة في معالجة مراقبة جودة الميتوكوندريا β الخلايا والتحقيق في التفاعلات بين العضيات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

تلقت SAS تمويلا للمنح من شركة Ono Pharmaceutical Co.، Ltd. وهي مستشارة لشركة Novo Nordisk.

Acknowledgments

E.L-D. يقر بالدعم المقدم من المعاهد الوطنية للصحة (T32-AI007413 و T32-AG000114). تقر SAS بالدعم المقدم من JDRF (COE-2019-861) ، والمعاهد الوطنية للصحة (R01 DK135268 ، R01 DK108921 ، R01 DK135032 ، R01 DK136547 ، U01 DK127747) ، وزارة شؤون المحاربين القدامى (I01 BX004444) ، عائلة Brehm ، وعائلة أنتوني.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibiotic-Antimycotic Life Technologies 15240-062
Attune NxT Flow Cytometer Thermofisher Scientific A24858
Dimethyl Sulfoxide Sigma-Aldrich 317275
Fatty Acid Free heat shock BSA powder Equitech BAH66
Fetal bovine serum Gemini Bio 900-108
Fluozin-3AM  Thermofisher Scientific  F24195 100 μg Fluozin-3AM powder reconstituted in 51 μL DMSO and 51 μL Pluronic F-127 to reach 1 mM stock. 
Gibco RPMI 1640 Medium Fisher Scientific 11-875-093
HEPES (1M) Life Technologies 15630-080
MtPhagy dye Dojindo MT02-10 5 μg MtPhagy powder reconstituted with 50 μL DMSO to reach 100 μM stock. 
MtPhagy dye Dojindo MT02-10
Penicillin-Streptomycin (100x) Life Technologies 15140-122 1x Solution used in procotol by diluting 1:10 in ddH2O
Phosphate buffered saline, 10x Fisher Scientific BP399-20 1x Solution used in procotol by diluting 1:10 in ddH2O
Sodium Pyruvate (100x) Life Technologies 11360-070 5 μg MtPhagy powder reconstituted with 50 μL DMSO to reach 100 μM stock. 
TMRE [Tetramethylrhodamine, ethyl ester, perchlorate] Anaspec AS-88061 TMRE powder reconstituted in DMSO to reach 100 μM stock.
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Thermofisher Scientific 25300054
Valinomycin Sigma V0627 Valinomycin powder reconsituted in DMSO to reach 250 nM stock.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kaufman, B. A., Li, C., Soleimanpour, S. A. Mitochondrial regulation of β-cell function: maintaining the momentum for insulin release. Molecular Aspects of Medicine. 42, 91-104 (2015).
  2. Soleimanpour, S. A., et al. The diabetes susceptibility gene Clec16a regulates mitophagy. Cell. 157 (7), 1577-1590 (2014).
  3. Pearson, G., et al. Clec16a, Nrdp1, and USP8 form a ubiquitin-dependent tripartite complex that regulates β-cell mitophagy. Diabetes. 67 (2), 265-277 (2018).
  4. Hattori, N., Saiki, S., Imai, Y. Regulation by mitophagy. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 53, 147-150 (2014).
  5. Berezhnov, A. V., et al. Intracellular pH modulates autophagy and mitophagy. Journal of Biological Chemistry. 291 (16), 8701-8708 (2016).
  6. Sun, N., et al. Measuring in vivo mitophagy. Molecular Cell. 60 (4), 685-696 (2015).
  7. McWilliams, T. G., et al. mito-QC illuminates mitophagy and mitochondrial architecture in vivo. Journal of Cell Biology. 214 (3), 333-345 (2016).
  8. Aoyagi, K., et al. A new beta cell-specific mitophagy reporter mouse shows that metabolic stress leads to accumulation of dysfunctional mitochondria despite increased mitophagy. Diabetologia. 66 (1), 147-162 (2023).
  9. Ma, X., Ding, W. X. A fluorescence imaging based-assay to monitor mitophagy in cultured hepatocytes and mouse liver. Liver Research. 5 (1), 16-20 (2021).
  10. Sidarala, V., et al. Mitophagy protects β cells from inflammatory damage in diabetes. JCI Insight. 5 (24), 141138 (2020).
  11. Gingerich, M. A., et al. An intrinsically disordered protein region encoded by the human disease gene CLEC16A regulates mitophagy. Autophagy. 19 (2), 525-543 (2023).
  12. Sun, N., Malide, D., Liu, J., Rovira, I. I., Combs, C. A., Finkel, T. A fluorescence-based imaging method to measure in vitro and in vivo mitophagy using mt-Keima. Nature Protocols. 12 (8), 1576-1587 (2017).
  13. Zhao, J., Bertoglio, B. A., Gee, K. R., Kay, A. R. The zinc indicator FluoZin-3 is not perturbed significantly by physiological levels of calcium or magnesium. Cell Calcium. 44 (4), 422-426 (2008).
  14. Da Silva Xavier, G. The Cells of the Islets of Langerhans. Journal of Clinical Medicine. 7 (3), 54 (2018).
  15. Thapa, B., et al. Imaging β-cell function using a zinc-responsive MRI contrast agent may identify first responder islets. Frontiers in Endocrinology. 12, 809867 (2022).
  16. Iwashita, H., et al. Live cell imaging of mitochondrial autophagy with a novel fluorescent small molecule. ACS Chemical Biology. 12 (10), 2546-2551 (2017).
  17. Crowley, L. C., Christensen, M. E., Waterhouse, N. J. Measuring mitochondrial transmembrane potential by TMRE staining. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (12), 087361 (2016).
  18. Klein, B., Wörndl, K., Lütz-Meindl, U., Kerschbaum, H. H. Perturbation of intracellular K(+) homeostasis with valinomycin promotes cell death by mitochondrial swelling and autophagic processes. Apoptosis. 16 (11), 1101-1117 (2011).
  19. Ji, Y., et al. Toll-like receptors TLR2 and TLR4 block the replication of pancreatic β cells in diet-induced obesity. Nature Immunology. 20 (6), 677-686 (2019).
  20. Sauvat, A., et al. Quantification of cellular viability by automated microscopy and flow cytometry. Oncotarget. 6 (11), 9467-9475 (2015).
  21. Liu, Y. T., et al. Mt-Keima detects PINK1-PRKN mitophagy in vivo with greater sensitivity than mito-QC. Autophagy. 17 (11), 3753-3762 (2021).
  22. Mauro-Lizcano, M., et al. New method to assess mitophagy flux by flow cytometry. Autophagy. 11 (5), 833-843 (2015).

Tags

تدفق الميتوفاجي ، خلايا البنكرياس β ، النهج التكميلية ، المراسلون الجينيون ، نموذج فأر Mt-Keima ، القياس الكمي للميتوفاجي ، قياس التدفق الخلوي ، مسبار نسبة الإثارة المزدوجة الحساسة لدرجة الحموضة ، انبعاثات الطول الموجي Mt-Keima الحمضية إلى المحايدة ، مراسلو Mitophagy الوراثيون ، نماذج الفئران الجينية المعقدة ، الخلايا التي يصعب نقلها ، الجزر البشرية الأولية ، الطريقة القائمة على الصبغة ، MtPhagy ، صبغة نفاذة للخلايا ، الليزوزومات أثناء الميتوفاجي ، Fluozin-3-AM ، مؤشر Zn2 + ، إستر إيثيل رباعي ميثيل رودامين (TMRE) ، إمكانات غشاء الميتوكوندريا
مناهج تكميلية لاستجواب تدفق الميتوفاجي في خلايا β البنكرياس
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Levi-D’Ancona, E., Sidarala,… More

Levi-D’Ancona, E., Sidarala, V., Soleimanpour, S. A. Complementary Approaches to Interrogate Mitophagy Flux in Pancreatic β-Cells. J. Vis. Exp. (199), e65789, doi:10.3791/65789 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter