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Biology

Komplementäre Ansätze zur Untersuchung des Mitophagieflusses in β-Zellen der Bauchspeicheldrüse

Published: September 15, 2023 doi: 10.3791/65789
Automatic Translation
1,2, 1, 1,3,4
1Department of Internal Medicine, Division of Metabolism, Endocrinology and Diabetes, University of Michigan, Ann Arbor, 2Graduate Program in Immunology, University of Michigan Medical School, 3Department of Molecular and Integrative Physiology, University of Michigan, Ann Arbor, 4VA Ann Arbor Healthcare System

Summary

Dieses Protokoll beschreibt zwei Methoden zur quantitativen Analyse der Mitophagie in β-Zellen der Bauchspeicheldrüse: erstens eine Kombination zellpermeabler Mitochondrien-spezifischer Farbstoffe und zweitens einen genetisch kodierten Mitophagie-Reporter. Diese beiden Techniken ergänzen sich und können je nach Bedarf eingesetzt werden, was Flexibilität und Präzision bei der quantitativen Qualitätskontrolle der Mitochondrien ermöglicht.

Abstract

Die Mitophagie ist ein Qualitätskontrollmechanismus, der für die Aufrechterhaltung einer optimalen Mitochondrienfunktion erforderlich ist. Eine dysfunktionale β-Zell-Mitophagie führt zu einer unzureichenden Insulinausschüttung. Fortgeschrittene quantitative Bewertungen der Mitophagie erfordern oft den Einsatz genetischer Reporter. Das mt-Keima-Mausmodell, das eine auf die Mitochondrien abzielende pH-sensitive ratiometrische Sonde mit doppelter Erregung zur Quantifizierung der Mitophagie mittels Durchflusszytometrie exprimiert, wurde in β-Zellen optimiert. Das Verhältnis von sauren zu neutralen mt-Keima-Wellenlängen kann zur robusten Quantifizierung der Mitophagie verwendet werden. Die Verwendung genetischer Mitophagie-Reporter kann jedoch eine Herausforderung darstellen, wenn mit komplexen genetischen Mausmodellen oder schwer zu transfizierenden Zellen, wie z. B. primären menschlichen Inseln, gearbeitet wird. Dieses Protokoll beschreibt eine neuartige komplementäre farbstoffbasierte Methode zur Quantifizierung der β-Zell-Mitophagie in primären Inselzellen mittels MtPhagy. MtPhagy ist ein pH-empfindlicher, zelldurchlässiger Farbstoff, der sich in den Mitochondrien anreichert und ihre Fluoreszenzintensität erhöht, wenn sich Mitochondrien in Umgebungen mit niedrigem pH-Wert befinden, wie z. B. Lysosomen während der Mitophagie. Durch die Kombination des MtPhagy-Farbstoffs mit Fluozin-3-AM, einemZn2+ -Indikator, der für β-Zellen selektiert, und Tetramethylrhodamin, Ethylester (TMRE) zur Beurteilung des mitochondrialen Membranpotenzials kann der Mitophagiefluss in β-Zellen mittels Durchflusszytometrie spezifisch quantifiziert werden. Diese beiden Ansätze ergänzen sich in hohem Maße und ermöglichen Flexibilität und Präzision bei der Beurteilung der mitochondrialen Qualitätskontrolle in zahlreichen β-Zell-Modellen.

Introduction

β-Zellen der Bauchspeicheldrüse produzieren und sezernieren Insulin, um den Stoffwechselbedarf zu decken, und β-Zell-Dysfunktion ist für Hyperglykämie und das Auftreten von Diabetes sowohl bei Typ-1- als auch bei Typ-2-Diabetes verantwortlich. β-Zellen koppeln den Glukosestoffwechsel mit der Insulinsekretion über die mitochondriale Energetik und die Stoffwechselleistung, die von einer Reserve an funktioneller mitochondrialer Masse abhängen 1,2,3. Um eine optimale β-Zell-Funktion aufrechtzuerhalten, verlassen sich β-Zellen auf mitochondriale Qualitätskontrollmechanismen, um gealterte oder beschädigte Mitochondrien zu entfernen und die funktionelle mitochondriale Masse zu erhalten4. Die selektive mitochondriale Autophagie, auch bekannt als Mitophagie, ist eine Schlüsselkomponente des mitochondrialen Qualitätskontrollwegs.

Die Beurteilung der Mitophagie in lebenden Zellen beruht oft auf Veränderungen des mitochondrialen pH-Werts, die während der Mitophagie auftreten. Mitochondrien haben einen leicht alkalischen pH-Wert, und gesunde Mitochondrien befinden sich normalerweise im pH-neutralen Zytosol. Während der Mitophagie werden beschädigte oder dysfunktionale Mitochondrien selektiv in Autophagosomen eingebaut und schließlich in sauren Lysosomen abgebaut5. Mehrere in vivo transgene Mitophagie-Reportermausmodelle, wie mt-Keima6, mitoQC7 und CMMR8, sowie transfektierbare Mitophagiesonden, wie das Cox8-EGFP-mCherry-Plasmid9, nutzen diese pH-Änderung, um quantitative Bewertungen der Mitophagie zu ermöglichen. Die Verwendung transgener Mäuse, die die pH-sensitive ratiometrische Sonde mt-Keima exprimieren, wurde für die Beurteilung der Mitophagie in Inselzellen und β-Zellen mittels Durchflusszytometrie optimiert10,11. Das Verhältnis von sauren zu neutralen mt-Keima-Wellenlängen (das Verhältnis von saurer 561 nm zu neutraler 480 nm Anregung) kann verwendet werden, um die Mitophagie robust zu quantifizieren 6,12.

Dieses Protokoll beschreibt einen optimierten Ansatz zur Bestimmung des Mitophagieflusses in primären Inselzellen und β-Zellen, die aus mt-Keima-transgenen Mäusen isoliert wurden10,11. Obwohl mt-Keima eine hochempfindliche Sonde ist, erfordert sie entweder komplizierte Tierzuchtschemata oder die Transfektion von Zellen, was in Kombination mit anderen genetischen Modellen oder mit primären menschlichen Inseln oft eine Herausforderung darstellen kann. Darüber hinaus kann die Verwendung mehrerer Fluoreszenzlaser und -detektoren zur Identifizierung neutraler und saurer Zellpopulationen die kombinatorische Verwendung anderer fluoreszierender Reporter einschränken.

Um diese Herausforderungen zu meistern, beschreibt dieses Protokoll auch eine komplementäre, farbstoffbasierte Methode mit einem einzigen fluoreszierenden Kanal für den robusten Nachweis von Mitophagie in β-Zellen von isolierten Mäuseinseln. Dieser Ansatz, der als MtPhagy-Methode bezeichnet wird, verwendet eine Kombination aus drei zellpermeablen Farbstoffen, um nach β-Zellen zu selektieren, die Zellpopulationen zu quantifizieren, die aktiv der Mitophagie unterzogen werden, und gleichzeitig das mitochondriale Membranpotenzial (MMP oder Δψm) zu bewerten.

Der erste dieser Farbstoffe ist Fluozin-3-AM, ein zelldurchlässigerZn2+-Indikator mit einem Ex/Em 494/516 nm13. Mäuseinseln bestehen aus einer heterogenen Population funktionell unterschiedlicher Zellen, darunter α-, β-, δ- und PP-Zellen. β-Zellen umfassen etwa 80% der Zellen innerhalb der Mausinsel und können von anderen Inselzelltypen durch ihre hoheZn2+-Konzentration in Insulingranula14,15 unterschieden werden, was die Identifizierung von β-Zellen als Fluozin-3-AM-Population mit hohem Fluozin-3-AM-Gehalt ermöglicht. Der MtPhagy-Farbstoff, ein pH-empfindlicher Farbstoff, der über eine chemische Bindung auf Mitochondrien immobilisiert wird und schwache Fluoreszenz emittiert, wird ebenfalls in diesem Protokoll verwendet16. Bei der Induktion der Mitophagie werden beschädigte Mitochondrien in das saure Lysosom eingebaut, und der MtPhagy-Farbstoff erhöht seine Fluoreszenzintensität in der Umgebung mit niedrigem pH-Wert (Ex/Em 561/570-700 nm).

Darüber hinaus wird Tetramethylrhodamin, Ethylester (TMRE), zur Beurteilung von MMP verwendet. TMRE ist ein zellpermeabler, positiv geladener Farbstoff (Ex/Em 552/575 nm), der von gesunden Mitochondrien aufgrund der relativen negativen Ladung, die durch ihr Membranpotential aufrechterhalten wird, sequestriert wird17. Beschädigte oder ungesunde Mitochondrien lösen ihr Membranpotenzial auf, was zu einer verminderten Fähigkeit zur Sequestrierung von TMRE führt. Durch die gemeinsame Verwendung dieser Farbstoffe können β-Zellen, die einer Mitophagie unterzogen werden, mittels Durchflusszytometrie als Fluozin-Populationmit hohemMtPhagy-hohemTMRE-Gehalt identifiziert werden. Da es sich bei der Mitophagie um einen dynamischen und nicht um einen statischen Prozess handelt, wurde dieses Protokoll optimiert, um den Mitophagiefluss mit Valinomycin zu bestimmen, einem K+-Ionophor, der die Mitophagie nach Dissipation von MMP18 induziert. Der Vergleich der Mitophagie in Gegenwart und Abwesenheit von Valinomycin ermöglicht die Beurteilung des Mitophagieflusses in verschiedenen Probengruppen.

Die farbstoffbasierte Natur des derzeitigen Ansatzes ermöglicht die Extrapolation auf menschliche Inseln und andere schwer zu transfizierende Zelltypen und umgeht im Gegensatz zum mt-Keima-Protokoll die Notwendigkeit komplizierter Tierzuchtschemata. Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist die Quantifizierung der Mitophagie in β-Zellen auf Einzelzellebene durch zwei unabhängige, auf Durchflusszytometrie basierende Methoden. Zusammengenommen beschreibt dieses Protokoll zwei leistungsstarke und komplementäre Methoden, die sowohl Präzision als auch Flexibilität bei der quantitativen Untersuchung der mitochondrialen Qualitätskontrolle ermöglichen.

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Protocol

Die in diesem Protokoll vorgestellten Tierstudien wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Michigan geprüft und genehmigt. Für diese Studie wurden zwanzig Wochen alte männliche C57BL/6J-Mäuse verwendet, die entweder eine 15-wöchige normale Fettdiät (RFD) oder eine fettreiche Diät (HFD) erhielten.

1. Beurteilung der Mitophagie mit dem farbstoffbasierten MtPhagy-Ansatz (Methode 1)

  1. Aufbereitung und Behandlung von Mäuseinseln
    1. Führen Sie die Inselkultur und die Valinomycin-Exposition durch, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
      1. Isolierung von Inselzellen aus Mäusen mit normaler Fettdiät (RFD) oder fettreicher Diät (HFD, 60 kcal% Fett19) nach den zuvor beschriebenen Methoden 2,10.
      2. Kulturinselproben über Nacht bei 37 °C in RPMI-Medium, ergänzt mit 100 Einheiten/ml Antimykotikum-Antibiotikum, 50 Einheiten/ml Penicillin-Streptomycin, 1 mM Natriumpyruvat, 10 mM HEPES und 10 % fötalem Kälberserum (FBS) (siehe Materialtabelle). Dieses Medium wird als "Inselmedium" bezeichnet.
      3. Mit einer Pipette 100 Inselchen pro Zustand in 6 cm Petrischalen in 2 ml Inselmedium entnehmen.
        ANMERKUNG: Für dieses Protokoll verwendete Bedingungen: (1) Ungefärbte Kontrolle: ungefärbte RFD-Inseln; (2) Nur DAPI-Kontrolle: RFD-Inseln, die mit DAPI gefärbt sind; (3) Nur Fluozin-3-AM-Kontrolle: RFD-Inseln, die mit Fluozin-3-AM gefärbt wurden; (4) Nur MtPhagy-Kontrolle: RFD-Inseln, die mit MtPhagy gefärbt sind; (5) Nur TMRE-Kontrolle: RFD-Inseln, die mit TMRE gefärbt wurden; (6) RFD unbehandelt: RFD-Inseln, gefärbt mit MtPhagie, TMRE, Fluozin-3-AM und DAPI; (7) Valinomycin-exponierte RFD-Inseln: RFD-Inseln, die Valinomycin ausgesetzt und mit MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM und DAPI gefärbt wurden; (8) HFD unbehandelt: HFD-Inseln, gefärbt mit MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM und DAPI; (9) Valinomycin-exponierte HFD-Inseln: HFD-Inseln, die Valinomycin ausgesetzt und mit MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM und DAPI gefärbt wurden.
      4. Bei Bedingungen (7) und (9) (siehe ANMERKUNG oben), die Valinomycin ausgesetzt sind, werden 2 μl 250 nΜ Valinomycin-Stamm (siehe Materialtabelle) 3 h lang auf Inseln in der Petrischale gegeben, um die Mitophagie zu induzieren.
    2. Führen Sie eine Einzelzelldissoziation durch.
      1. Nach 3-stündiger Valinomycin-Exposition werden 100 Inseln aus jeder Bedingung mit einer Pipette in separate Mikrozentrifugenröhrchen entnehmen.
      2. Inselchen werden bei 350 x g 1 min bei 10 °C geschleudert und der Überstand mit einer Pipette entsorgt.
      3. Waschen Sie die Proben 2x mit 1 ml 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), mit Schleuderschritten (350 x g/1 min, 10 °C) zwischen jedem Waschgang. Entsorgen Sie den Überstand nach jedem Waschgang mit einer Pipette.
      4. Um Inseln in einzelne Zellen zu dissoziieren, geben Sie 500 μl 0,05%iges Trypsin (vorgewärmt auf 37 °C) in das Mikrozentrifugenröhrchen einer Probe, um eine Überverdauung der Inselzellen zu verhindern. Pipettieren Sie wiederholt auf und ab, bis die Inseln sichtbar verteilt sind.
      5. Sofort 1 ml vorgewärmtes Inselmedium hinzufügen, um Trypsin zu neutralisieren. Wiederholen Sie die Trypsinisierung und Neutralisation für jede Probe, eine nach der anderen.
      6. Schleudern Sie die Proben bei 500 x g für 5 min bei 10 °C. Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette und achten Sie darauf, das Pellet nicht zu stören.
        HINWEIS: Das Pellet ist für Proben, die Valinomycin ausgesetzt sind, empfindlich.
      7. Waschen Sie die Proben 2x mit RPMI-Medium, kein Phenolrot, ergänzt mit 100 Einheiten/ml Antimykotikum-Antibiotikum, 50 Einheiten/ml Penicillin-Streptomycin, 1 mM Natriumpyruvat, 10 mM HEPES und 10% Rinderserumalbumin (BSA). Dieses Medium wird als "Inselflussmedium" bezeichnet. Zwischen jedem Waschgang Schleuderschritte (350 x g/1 min, 10 °C) einplanen. Entsorgen Sie den Überstand nach jedem Waschgang mit einer Pipette.
    3. Färben Sie Zellen mit MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM und DAPI, um sich auf die Durchflusszytometrie vorzubereiten.
      1. Resuspendieren Sie Inselzellenproben in 500 μl Inselflussmedium.
      2. 0,25 μl 100 μM MtPhagy-Stamm (siehe Materialtabelle) in Röhrchen geben, die den MtPhagy-Farbstoff erhalten (Bedingungen 4, 6, 7, 8 und 9, HINWEIS zu Schritt 1.1.1).
      3. 0,25 μl 100 μM TMRE-Material (siehe Materialtabelle) in Röhrchen geben, die TMRE-Farbstoff erhalten (Bedingungen 5, 6, 7, 8 und 9).
      4. 0,25 μl 1 mM Fluozin-3-AM-Stamm (siehe Materialtabelle) in Röhrchen geben, die den Fluozin-3-AM-Farbstoff erhalten (Bedingungen 3, 6, 7, 8 und 9).
      5. Vortex-Rohre mit niedriger Geschwindigkeit für 5 s mischen.
      6. Mikrozentrifugenröhrchen zum Schutz vor Licht in Aluminiumfolie wickeln und bei 37 °C 30 min inkubieren. Nach der Hälfte der Inkubation Wirbelrohre mit niedriger Geschwindigkeit für 5-10 s mischen.
      7. Nach der Inkubation zentrifugieren die Proben bei 350 x g für 1 min bei 10 °C. Verwerfen Sie den Überstand mit einer Pipette.
      8. Resuspendieren Sie die Proben in einem 500-μl-Inselflussmedium. 0,2 μg/ml DAPI (siehe Materialtabelle) zu den Bedingungen 2, 6, 7, 8 und 9 hinzufügen.
      9. Schleudern Sie die Proben bei 350 x g für 1 Minute bei 10 °C. Überstand mit einer Pipette verwerfen und in 500 μl Inselflussmedium resuspendieren.
      10. Proben auf Eis legen.
  2. Durchflusszytometrie
    1. Starten Sie das Gerät (siehe Materialtabelle).
      HINWEIS: Jedes Durchflusszytometer mit den entsprechenden Filtern funktioniert. Die folgenden Filter wurden in dieser Studie verwendet: (1) VL1 für DAPI: Anregung/Emission - 405 nm/440 nm (50 nm); (2) BL1 für Fluozin-3-AM: Anregung/Emission - 488 nm/530 nm (30 nm); (3) BL2 für MtPhagy-Farbstoff: Anregung/Emission - 488 nm/590 nm (40 nm); (4) YL1 für TMRE: Anregung/Emission - 561 nm/585 nm (16 nm).
    2. Passen Sie die Spannungen für Durchlass- (FSC) und Seitenstreuung (SSC) an, um sicherzustellen, dass sich die Zellpopulationen in der Mitte des Streudiagramms befinden. Für dieses Protokoll wurden Spannungen von 120 V für FSC und 260 V für SSC verwendet, um sicherzustellen, dass die Zellen gleichmäßig innerhalb des FSC-A-Wertes fallen. SSC-A-Diagramm (Abbildung 1A).
    3. Um Nicht-Einzelzellen auszuschließen, fügen Sie ein rechteckiges Gatter auf FSC-H vs. FSC-W gefolgt von SSC-H vs. SSC-W (Abbildung 1B,C).
    4. Passen Sie die Spannungen und die Kompensation für DAPI an, um nach aktiven β-Zellen zu filtern. Setzen Sie Fluoreszenzgatter für jedes verwendete Fluorophor auf der Grundlage der ungefärbten RFD-Probe (Abbildungen 1D-F).
      HINWEIS: Verwendete Spannungen für jeden Kanal: (1) VL1: 320-360 V; (2) BL1: 300-340 V; (3) BL2: 260-300 V; (4) YL1: 300-340 V.
    5. Sobald Gatter eingerichtet sind, erfassen Sie 10.000 Ereignisse pro Probe.
      ANMERKUNG: Unter Verwendung dieses Gating-Ansatzes wurden die Mitophagie-Spiegel unter basalen Bedingungen und nach Valinomycin-Induktion sowohl in RFD- als auch in HFD-Inselzellen beurteilt (Abbildung 2).
    6. Speichern Sie die Daten zur Analyse als FCS-Dateien.

2. Beurteilung der Mitophagie mit dem genetisch kodierten mt-Keima-Reporter (Methode 2)

  1. Präparation von Mäuseinseln und Einzelzelldissoziation
    1. Führen Sie die Inselkultur und die Valinomycin-Exposition durch, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
      1. Isolierung von Pankreasinseln aus Wildtyp- (WT) und mt-Keima/+ (mt-Keima) Mäusen6. Bei dieser Methode wurden 20 Wochen alte männliche WT- oder mt-Keima/+-gefütterte RFD-Mäuse verwendet.
      2. Kulturinselproben über Nacht bei 37 °C in Inselmedium.
      3. Entnehmen Sie mit einer Pipette 100 Inselchen pro Zustand in 6 cm Petrischalen mit 2 ml Inselmedium.
        ANMERKUNG: Für dieses Protokoll verwendete Bedingungen: (1) Ungefärbte Kontrolle: Ungefärbte WT-Inseln; (2) Nur DAPI-Kontrolle: WT-Inseln, die mit DAPI gefärbt sind; (3) Nur Fluozin-3-AM-Kontrolle: WT-Inseln, die mit Fluozin-3-AM gefärbt wurden; (4) Nur mt-Keima-Kontrolle: Ungefärbte mt-Keima/+-Inseln; (5) Unbehandelt: mt-Keima/+-Inseln, gefärbt mit Fluozin-3-AM und DAPI; (6) Valinomycin: mt-Keima/+-Inseln, die Valinomycin ausgesetzt und mit Fluozin-3-AM und DAPI gefärbt wurden.
      4. Bei Bedingung (6) mit Valinomycin-Exposition 2 μl 250 nM Valinomycin-Brühe für 3 h auf Inseln in der Petrischale geben, um eine Mitophagie zu induzieren.
    2. Führen Sie eine Einzelzelldissoziation durch.
      1. Führen Sie die Dissoziationsschritte für einzelne Zellen durch, wie in Schritt 1.1.2 beschrieben.
    3. Färben Sie Zellen mit Fluozin-3-AM und DAPI.
      1. Resuspendieren Sie Inselzellenproben in 500 μl Inselflussmedium.
      2. 0,25 μl 1 mM Fluozin-3-AM-Stammstoff in Röhrchen geben, die den Fluozin-3-AM-Farbstoff erhalten (Bedingungen 3, 5 und 6).
      3. Die Zellen werden bei 37 °C inkubiert und mit der DAPI-Behandlung fortgefahren, wie in den Schritten 1.1.3.5-1.3.10 beschrieben.
  2. Durchflusszytometrie
    1. Starten Sie das Instrument. Jedes Durchflusszytometer mit den entsprechenden Filtern funktioniert.
      ANMERKUNG: In dieser Studie wurden die folgenden Filter verwendet: (1) VL1 für DAPI: Anregung/Emission - 405 nm/440 nm (50 nm); (2) BL1 für Fluozin-3-AM: Anregung/Emission - 488 nm/530 nm (30 nm); (3) VL3 für mt-Keima neutral: Anregung/Emission - 405 nm/603 nm (48 nm); (4) YL2 für mt-Keima-Säure: Anregung/Emission - 561 nm/620 nm (15 nm).
    2. Stellen Sie die FSC- und SSC-Spannungen ein und schließen Sie einzelne Zellen aus, wie in den Schritten 1.2.2 bis 1.2.3 beschrieben (Abbildungen 3A-C).
    3. Passen Sie die Spannungen und die Kompensation für DAPI, Fluozin-3-AM und mt-Keima unter Verwendung von ungefärbten und einfach-positiven Kontrollen (Bedingungen 1-4) an, um sicherzustellen, dass fluoreszenzpositive Zellpopulationen von ungefärbten Zellen unterschieden werden können. Sobald die entsprechende Kompensation auf jeden Kanal angewendet wurde, richten Sie das negative DAPI-Gatter und das positive Fluozin-3-AM-Gatter ein, um nach lebenden β-Zellen zu filtern (Abbildungen 3D-E).
    4. Richten Sie ein Dreiecks-Gating-Schema mit der mt-Keima-positiven Probe (Bedingung 4) ein, um saure und neutrale Zellpopulationen zu identifizieren (Abbildung 3F).
      HINWEIS: Normalerweise verwendete Spannungen für jeden Kanal: (1) VL1: 320-340 V; (2) BL2: 260-280 V; (3) VL3: 280-300 V; (4) YL2: 280-300 V.
    5. Sobald Gatter eingerichtet sind, erfassen Sie 10.000 Ereignisse pro Probe. Die Anschnittschemata für die Bedingungen 5 und 6 sind in Abbildung 3A-G dargestellt.
    6. Speichern Sie die Daten zur Analyse als FCS-Dateien.

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Representative Results

Beurteilung der Mitophagie mit dem farbstoffbasierten MtPhagy-Ansatz
Dieser farbstoffbasierte Ansatz wurde optimiert, um den Mitophagiefluss in primären β-Zellen der Maus zu analysieren, ohne dass ein genetischer Reporter erforderlich ist, wobei Fluozin-3-AM, TMRE und MtPhagy sowie DAPI verwendet wurden, um tote Zellen auszuschließen. Durch die Kombination dieser Farbstoffe mit Valinomycin, um die Mitophagie zu induzieren, skizziert dieses Protokoll eine farbstoffbasierte Methode zur selektiven Messung des Mitophagieflusses in primären β-Zellen der Maus18. Für die mit dieser MtPhagy-Methode gezeigten Daten wurden sowohl basale als auch Valinomycin-induzierte Mitophagie in Inselzellen analysiert, die entweder aus normaler Fettdiät (RFD) oder fettreicher Diät (HFD, 60 kcal% Fett) gefütterten Mäusen isoliert wurden, um die Wirkung von metabolischem Stress auf den Mitophagiefluss zu bewerten. Um die interessierende Population zu identifizieren, wurden die Zellen mit unbehandelten RFD-Inseln angefeindet. Die FSC- und SSC-Spannungen wurden zunächst angepasst, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen in einem SSC-A- vs. FSC-A-Diagramm zu erreichen (Abbildung 1A). Für die Auswahl einzelner Zellen werden sowohl FSC-H als auch FSC-H vs. FSC-W und SSC-H vs. Es wurden SSC-W-Diagramme verwendet, in denen Multipletts aufgrund ihrer höheren Signalbreite im Vergleich zu Einzelzellen ausgeschlossen wurden (Abbildung 1B,C). Als nächstes wurden DAPI-negative Zellen ausgewählt, um tote Zellen20 auszuschließen (Abbildung 1D). Nach der Etablierung von Primärgattern wurden einzeln gefärbte Kontrollen verwendet, um Fluoreszenzgatter für Fluozin-3-AM, MtPhagy und TMRE (Abbildung 1E-G) sowie Kompensationskontrollen für die Mehrfarben-Fluoreszenz-Durchflusszytometrie zu etablieren.

Sobald diese Primär- und Fluoreszenzgatter etabliert waren, wurden β-Zellen mit hoher Mitophagie-Auslastung als Fluozin-Populationmit hoherMtPhagie-hoher TMRE in Quadrant 3 (Q3) unter Verwendung von RFD ohne Valinomycin-Exposition definiert (Abbildung 1H). Mit dieser Gating-Strategie wurden die basalen und Valinomycin-induzierten Mitophagie-Niveaus sowohl in RFD- als auch in HFD-Inseln charakterisiert (Abbildung 2). Zur Quantifizierung des Mitophagieflusses, basal vs. Die Valinomycin-induzierten Mitophagie-Spiegel wurden unter Verwendung des folgenden Verhältnisses verglichen:

Equation 1

Unter Verwendung dieses Verhältnisses wurde der Mitophagiefluss quantifiziert und in RFD vs. HFD-β-Zellen zur Beurteilung von Unterschieden in der Mitophagie nach Induktion von Adipositas und peripherer Insulinresistenz. Quantifizierung des Mitophagieflusses bei RFD vs. HFD-Proben sind in Abbildung 2E dargestellt. Dieses Ergebnis unterstreicht die Machbarkeit dieses Assays zur Quantifizierung der Mitophagie in β-Zellen mit einem einfachen farbstoffbasierten Ansatz. Diese Methode kann auch auf menschlichen Inseln, schwer zu transfizierenden Zellen und auf Inseln angewendet werden, die aus komplexen genetischen Modellen isoliert wurden, bei denen eine Kreuzung mit dem transgenen mt-Keima-Modell umständlich wäre.

Beurteilung der Mitophagie mit dem genetisch kodierten mt-Keima-Reporter
Mt-Keima ist ein fluoreszierendes Protein mit doppelter Anregung, das mit einer Cox8-Lokalisierungssequenz fusioniert ist, die es ermöglicht, auf die innere Mitochondrienmembran abzuzielen. Die bimodale Fluoreszenzeigenschaft von mt-Keima ermöglicht es ihm, seine Anregungsspektren von der neutralen (405 nm) auf die saure (561 nm) Wellenlänge umzuschalten, abhängig vom pH-Wert des intrazellulären Kompartiments6. Dies ermöglicht eine robuste ratiometrische Fluoreszenzanalyse der Mitophagie, bei der ein Anstieg des Säure-neutral-Verhältnisses auf eine Mitophagie-Induktion hinweist. In diesem Protokoll wurde Fluozin-3-AM auch zur Selektion von β-Zellen mittels Durchflusszytometrie verwendet. In diesen repräsentativen Studien wurde der Mitophagiefluss anhand von Inseln untersucht, die von Mäusen isoliert wurden, die mit einer RFD-Diät gefüttert wurden10,11. Die FSC- und SSC-Spannungen wurden zunächst angepasst, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen auf einem SSC-A im Vergleich zu einem SSC-A zu erreichen. FSC-A-Diagramm (Abbildung 3A). Für die Auswahl einzelner Zellen werden sowohl FSC-H als auch FSC-H vs. FSC-W und SSC-H vs. Es wurden SSC-W-Diagramme verwendet, bei denen Multipletts aufgrund ihrer höheren Breitensignalwerte im Vergleich zu Einzelzellen ausgeschlossen wurden (Abbildung 3B,C). Die Spannungs- und Gating-Strategie für DAPI und Fluozin-3-AM wurde mit Hilfe von einfach gefärbten Inseln bestimmt (Abbildung 3D,E). Dreieckstore für die saure und neutrale Population wurden dann unter Verwendung der mt-Keima-positiven Probe ohne Valinomycin-Exposition identifiziert (Abbildung 3F).

Nachdem diese Primär- und Fluoreszenzgatter etabliert waren, wurde der Mitophagiefluss anhand von basalen und Valinomycin-induzierten Veränderungen der mt-Keima-Fluoreszenz beurteilt (Abbildung 3F,G). Zur Quantifizierung des Mitophagieflusses, der basalen Mitophagie vs. Valinomycin-induzierte Spiegel wurden unter Verwendung des folgenden Verhältnisses verglichen:

Equation 2

Anhand dieses Verhältnisses wurde der Mitophagiefluss in RFD-Zellen quantifiziert. Die Quantifizierung dieses Ergebnisses ist in Abbildung 3H dargestellt. Wichtig ist, dass diese Ergebnisse mit den Ergebnissen in RFD-Inselzellen vergleichbar sind, die mit dem MtPhagy-Ansatz erzeugt wurden (Abbildung 3H).

Figure 1
Abbildung 1: Gating-Schema für die MtPhagy-Methode. (A) Flussdiagramm mit dem für alle Zellen auszuwählenden Gating-Schema. (B) Gating zur Auswahl von Singuletts basierend auf FSC-H vs. FSC-W und (C) SSC-H vs. SSC-W. (D) Gating für DAPI-negative Zellen, um tote Zellen auszuschließen. (E) Gating für Fluozin-3-AM-Hochzellen zur Selektion für β-Zellen. (F) Gating-Schema für den MtPhagy-Farbstoff zur Identifizierungvon MtPhagy hohen undMtPhagy niedrigen Zellpopulationen. (G) Gating-Schema für TMRE zur Identifizierungvon TMRE-hohen undTMRE-niedrigen TMRE-Zellpopulationen. (H) Quadranten-Gating-Schema mit unbehandelten RFD-Inseln zur Identifizierung von Fluozin-Zellenmit hohemMtPhagy-hohem TMRE-Gehalt in Quadrant 3 (Q3) als β-Zellen, die einer Mitophagie unterzogen werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Bewertung von Mitophagie-Flussunterschieden in β-Zellen der Maus nach metabolischem Stress unter Verwendung des MtPhagy-Gating-Schemas. Repräsentative Durchflusszytometrie-Diagramme von (A) unbehandelten RFD-β-Zellen, (B) unbehandelten HFD-β-Zellen, (C) Valinomycin-exponierten RFD-β-Zellen und (D) Valinomycin-exponierten HFD-β-Zellen. (E) Quantifizierung des Mitophagieflusses in β-Zellen, berechnet unter Verwendung eines Verhältnisses der MtPhagy-Zellenmit hoherTMRE, die Valinomycin ausgesetzt waren, zu den MtPhagy-Zellenmit niedrigerTMRE, die nicht Valinomycin ausgesetzt waren, sowohl für RFD- als auch für HFD-Proben. *p < 0,05 durch den ungepaarten t-Test des Schülers. n = 3/Gruppe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Anschnittschema für die mt-Keima-Methode und Vergleich zwischen beiden Methoden. (A) Flussdiagramm mit dem für alle Zellen auszuwählenden Anschnittschema. (B) Gating zur Auswahl von Singuletts basierend auf FSC-H vs. FSC-W und (C) SSC-H vs. SSC-W. (D) Gating für DAPI-negative Zellen, um tote Zellen auszuschließen. (E) Gating für Fluozin-3-AM-Hochzellen zur Selektion für β-Zellen. (F) Repräsentative Durchflusszytometrie-Diagramme von mt-Keima/+ unbehandelten Zellen und (G) mt-Keima/+ Valinomycin-exponierten Zellen. (H) Quantifizierung des Mitophagieflusses in β-Zellen von RFD-gefütterten Mäusen, berechnet unter Verwendung eines Verhältnisses der sauren/neutralen Zellen, die Valinomycin ausgesetzt waren, zum Verhältnis der sauren/neutralen Zellen, die nicht Valinomycin ausgesetzt waren, unter Verwendung der mt-Keima-Methode und verglichen mit der MtPhagy-Methode (Daten für das MtPhagy-Protokoll ursprünglich in Abbildung 2E dargestellt). n = 3/Gruppe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Dieses Protokoll beschrieb zwei komplementäre Methoden zur Quantifizierung des Mitophagieflusses in dissoziierten primären Mausinseln. Mit der mt-Keima-Methode wurde ein Anstieg der Mitophagie als erhöhtes Verhältnis von sauren (561 nm) / neutralen (405 nm) Zellen quantifiziert, während in der MtPhagy-Methode ein erhöhter Mitophagiefluss als Anstieg der niedrigen Zellpopulation mit Fluozin-hohemMtPhagy-hohem TMRE-Wert quantifiziert wurde. Diese Methoden ermöglichen eine schnelle, quantitative und β-Zell-spezifische Beurteilung des Mitophagieflusses.

Bei beiden Methoden handelt es sich um einfache Ansätze. Bestimmte Schritte innerhalb dieses Protokolls sind jedoch entscheidend, um qualitativ hochwertige und reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen. Zu diesen Schritten gehören: (1) die richtige Dissoziation der Inselzellen, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten, die jedoch mild genug ist, um die Lebensfähigkeit der Inselzellen zu gewährleisten, (2) die sorgfältige Einrichtung eines Gatings zur korrekten Identifizierung von Populationen von Interesse und (3) die objektive Quantifizierung von Durchflusszytometriedaten mit Hilfe von Softwaretools, um eine unvoreingenommene Bewertung des Mitophagieflusses zu gewährleisten.

Bei der Auswahl der anzuwendenden Methode sollten der Zelltyp und die Art der verwendeten genetischen Modelle berücksichtigt werden. Die mt-Keima-Methode, die entweder in vivo verwendet oder in vitro transfiziert wird, ist eine viel zitierte und angesehene Methode zur Beurteilung der Mitophagie durch Durchflusszytometrie oder Lebendzellbildgebung21. Obwohl die farbstoffbasierte MtPhagy-Methode im Vergleich zu genetischen Reportern ein neuerer Ansatz ist, gibt es Fälle, in denen ihre Verwendung gegenüber mt-Keima bevorzugt werden kann. In der Tat überwindet die MtPhagy-Methode die Notwendigkeit von Transfektion oder komplexen Zuchtschemata, und die MtPhagy-Färbung dauert nur 30 Minuten und wird unmittelbar vor der Durchflusszytometrie durchgeführt. Der MtPhagy-Ansatz kann auch in schwer zu transfizierenden primären humanen Inselproben erfolgreich eingesetzt werden. Dieses Protokoll, das entweder pH-empfindliche mitochondriale Farbstoffe oder Sonden zur direkten Messung der Mitophagie verwendet, unterscheidet sich von einem früheren Ansatz von Mauro-Lizcano et. al, die den membranpotentialsensitiven Farbstoff MitoTracker Deep Red einsetzten und den Einsatz von Mitophagie und lysosomalen Inhibitoren zur Quantifizierung des Mitophagieflusses durch Durchflusszytometrieerforderten 22. Wie die Mauro-Lizcano et. Da die Methode nicht an Inseln getestet wurde, ist es schwierig, sie direkt mit der Wirksamkeit der hier beschriebenen MtPhagy- oder mt-Keima-Methoden zu vergleichen. Zusammengenommen bietet die Kombination dieser Methoden in ihrer Gesamtheit eine zunehmende Anzahl von Möglichkeiten, den Mitophagiefluss in hochquantitativen lebenden Einzelzell-Assays rigoros zu bewerten.

Ein Nachteil beider Methoden ist ihre Unverträglichkeit mit der Zellfixierung. Obwohl beide Methoden mit bildgebenden Verfahren für lebende Zellen kompatibel sind, stört die Zellfixierung den pH-Gradienten von MtPhagy und mt-Keima über die lysosomale Membran 7,16. Als Alternative wurde bisher die Verwendung des mitoQC-Mitophagie-Reporters in fixierten Proben eingesetzt7. Eine weitere Einschränkung beider Methoden besteht darin, dass die Inselzellen vor der Durchflusszytometrie dissoziiert werden müssen, was sich auf die Lebensfähigkeit der Zellen auswirken kann. Daher ist es wichtig, Zellen mit DAPI zu färben, um die Lebensfähigkeit der Zellen nach der Inseldissoziation zu überwachen und sicherzustellen, dass alle Proben konsistent behandelt werden. Nach der DAPI-Färbung wiesen die Proben durchschnittlich 12,7 % ± 7,4 tote Zellen auf (Abbildung 1D), was darauf hindeutet, dass >80 % der Zellen in jeder Probe für die Analyse verwendet werden konnten. Die Überwachung der Zelllebensfähigkeit in jedem Stadium (nach Isolierung von Inselzellen, Kultur und anschließender Dissoziation) kann zusätzlich nützlich sein, um Erkenntnisse über das Überleben der Zellen in jedem Schritt des Verfahrens zu erhalten. Die Variabilität des Timings zwischen der Isolierung von Inselzellen und der Dissoziation einzelner Zellen kann sich ebenfalls auf die Lebensfähigkeit und die Ergebnisse der Zellen auswirken. Daher wird empfohlen, bei allen Experimenten mit dem Timing konsistent zu bleiben.

Da die Qualitätskontrolle der Mitochondrien für die Gesundheit und Funktion β Zellen von entscheidender Bedeutung ist, können sich strenge Bewertungen der Mitophagie mit herkömmlichen biochemischen oder bildgebenden Ansätzen (einschließlich des Umsatzes von mitochondrialen äußeren Membranproteinen, der Lokalisierung der Mitochondrien zu Autophagosomen oder Lysosomen und der Elektronenmikroskopie) als schwierig und zeitaufwändig erweisen. Daher ist die Entwicklung effektiver und robuster Mitophagie-Reportersysteme von entscheidender Bedeutung. Sowohl der mt-Keima- als auch der MtPhagy-Ansatz sind effizient und ermöglichen quantitative Abschätzungen des Mitophagieflusses. Diese beiden Techniken ermöglichen sowohl Flexibilität als auch Präzision bei der Qualitätskontrolle von β-Zell-Mitochondrien und der Untersuchung von Interaktionen zwischen Organellen.

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Disclosures

SAS hat Zuschüsse von Ono Pharmaceutical Co., Ltd. erhalten und ist als Berater für Novo Nordisk tätig.

Acknowledgments

E.L-D. dankt der Unterstützung durch die NIH (T32-AI007413 und T32-AG000114). SAS bedankt sich für die Unterstützung durch die JDRF (COE-2019-861), die NIH (R01 DK135268, R01 DK108921, R01 DK135032, R01 DK136547, U01 DK127747), das Department of Veterans Affairs (I01 BX004444), die Familie Brehm und die Familie Anthony.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibiotic-Antimycotic Life Technologies 15240-062
Attune NxT Flow Cytometer Thermofisher Scientific A24858
Dimethyl Sulfoxide Sigma-Aldrich 317275
Fatty Acid Free heat shock BSA powder Equitech BAH66
Fetal bovine serum Gemini Bio 900-108
Fluozin-3AM  Thermofisher Scientific  F24195 100 μg Fluozin-3AM powder reconstituted in 51 μL DMSO and 51 μL Pluronic F-127 to reach 1 mM stock. 
Gibco RPMI 1640 Medium Fisher Scientific 11-875-093
HEPES (1M) Life Technologies 15630-080
MtPhagy dye Dojindo MT02-10 5 μg MtPhagy powder reconstituted with 50 μL DMSO to reach 100 μM stock. 
MtPhagy dye Dojindo MT02-10
Penicillin-Streptomycin (100x) Life Technologies 15140-122 1x Solution used in procotol by diluting 1:10 in ddH2O
Phosphate buffered saline, 10x Fisher Scientific BP399-20 1x Solution used in procotol by diluting 1:10 in ddH2O
Sodium Pyruvate (100x) Life Technologies 11360-070 5 μg MtPhagy powder reconstituted with 50 μL DMSO to reach 100 μM stock. 
TMRE [Tetramethylrhodamine, ethyl ester, perchlorate] Anaspec AS-88061 TMRE powder reconstituted in DMSO to reach 100 μM stock.
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Thermofisher Scientific 25300054
Valinomycin Sigma V0627 Valinomycin powder reconsituted in DMSO to reach 250 nM stock.

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References

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  22. Mauro-Lizcano, M., et al. New method to assess mitophagy flux by flow cytometry. Autophagy. 11 (5), 833-843 (2015).

Tags

Mitophagiefluss Pankreas-β-Zellen komplementäre Ansätze genetische Reporter Mt-Keima-Mausmodell Quantifizierung der Mitophagie Durchflusszytometrie PH-sensitive ratiometrische Sonde mit doppelter Erregung saure bis neutrale Mt-Keima-Wellenlängenemissionen genetische Mitophagie-Reporter komplexe genetische Mausmodelle schwer zu transfizierende Zellen primäre menschliche Inseln farbstoffbasierte Methode MtPhagie zellpermeabler Farbstoff Lysosomen während der Mitophagie Fluozin-3-AM Zn2+-Indikator Tetramethylrhodaminethylester (TMRE) Potenzial der mitochondrialen Membran
Komplementäre Ansätze zur Untersuchung des Mitophagieflusses in β-Zellen der Bauchspeicheldrüse
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Levi-D’Ancona, E., Sidarala, V., Soleimanpour, S. A. Complementary Approaches to Interrogate Mitophagy Flux in Pancreatic β-Cells. J. Vis. Exp. (199), e65789, doi:10.3791/65789 (2023).

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