Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Komplementære tilgange til at forhøre mitofagiflux i β-celler i bugspytkirtlen

Published: September 15, 2023 doi: 10.3791/65789
Automatic Translation
1,2, 1, 1,3,4
1Department of Internal Medicine, Division of Metabolism, Endocrinology and Diabetes, University of Michigan, Ann Arbor, 2Graduate Program in Immunology, University of Michigan Medical School, 3Department of Molecular and Integrative Physiology, University of Michigan, Ann Arbor, 4VA Ann Arbor Healthcare System

Summary

Denne protokol skitserer to metoder til kvantitativ analyse af mitofagia i bugspytkirtlen β-celler: for det første en kombination af cellegennemtrængelige mitokondriespecifikke farvestoffer og for det andet en genetisk kodet mitofagireporter. Disse to teknikker supplerer hinanden og kan anvendes baseret på specifikke behov, hvilket giver mulighed for fleksibilitet og præcision i kvantitativ håndtering af mitokondriel kvalitetskontrol.

Abstract

Mitofagi er en kvalitetskontrolmekanisme, der er nødvendig for at opretholde optimal mitokondriefunktion. Dysfunktionel β-celle mitofagi, resulterer i utilstrækkelig insulinfrigivelse. Avancerede kvantitative vurderinger af mitofagi, kræver ofte brug af genetiske reportere. mt-Keima-musemodellen, der udtrykker en mitokondrie-målrettet pH-følsom dual-excitation ratiometrisk sonde til kvantificering af mitofagien via flowcytometri, er blevet optimeret i β-celler. Forholdet mellem sure og neutrale mt-Keima-bølgelængdeemissioner kan bruges til robust kvantificering af mitofagi. Brug af genetiske mitofagireportere kan dog være udfordrende, når man arbejder med komplekse genetiske musemodeller eller celler, der er vanskelige at transfektere, såsom primære menneskelige øer. Denne protokol beskriver en ny komplementær farvestofbaseret metode til kvantificering af β-celle mitofagi, i primære øer ved hjælp af MtPhagy. MtPhagy er et pH-følsomt, cellegennemtrængeligt farvestof, der akkumuleres i mitokondrierne og øger dets fluorescensintensitet, når mitokondrier er i miljøer med lav pH, såsom lysosomer under mitofagi. Ved at kombinere MtPhagy-farvestoffet med Fluozin-3-AM, en Zn2+ -indikator, der vælger β-celler, og tetramethylrhodamin, ethylester (TMRE) til vurdering af mitokondriemembranpotentiale, kan mitofagiflux kvantificeres specifikt i β-celler via flowcytometri. Disse to tilgange er meget komplementære, hvilket giver mulighed for fleksibilitet og præcision i vurderingen af mitokondriel kvalitetskontrol i adskillige β-cellemodeller.

Introduction

Pancreas β-celler producerer og udskiller insulin for at imødekomme metaboliske krav, og β-celle dysfunktion er ansvarlig for hyperglykæmi og diabetes debut i både type 1 og type 2 diabetes. β-celler kobler glukosemetabolisme med insulinsekretion via mitokondriel energetik og metabolisk output, som afhænger af en reserve af funktionel mitokondriemasse 1,2,3. For at opretholde optimal β-cellefunktion er β-celler afhængige af mitokondrie kvalitetskontrolmekanismer for at fjerne gamle eller beskadigede mitokondrier og bevare funktionel mitokondriemasse4. Selektiv mitokondriel autofagi, også kendt som mitofagi, er en nøglekomponent i mitokondriekvalitetskontrolvejen.

Vurderinger af mitofagi, i levende celler, er ofte afhængige af ændringer i mitokondriel pH, der opstår under mitofagi. Mitokondrier har en let alkalisk pH, og sunde mitokondrier befinder sig normalt i den pH-neutrale cytosol. Under mitofagi, beskadigede eller dysfunktionelle mitokondrier er selektivt indarbejdet i autofagosomer og til sidst ryddet inden for sure lysosomer5. Flere in vivo transgene mitofagi-reportermusemodeller, såsom mt-Keima6, mitoQC7 og CMMR8, samt transfektable mitofagiprober, såsom Cox8-EGFP-mCherry-plasmid9, bruger denne pH-ændring til at give kvantitative vurderinger af mitofagi. Anvendelse af transgene mus, der udtrykker mt-Keima pH-følsom dual-excitation ratiometrisk sonde, er blevet optimeret til mitofagi-vurderinger i øer og β-celler via flowcytometri10,11. Forholdet mellem sure og neutrale mt-Keima-bølgelængdeemissioner (forholdet mellem sur 561 nm og neutral 480 nm excitation) kan bruges til robust kvantificering af mitofagien 6,12.

Denne protokol beskriver en optimeret tilgang til vurdering af mitofagiflux i primære øer og β-celler isoleret fra mt-Keima transgene mus10,11. Mens mt-Keima er en meget følsom sonde, kræver den enten komplicerede dyreavlsordninger eller transfektion af celler, hvilket ofte kan være udfordrende, når man arbejder i kombination med andre genetiske modeller eller med primære menneskelige øer. Derudover kan brugen af flere fluorescenslasere og detektorer til at identificere neutrale og sure cellepopulationer begrænse den kombinatoriske brug af andre fluorescerende reportere.

For at overvinde disse udfordringer beskriver denne protokol også en komplementær, enkelt fluorescerende kanal, farvestofbaseret metode til robust påvisning af mitofagi, i β-celler fra isolerede museøer. Denne tilgang, kaldet Mtfagy-metoden, anvender en kombination af tre cellegennemtrængelige farvestoffer til at vælge β-celler, kvantificere cellepopulationerne, der aktivt gennemgår mitofagi, og vurdere mitokondriemembranpotentiale (MMP eller Δψm) samtidigt.

Det første af disse farvestoffer er Fluozin-3-AM, en cellegennemtrængelig Zn2+ indikator med en Ex/Em 494/516 nm13. Museøer omfatter en heterogen population af funktionelt forskellige celler, herunder α-, β-, δ- og PP-celler. β-celler udgør ca. 80% af cellerne i museøen og kan skelnes fra andre øcelletyper på grund af deres høje Zn2+ koncentration inden for insulingranulat14,15, hvilket muliggør identifikation af β-celler som Fluozin-3-AMhøj population. MtPhagy-farvestoffet, et pH-følsomt farvestof, der immobiliseres på mitokondrier via en kemisk binding og udsender svag fluorescens, anvendes også i denne protokol16. Ved mitofaginduktion inkorporeres beskadigede mitokondrier i det sure lysosom, og Mtfagy-farvestoffet øger dets fluorescensintensitet inden for det lave pH-miljø (Ex/Em 561/570-700 nm).

Derudover anvendes tetramethylrhodamin, ethylester (TMRE), til vurdering af MMP. TMRE er et cellegennemtrængeligt positivt ladet farvestof (Ex/Em 552/575 nm), der bindes af sunde mitokondrier på grund af den relative negative ladning, der opretholdes af deres membranpotentiale17. Beskadigede eller usunde mitokondrier spreder deres membranpotentiale, hvilket resulterer i nedsat evne til at sekvestre TMRE. Ved hjælp af disse farvestoffer sammen kan β-celler, der gennemgår mitofagi, identificeres som FluozinhøjMtPhagyhøjTMRElav befolkning via flowcytometri. Da mitofagien er en dynamisk snarere end statisk proces, blev denne protokol optimeret til at vurdere mitofagiflux ved anvendelse af valinomycin, en K +-ionofor, der inducerer mitofagi, efter spredning af MMP18. Sammenligning af mitofagi, i nærvær og fravær af valinomycin, muliggør vurdering af mitofagiflux i forskellige prøvegrupper.

Den farvestofbaserede karakter af den nuværende tilgang gør det muligt at ekstrapolere den til menneskelige øer og andre vanskeligt transfekterede celletyper og omgår behovet for komplicerede dyreavlsordninger, i modsætning til mt-Keima-protokollen. Det overordnede mål med denne protokol er at kvantificere mitofagien i β-celler på enkeltcelleniveau via to uafhængige flowcytometribaserede metoder. Samlet set beskriver denne protokol to kraftfulde og komplementære metoder, der giver mulighed for både præcision og fleksibilitet i den kvantitative undersøgelse af mitokondriel kvalitetskontrol.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

De dyreforsøg, der præsenteres i denne protokol, blev gennemgået og godkendt af University of Michigan Institutional Animal Care and Use Committee. Tyve uger gamle mandlige C57BL / 6J mus, på enten en 15-ugers regelmæssig fedtdiæt (RFD) eller fedtfattig diæt (HFD), blev brugt til denne undersøgelse.

1. Vurdering af mitofagi, via den farvestofbaserede MtPhagy-tilgang (metode 1)

  1. Forberedelse og behandling af museøen
    1. Udfør økultur og valinomycineksponering ved at følge nedenstående trin.
      1. Isoler øer fra mus med almindelig fedtkost (RFD) eller fedtrig kost (HFD, 60 kcal% fedt19) efter de tidligere beskrevne metoder 2,10.
      2. Kulturøprøver natten over ved 37 °C i RPMI-medium suppleret med 100 enheder/ml antimykotisk antibiotikum, 50 enheder/ml penicillin-streptomycin, 1 mM natriumpyruvat, 10 mM HEPES og 10% føtalt bovint serum (FBS) (se materialetabel). Dette medium vil blive omtalt som "ømedium".
      3. Brug en pipette til at plukke 100 øer pr. tilstand i 6 cm petriskåle i 2 ml ømedium.
        BEMÆRK: Betingelser anvendt til denne protokol: (1) Ufarvet kontrol: ufarvede RFD-øer; (2) Kun DAPI-kontrol: RFD-øer farvet med DAPI; (3) Kun kontrol af fluozin-3-AM: RFD-øer farvet med Fluozin-3-AM; (4) Kun kontrol af MtPhagy: RFD-øer farvet med MtPhagy; (5) Kun TMRE-kontrol: RFD-øer farvet med TMRE; (6) RFD ubehandlet: RFD-øer farvet med MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM og DAPI; (7) Valinomycineksponerede RFD-øer: RFD-øer eksponeret for valinomycin og farvet med MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM og DAPI; (8) HFD ubehandlet: HFD-øer farvet med MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM og DAPI; (9) Valinomycineksponerede HFD-øer: HFD-øer eksponeret for valinomycin og farvet med MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM og DAPI.
      4. For betingelser (7) og (9) (se bemærkning ovenfor) udsat for valinomycin, tilsættes 2 μL 250 nΜ valinomycin lager (se tabel over materialer) til øer i petriskålen i 3 timer for at fremkalde mitofagi.
    2. Udfør enkeltcelledissociation.
      1. Efter 3 timers valinomycineksponering plukkes 100 øer fra hver tilstand i separate mikrocentrifugerør ved hjælp af en pipette.
      2. Spindeøer ved 350 x g i 1 minut ved 10 °C og kassér supernatanten med en pipette.
      3. Prøverne vaskes 2x med 1 ml 1x fosfatbufret saltvand (PBS) med centrifugeringstrin (350 x g/1 min, 10 °C) mellem hver vask. Kassér supernatant med en pipette efter hver vask.
      4. For at adskille øer i enkeltceller tilsættes 500 μL 0,05% trypsin (forvarmet til 37 ° C) til mikrocentrifugerøret i en prøve for at forhindre overfordøjelse af øer. Pipette op og ned gentagne gange, indtil holmene er synligt spredt.
      5. Tilsæt straks 1 ml forvarmet ømedium for at neutralisere trypsin. Gentag trypsinisering og neutralisering for hver prøve, en ad gangen.
      6. Centrifugeringsprøver ved 500 x g i 5 minutter ved 10 °C. Supernatanten fjernes med en pipette, og pas på ikke at forstyrre pelletten.
        BEMÆRK: Pellet vil være delikat for prøver udsat for valinomycin.
      7. Vask prøver 2x med RPMI-medium, ingen phenolrød, suppleret med 100 enheder/ml antimykotisk-antibiotikum, 50 enheder/ml penicillin-streptomycin, 1 mM natriumpyruvat, 10 mM HEPES og 10% bovint serumalbumin (BSA). Dette medium vil blive omtalt som "øflowmedium". Inkluder centrifugeringstrin (350 x g/1 min, 10 °C) mellem hver vask. Kassér supernatant med en pipette efter hver vask.
    3. Pletceller med MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM og DAPI for at forberede flowcytometri.
      1. Resuspender øprøver i 500 μL øflowmedium.
      2. Der tilsættes 0,25 μL 100 μM MtPhagi-materiale (se materialetabellen) til rør, der modtager MtPhagi-farvestof (betingelser 4, 6, 7, 8 og 9, BEMÆRK til trin 1.1.1).
      3. Tilsæt 0,25 μL 100 μM TMRE-materiale (se materialetabellen) til rør, der modtager TMRE-farvestof (betingelser 5, 6, 7, 8 og 9).
      4. Tilsæt 0,25 μL 1 mM Fluozin-3-AM-lager (se materialetabel) til rør, der modtager Fluozin-3-AM-farvestof (betingelser 3, 6, 7, 8 og 9).
      5. Vortexrør ved lav hastighed i 5 s at blande.
      6. Mikrocentrifugeglas pakkes ind i aluminiumsfolie for at beskytte mod lys og inkuberes ved 37 °C i 30 minutter. Halvvejs gennem inkubation, hvirvelrør ved lav hastighed i 5-10 s at blande.
      7. Efter inkubation centrifugeres prøverne ved 350 x g i 1 min ved 10 °C. Supernatant kasseres med en pipette.
      8. Resuspender prøver i 500 μL øflowmedium. Der tilsættes 0,2 μg/ml DAPI (se materialetabel) til betingelserne 2, 6, 7, 8 og 9.
      9. Centrifugeringsprøver ved 350 x g i 1 min ved 10 °C. Supernatant kasseres med en pipette og resuspenderes i 500 μl øflowmedium.
      10. Placer prøver på is.
  2. Flow cytometri
    1. Start instrumentet (se materialetabel).
      BEMÆRK: Ethvert flowcytometer med de relevante filtre fungerer. Følgende filtre blev anvendt i denne undersøgelse: (1) VL1 for DAPI: Excitation/Emission - 405 nm/440 nm (50 nm); (2) BL1 for fluozin-3-AM: excitation/emission - 488 nm/530 nm (30 nm) (3) BL2 for MtPhagy farvestof: excitation/emission - 488 nm/590 nm (40 nm); (4) YL1 for TMRE: excitation/emission - 561 nm/585 nm (16 nm).
    2. Juster spændingerne for fremad (FSC) og sidespredning (SSC) for at sikre, at cellepopulationer er i midten af spredningsplottet. For denne protokol var de anvendte spændinger 120 V for FSC og 260 V for SSC for at sikre, at celler falder jævnt inden for FSC-A vs. SSC-A-plot (figur 1A).
    3. For at udelukke ikke-enkeltceller skal du tilføje en rektangulær port på FSC-H vs. FSC-W efterfulgt af SSC-H vs. SSC-W (figur 1B,C).
    4. Juster spændinger og kompensation for DAPI for at filtrere efter levende β-celler. Indstil fluorescensporte for hver anvendt fluorofor baseret på den ufarvede RFD-prøve (figur 1D-F).
      BEMÆRK: Spændinger brugt til hver kanal: (1) VL1: 320-360 V; (2) BL1: 300-340 V; (3) BL2: 260-300 V; (4) YL1: 300-340 V.
    5. Når gates er etableret, skal du indsamle 10.000 hændelser pr. prøve.
      BEMÆRK: Ved hjælp af denne gating-tilgang blev mitofaginiveauer under basale forhold og efter valinomycininduktion vurderet i både RFD- og HFD-øer (figur 2).
    6. Gem data som FCS-filer til analyse.

2. Vurdering af mitofagi: ved hjælp af den genetisk kodede mt-Keima-reporter (metode 2)

  1. Forberedelse af museø og enkeltcelledissociation
    1. Udfør økultur og valinomycineksponering ved at følge nedenstående trin.
      1. Isoler bugspytkirteløer fra vildtype- (WT) og mt-Keima/+ (mt-Keima) mus6. I denne metode blev 20 uger gamle mandlige WT eller mt-Keima / + fodrede RFD-mus brugt.
      2. Kulturøprøver natten over ved 37 °C i holmmedium.
      3. Brug en pipette til at plukke 100 øer pr. tilstand i 6 cm petriskåle med 2 ml ømedium.
        BEMÆRK: Betingelser anvendt til denne protokol: (1) Ufarvet kontrol: Ufarvede WT-øer; (2) Kun DAPI-kontrol: WT-øer farvet med DAPI; (3) Kun kontrol af fluozin-3-AM: WT-øer farvet med Fluozin-3-AM; (4) Kun kontrol af mt-Keima: Ufarvede mt-Keima/+-øer (5) Ubehandlet: mt-Keima/+-øer farvet med fluozin-3-AM og DAPI; (6) Valinomycin: mt-Keima/+-øer, der udsættes for valinomycin og farves med fluozin-3-AM og DAPI.
      4. For tilstand (6) med valinomycineksponering tilsættes 2 μL 250 nM valinomycinlager til øer i petriskål i 3 timer for at fremkalde mitofagi.
    2. Udfør enkeltcelledissociation.
      1. Udfør trin i dissociation af en enkelt celle som beskrevet i trin 1.1.2.
    3. Pletceller med Fluozin-3-AM og DAPI.
      1. Resuspender øprøver i 500 μL øflowmedium.
      2. Tilsæt 0,25 μL 1 mM Fluozin-3-AM-lager til rør, der modtager Fluozin-3-AM-farvestof (betingelser 3, 5 og 6).
      3. Cellerne inkuberes ved 37 °C, og DAPI-behandlingen fortsættes som beskrevet i trin 1.1.3.5-1.3.10.
  2. Flow cytometri
    1. Start instrumentet. Ethvert flowcytometer med de relevante filtre fungerer.
      BEMÆRK: Følgende filtre blev anvendt i denne undersøgelse: (1) VL1 for DAPI: Excitation/Emission - 405 nm/440 nm (50 nm); (2) BL1 for fluozin-3-AM: excitation/emission - 488 nm/530 nm (30 nm) (3) VL3 for mt-Keima-neutral: excitation/emission - 405 nm/603 nm (48 nm); (4) YL2 for mt-Keima-syre: excitation/emission - 561 nm/620 nm (15 nm).
    2. Juster FSC- og SSC-spændinger, og udelad ikke-enkeltceller som beskrevet i trin 1.2.2-1.2.3 (figur 3A-C).
    3. Juster spændinger og kompensation for DAPI, Fluozin-3-AM og mt-Keima ved hjælp af ufarvede og enkeltpositive kontroller (betingelser 1-4) for at sikre, at fluorescenspositive cellepopulationer kan skelnes fra ufarvede celler. Når der er anvendt passende kompensation på hver kanal, skal du oprette DAPI-negative porte og Fluozin-3-AM-positive porte til at filtrere efter live β-celler (figur 3D-E).
    4. Opret et trekantet gating-skema ved hjælp af mt-Keima-positiv prøve (betingelse 4) for at identificere sure og neutrale cellepopulationer (figur 3F).
      BEMÆRK: Spændinger, der typisk bruges til hver kanal: (1) VL1: 320-340 V; (2) BL2: 260-280 V; (3) VL3: 280-300 V; (4) YL2: 280-300 V.
    5. Når gates er etableret, skal du indsamle 10.000 hændelser pr. prøve. Gating ordninger for betingelser 5 og 6 er illustreret i figur 3A-G.
    6. Gem data som FCS-filer til analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vurdering af mitofagi: via den farvestofbaserede MtPhagy-tilgang
Denne farvestofbaserede tilgang blev optimeret til at analysere mitofagiflux inden for primære muse-β-celler uden behov for en genetisk reporter ved hjælp af Fluozin-3-AM, TMRE og MtPhagy samt DAPI for at udelukke døde celler. Ved at parre disse farvestoffer med valinomycin for at inducere mitofagi, skitserer denne protokol en farvestofbaseret metode til selektivt at måle mitofagiflux i primære muse-β-celler18. For de data, der blev vist ved hjælp af denne MtPhagi-metode, blev både basal og valinomycin-induceret mitofagi, analyseret i holme isoleret fra enten almindelig fedtdiæt (RFD) eller fedtfattig diæt (HFD, 60 kcal% fedt) fodrede mus for at vurdere effekten af metabolisk stress på mitofagiflux. For at identificere populationen af interesse blev celler lukket ved hjælp af ubehandlede RFD-øer. FSC- og SSC-spændinger blev først justeret for at opnå en jævn fordeling af celler på et SSC-A vs. FSC-A-plot (figur 1A). For at vælge for enkelte celler, både FSC-H vs. FSC-W og SSC-H vs. SSC-W-plots blev brugt, hvor multiplaletter blev udelukket på grund af deres signalværdier med højere bredde sammenlignet med enkeltceller (figur 1B, C). Dernæst blev DAPI-negative celler valgt til at udelukke døde celler20 (figur 1D). Efter etablering af primære porte blev enkeltfarvede kontroller brugt til at etablere fluorescensporte til Fluozin-3-AM, MtPhagy og TMRE (figur 1E-G) samt kompensationskontroller for flerfarvet fluorescensflowcytometri.

Når disse primære og fluorescensporte blev etableret, blev β-celler med høj udnyttelse af mitofagi, defineret som FluozinhøjMtPhagyhøjTMRElav befolkning i kvadrant 3 (Q3) ved anvendelse af RFD uden valinomycineksponering (figur 1H). Ved hjælp af denne gating-strategi blev basale og valinomycin-inducerede mitofaginiveauer karakteriseret i både RFD- og HFD-øer (figur 2). For at kvantificere mitofagiflux, basal vs. Valinomycin-inducerede mitofaginiveauer blev sammenlignet ved hjælp af følgende forhold:

Equation 1

Ved hjælp af dette forhold blev mitofagiflux kvantificeret og sammenlignet i RFD vs. HFD β-celler til at vurdere forskelle i mitofagi, efter induktion af fedme og perifer insulinresistens. Kvantificering af mitofagiflux i RFD vs. HFD-prøver er vist i figur 2E. Dette resultat fremhæver gennemførligheden af dette assay til kvantificering af mitofagien i β-celler ved hjælp af en ligetil farvestofbaseret tilgang. Denne metode kan også anvendes i humane øer, vanskeligt transfekterede celler og holme isoleret fra komplekse genetiske modeller, hvor krydsning til mt-Keima transgene model ville være besværlig.

Vurdering af mitofagi: ved hjælp af den genetisk kodede mt-Keima-reporter
Mt-Keima er et dobbelt excitationsfluorescerende protein fusioneret med en Cox8-lokaliseringssekvens, der gør det muligt at målrette det mod den indre mitokondriemembran. Den bimodale fluorescerende egenskab af mt-Keima gør det muligt at skifte sine excitationsspektre fra den neutrale (405 nm) til sure (561 nm) bølgelængde afhængigt af pH i det intracellulære rum6. Dette muliggør en robust ratiometrisk fluorescensanalyse af mitofagi, hvor en stigning i sur-til-neutral-forhold indikerer mitofaginduktion. I denne protokol blev Fluozin-3-AM også brugt til at selektere for β-celler via flowcytometri. I disse repræsentative undersøgelser blev mitofagiflux vurderet ved hjælp af holme isoleret fra mus fodret med en RFD-diæt10,11. FSC- og SSC-spændinger blev først justeret for at opnå en jævn fordeling af celler på en SSC-A vs. FSC-A-plot (figur 3A). For at vælge for enkelte celler, både FSC-H vs. FSC-W og SSC-H vs. SSC-W-plots blev brugt, hvor multiplaletter blev udelukket på grund af deres signalværdier med højere bredde sammenlignet med enkeltceller (figur 3B, C). Spændings- og gatingstrategien for DAPI og Fluozin-3-AM blev bestemt ved hjælp af enkeltfarvede øer (figur 3D, E). Trekantporte for de sure og neutrale populationer blev derefter identificeret ved hjælp af mt-Keima-positiv prøve uden valinomycineksponering (figur 3F).

Når disse primære og fluorescensporte var etableret, blev mitofagiflux vurderet ved hjælp af basale og valinomycin-inducerede ændringer i mt-Keima-fluorescens (figur 3F, G). For at kvantificere mitofagiflux, basal mitofagi, vs. Valinomycin-inducerede niveauer blev sammenlignet ved hjælp af følgende forhold:

Equation 2

Ved hjælp af dette forhold blev mitofagiflux kvantificeret i RFD-celler. Kvantificering af dette resultat er vist i figur 3H. Det er vigtigt, at disse resultater er sammenlignelige med resultaterne i RFD-øer genereret ved hjælp af MtFagy-tilgangen (figur 3H).

Figure 1
Figur 1: Gating skema for MtPhagy metoden. (A) Flowplot, der viser gating-skema, der skal vælges for alle celler. (B) Gating at vælge singlets baseret på FSC-H vs. FSC-W og (C) SSC-H vs. SSC-W. (D) Gating for DAPI-negative celler for at udelukke døde celler. (E) Gating for Fluozin-3-AMhøje celler at vælge for β-celler. (F) Gating ordning for MtPhagy farvestof til at identificere MtPhagyhøje og MtPhagylavcellepopulationer . (Gating scheme) for TMRE til identifikation af TMREhøje og TMRElavcellepopulationer . (H) Kvadrant gating-skema etableret med ubehandlede RFD-øer for at identificere FluozinhighMtPhagyhighTMRElow cells i quadrant 3 (Q3) som β-celler, der gennemgår mitofagi. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Vurdering af mitofagiske fluxforskelle i muse- β-celler efter metabolisk stress ved hjælp af MtPhagy gating-skemaet. Repræsentative flowcytometriplots af (A) ubehandlede RFD-β-celler, (B) ubehandlede HFD-β-celler, (C) valinomycineksponerede RFD-β-celler og (D) valinomycineksponerede HFD-β-celler. E) Kvantificering af mitofagiflux i β-celler, beregnet ved hjælp af et forhold mellem MtPhagyhøjeTMRElave celler eksponeret for valinomycin og MtPhagyhøjeTMRElave celler, der ikke er eksponeret for valinomycin, for både RFD- og HFD-prøver. *p < 0,05 ved elevens uparrede t-test. n = 3/gruppe. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Gating scheme for mt-Keima-metoden og sammenligning mellem begge metoder. (A) Flowplot, der viser gating-skema, der skal vælges for alle celler. (B) Gating at vælge singlets baseret på FSC-H vs. FSC-W og (C) SSC-H vs. SSC-W. (D) Gating for DAPI-negative celler for at udelukke døde celler. (E) Gating for Fluozin-3-AMhøje celler at vælge for β-celler. (F) Repræsentative flowcytometriplots af mt-Keima/+ ubehandlede celler og (G) mt-Keima/+ valinomycineksponerede celler. (H) Kvantificering af mitofagiflux i β-celler fra RFD-fodrede mus, beregnet ved hjælp af et forhold mellem de sure/neutrale celler, der eksponeres for valinomycin, og forholdet mellem de sure/neutrale celler, der ikke er eksponeret for valinomycin ved anvendelse af mt-Keima-metoden, og sammenlignet med MtPhagi-metoden (data for MtPhagi-protokollen, der oprindeligt er vist i figur 2E). n = 3/gruppe. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokol beskrev to komplementære metoder til kvantificering af mitofagiflux i dissocierede primære museøer. Ved hjælp af mt-Keima-metoden blev en stigning i mitofagien kvantificeret som et øget forhold mellem sure (561 nm) / neutrale (405 nm) celler, mens i MtFagy-metoden blev øget mitofagiflux kvantificeret som en stigning i FluozinhøjMtPhagyhøjTMRElavcellepopulation . Disse metoder giver mulighed for hurtige, kvantitative og β-cellespecifikke vurderinger af mitofagiflux.

Begge metoder er ligetil tilgange. Visse trin inden for denne protokol er dog afgørende for at opnå kvalitet og reproducerbare resultater. Disse trin inkluderer: (1) korrekt ø-dissociation for at opnå en enkelt cellesuspension, men mild nok til at sikre ø-levedygtighed, (2) omhyggelig etablering af gating for korrekt at identificere populationer af interesse og (3) objektiv kvantificering af flowcytometridata via softwareværktøjer for at sikre en upartisk vurdering af mitofagiflux.

Når man vælger, hvilken metode der skal anvendes, bør celletypen og arten af de anvendte genetiske modeller tages i betragtning. mt-Keima-metoden, enten anvendt in vivo eller transfekteret in vitro, er en meget citeret og velanset metode til mitofagivurdering ved flowcytometri eller levende cellebilleddannelse21. Mens den farvestofbaserede MtPhagy-metode er en nyere tilgang sammenlignet med genetiske reportere, er der tilfælde, hvor dens anvendelse kan foretrækkes frem for mt-Keima. Faktisk overvinder MtFagy-metoden behovet for transfektion eller komplekse avlsordninger, og MtPhagy-farvning tager kun 30 minutter og udføres umiddelbart før flowcytometri. Mtfagy-tilgangen kan også med succes anvendes i vanskelige at transfektere primære humane øprøver. Denne protokol, der er afhængig af enten pH-følsomme mitokondriefarvestoffer eller sonder til direkte måling af mitofagi, adskiller sig fra en tidligere tilgang fra Mauro-Lizcano et. al, der anvendte membranpotentialefølsom MitoTracker Deep Red dye og krævede anvendelse af mitofagi og lysosomale hæmmere til at kvantificere mitofagiflux ved flowcytometri22. Som Mauro-Lizcano et. al metode er ikke blevet testet på holme, det er vanskeligt at sammenligne det direkte med effektiviteten af MtPhagy eller mt-Keima metoderne beskrevet her. Samlet set giver kombinationen af disse metoder i alt et stigende antal muligheder for nøje at vurdere mitofagiflux i meget kvantitative levende enkeltcelleassays.

En ulempe ved begge metoder er deres uforenelighed med cellefiksering. Selvom begge metoder er kompatible med levende cellebilleddannelsesmetoder, interfererer cellefiksering med pH-gradienten af både MtPhagy og mt-Keima over lysosommembranen 7,16. Som et alternativ har brug af mitoQC mitofagi-reporter i faste prøver tidligere været anvendt7. Derudover er en begrænsning for begge metoder behovet for at adskille øer før flowcytometri, hvilket kan påvirke cellelevedygtigheden. Derfor er det afgørende at plette celler med DAPI for at overvåge cellelevedygtighed efter ø-dissociation og sikre, at alle prøver behandles konsekvent. Efter DAPI-farvning havde prøverne i gennemsnit 12,7% ± 7,4 døde celler (figur 1D), hvilket indikerer, at >80% af cellerne i hver prøve kunne bruges til analyse. Overvågning af cellelevedygtighed på hvert trin (efter øisolering, kultur og derefter dissociation) kan desuden være nyttig for at opnå viden om celleoverlevelse på hvert trin i proceduren. Variabilitet i timing mellem øisolering og enkeltcelledissociation kan også påvirke cellelevedygtighed og resultater. Det anbefales derfor at forblive i overensstemmelse med timingen på tværs af alle eksperimenter.

Da mitokondriel kvalitetskontrol er afgørende for β-celle sundhed og funktion, kan strenge vurderinger af mitofagi, ved hjælp af traditionelle biokemiske eller billeddannelsesmetoder (herunder omsætning af mitokondrie ydre membranproteiner, mitokondriel lokalisering til autofagosomer eller lysosomer og elektronmikroskopi) vise sig udfordrende og tidskrævende. Derfor er udviklingen af effektive og robuste mitofagi-reportersystemer afgørende. Både mt-Keima og MtPhagy tilgangen er effektive og giver mulighed for kvantitative vurderinger af mitofagiflux. Disse to teknikker giver mulighed for både fleksibilitet og præcision i adressering af β-celle mitokondriel kvalitetskontrol og sondering af interorganelle interaktioner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

SAS har modtaget bevillingsstøtte fra Ono Pharmaceutical Co., Ltd. og er konsulent for Novo Nordisk.

Acknowledgments

E.L-D. anerkender støtte fra NIH (T32-AI007413 og T32-AG000114). SAS anerkender støtte fra JDRF (COE-2019-861), NIH (R01 DK135268, R01 DK108921, R01 DK135032, R01 DK136547, U01 DK127747), Department of Veterans Affairs (I01 BX004444), Brehm-familien og Anthony-familien.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibiotic-Antimycotic Life Technologies 15240-062
Attune NxT Flow Cytometer Thermofisher Scientific A24858
Dimethyl Sulfoxide Sigma-Aldrich 317275
Fatty Acid Free heat shock BSA powder Equitech BAH66
Fetal bovine serum Gemini Bio 900-108
Fluozin-3AM  Thermofisher Scientific  F24195 100 μg Fluozin-3AM powder reconstituted in 51 μL DMSO and 51 μL Pluronic F-127 to reach 1 mM stock. 
Gibco RPMI 1640 Medium Fisher Scientific 11-875-093
HEPES (1M) Life Technologies 15630-080
MtPhagy dye Dojindo MT02-10 5 μg MtPhagy powder reconstituted with 50 μL DMSO to reach 100 μM stock. 
MtPhagy dye Dojindo MT02-10
Penicillin-Streptomycin (100x) Life Technologies 15140-122 1x Solution used in procotol by diluting 1:10 in ddH2O
Phosphate buffered saline, 10x Fisher Scientific BP399-20 1x Solution used in procotol by diluting 1:10 in ddH2O
Sodium Pyruvate (100x) Life Technologies 11360-070 5 μg MtPhagy powder reconstituted with 50 μL DMSO to reach 100 μM stock. 
TMRE [Tetramethylrhodamine, ethyl ester, perchlorate] Anaspec AS-88061 TMRE powder reconstituted in DMSO to reach 100 μM stock.
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Thermofisher Scientific 25300054
Valinomycin Sigma V0627 Valinomycin powder reconsituted in DMSO to reach 250 nM stock.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kaufman, B. A., Li, C., Soleimanpour, S. A. Mitochondrial regulation of β-cell function: maintaining the momentum for insulin release. Molecular Aspects of Medicine. 42, 91-104 (2015).
  2. Soleimanpour, S. A., et al. The diabetes susceptibility gene Clec16a regulates mitophagy. Cell. 157 (7), 1577-1590 (2014).
  3. Pearson, G., et al. Clec16a, Nrdp1, and USP8 form a ubiquitin-dependent tripartite complex that regulates β-cell mitophagy. Diabetes. 67 (2), 265-277 (2018).
  4. Hattori, N., Saiki, S., Imai, Y. Regulation by mitophagy. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 53, 147-150 (2014).
  5. Berezhnov, A. V., et al. Intracellular pH modulates autophagy and mitophagy. Journal of Biological Chemistry. 291 (16), 8701-8708 (2016).
  6. Sun, N., et al. Measuring in vivo mitophagy. Molecular Cell. 60 (4), 685-696 (2015).
  7. McWilliams, T. G., et al. mito-QC illuminates mitophagy and mitochondrial architecture in vivo. Journal of Cell Biology. 214 (3), 333-345 (2016).
  8. Aoyagi, K., et al. A new beta cell-specific mitophagy reporter mouse shows that metabolic stress leads to accumulation of dysfunctional mitochondria despite increased mitophagy. Diabetologia. 66 (1), 147-162 (2023).
  9. Ma, X., Ding, W. X. A fluorescence imaging based-assay to monitor mitophagy in cultured hepatocytes and mouse liver. Liver Research. 5 (1), 16-20 (2021).
  10. Sidarala, V., et al. Mitophagy protects β cells from inflammatory damage in diabetes. JCI Insight. 5 (24), 141138 (2020).
  11. Gingerich, M. A., et al. An intrinsically disordered protein region encoded by the human disease gene CLEC16A regulates mitophagy. Autophagy. 19 (2), 525-543 (2023).
  12. Sun, N., Malide, D., Liu, J., Rovira, I. I., Combs, C. A., Finkel, T. A fluorescence-based imaging method to measure in vitro and in vivo mitophagy using mt-Keima. Nature Protocols. 12 (8), 1576-1587 (2017).
  13. Zhao, J., Bertoglio, B. A., Gee, K. R., Kay, A. R. The zinc indicator FluoZin-3 is not perturbed significantly by physiological levels of calcium or magnesium. Cell Calcium. 44 (4), 422-426 (2008).
  14. Da Silva Xavier, G. The Cells of the Islets of Langerhans. Journal of Clinical Medicine. 7 (3), 54 (2018).
  15. Thapa, B., et al. Imaging β-cell function using a zinc-responsive MRI contrast agent may identify first responder islets. Frontiers in Endocrinology. 12, 809867 (2022).
  16. Iwashita, H., et al. Live cell imaging of mitochondrial autophagy with a novel fluorescent small molecule. ACS Chemical Biology. 12 (10), 2546-2551 (2017).
  17. Crowley, L. C., Christensen, M. E., Waterhouse, N. J. Measuring mitochondrial transmembrane potential by TMRE staining. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (12), 087361 (2016).
  18. Klein, B., Wörndl, K., Lütz-Meindl, U., Kerschbaum, H. H. Perturbation of intracellular K(+) homeostasis with valinomycin promotes cell death by mitochondrial swelling and autophagic processes. Apoptosis. 16 (11), 1101-1117 (2011).
  19. Ji, Y., et al. Toll-like receptors TLR2 and TLR4 block the replication of pancreatic β cells in diet-induced obesity. Nature Immunology. 20 (6), 677-686 (2019).
  20. Sauvat, A., et al. Quantification of cellular viability by automated microscopy and flow cytometry. Oncotarget. 6 (11), 9467-9475 (2015).
  21. Liu, Y. T., et al. Mt-Keima detects PINK1-PRKN mitophagy in vivo with greater sensitivity than mito-QC. Autophagy. 17 (11), 3753-3762 (2021).
  22. Mauro-Lizcano, M., et al. New method to assess mitophagy flux by flow cytometry. Autophagy. 11 (5), 833-843 (2015).

Tags

Mitofagflux bugspytkirtlen î²-celler komplementære tilgange genetiske reportere Mt-Keima musemodel kvantificering af mitofagi flowcytometri PH-følsom dual-excitation ratiometrisk sonde sur til neutral mt-keima-bølgelængdeemissioner genetiske mitofagi-reportere komplekse genetiske musemodeller vanskelige at transfektere celler primære humane øer farvestofbaseret metode MtPhagy cellegennemtrængeligt farvestof lysosomer under mitofagi fluozin-3-AM Zn2+ indikator tetramethylrhodamin ethylester (TMRE) Mitokondrie membran potentiale
Komplementære tilgange til at forhøre mitofagiflux i β-celler i bugspytkirtlen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Levi-D’Ancona, E., Sidarala,… More

Levi-D’Ancona, E., Sidarala, V., Soleimanpour, S. A. Complementary Approaches to Interrogate Mitophagy Flux in Pancreatic β-Cells. J. Vis. Exp. (199), e65789, doi:10.3791/65789 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter