Summary
이 프로토콜은 췌장 β 세포에서 미토파지의 정량적 분석을 위한 두 가지 방법을 설명합니다: 첫 번째는 세포 투과성 미토콘드리아 특이적 염료의 조합이고, 두 번째는 유전적으로 인코딩된 미토파지 리포터입니다. 이 두 기술은 상호 보완적이며 특정 요구 사항에 따라 배포할 수 있으므로 미토콘드리아 품질 관리를 정량적으로 처리하는 데 유연성과 정밀도를 제공합니다.
Abstract
미토파지는 최적의 미토콘드리아 기능을 유지하는 데 필요한 품질 관리 메커니즘입니다. 기능 장애β세포 미토파지는 인슐린 분비를 불충분하게 만듭니다. 미토파지의 고급 정량적 평가는 종종 유전자 보고자의 사용을 필요로 합니다. 유세포 분석을 통해 미토파지를 정량화하기 위한 미토콘드리아 표적 pH 민감성 이중 여기 비율계량 프로브를 발현하는 mt-Keima 마우스 모델은 β 세포에서 최적화되었습니다. 산성 대 중성 mt-Keima 파장 방출의 비율은 미토파지를 강력하게 정량화하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나 유전자 미토파지 리포터를 사용하는 것은 복잡한 유전자 마우스 모델 또는 주요 인간 섬과 같이 transfection하기 어려운 세포로 작업할 때 어려울 수 있습니다. 이 프로토콜은 MtPhagy를 사용하여 1차 섬에서 β세포 미토파지를 정량화하는 새로운 보완 염료 기반 방법을 설명합니다. MtPhagy는 미토콘드리아에 축적되어 미토콘드리아가 미토파지 중 리소좀과 같은 낮은 pH 환경에 있을 때 형광 강도를 증가시키는 pH에 민감한 세포 투과성 염료입니다. MtPhagy 염료를 β세포를 선택하는 Zn2+ 표지자인 Fluozin-3-AM 및 테트라메틸로다민, 에틸 에스테르(TMRE)와 결합하여 미토콘드리아 막 전위를 평가함으로써 유세포 분석을 통해 β세포에서 미토파지 플럭스를 특이적으로 정량화할 수 있습니다. 이 두 가지 접근 방식은 매우 상호 보완적이어서 수많은 β세포 모델에서 미토콘드리아 품질 관리를 평가하는 데 유연성과 정확성을 제공합니다.
Introduction
췌장 β세포는 대사 요구를 충족시키기 위해 인슐린을 생산하고 분비하며, β세포 기능 장애는 제1형 당뇨병과 제2형 당뇨병 모두에서 고혈당증과 당뇨병 발병의 원인이 됩니다. β-세포는 미토콘드리아 에너지 및 대사 출력을 통해 포도당 대사와 인슐린 분비를 결합하며, 이는 기능적 미토콘드리아 질량 1,2,3의 예비력에 의존합니다. β세포는 최적의 β세포 기능을 유지하기 위해 미토콘드리아 품질 관리 메커니즘에 의존하여 노화되거나 손상된 미토콘드리아를 제거하고 기능적인 미토콘드리아 질량을 보존합니다4. 선택적 미토콘드리아 자가포식(mitophagy)은 미토콘드리아 품질 관리 경로의 핵심 구성 요소입니다.
살아있는 세포의 미토파지 평가는 종종 미토파지 중에 발생하는 미토콘드리아 pH의 변화에 의존합니다. 미토콘드리아는 약알칼리성 pH를 가지고 있으며, 건강한 미토콘드리아는 일반적으로 pH 중성 세포질에 존재합니다. 미토파지(mitophagy) 동안, 손상되거나 기능장애를 일으킨 미토콘드리아는 선택적으로 자가포식체에 통합되고 결국 산성 리소좀 내에서 제거된다5. mt-Keima6, mitoQC7 및 CMMR8과 같은 여러 in vivo 형질전환 미토파지 리포터 마우스 모델과 Cox8-EGFP-mCherry 플라스미드9와 같은 형질주입 가능한 미토파지 프로브는 이러한 pH 변화를 활용하여 미토파지의 정량적 평가를 제공합니다. mt-Keima pH 민감성 이중 여기 비율계량 프로브를 발현하는 형질전환 마우스의 사용은 유세포 분석10,11을 통해 섬 및 β세포의 미토파지 평가에 최적화되었습니다. 산성 대 중성 mt-Keima 파장 방출의 비율(산성 561nm와 중성 480nm 여기의 비율)은 미토파지 6,12를 강력하게 정량화하는 데 사용할 수 있습니다.
이 프로토콜은 mt-Keima 형질전환 마우스10,11에서 분리한 일차 섬 및 β-세포에서 미토파지 플럭스를 평가하기 위한 최적화된 접근법을 설명합니다. mt-Keima는 매우 민감한 프로브이지만 복잡한 동물 사육 계획이나 세포의 형질주입이 필요하며, 이는 다른 유전자 모델 또는 주요 인간 섬과 함께 작업할 때 종종 어려울 수 있습니다. 또한 중성 및 산성 세포 집단을 식별하기 위해 여러 형광 레이저 및 검출기를 사용하면 다른 형광 리포터의 조합 사용을 제한할 수 있습니다.
이러한 문제를 극복하기 위해 이 프로토콜은 또한 분리된 마우스 섬의 β세포에서 미토파지를 강력하게 검출하기 위한 보완적인 단일 형광 채널, 염료 기반 방법을 설명합니다. MtPhagy 방법이라고 하는 이 접근법은 세 가지 세포 투과성 염료의 조합을 사용하여 β 세포를 선택하고, 미토파지(mitophagy)를 활발하게 진행 중인 세포 집단을 정량화하고, 미토콘드리아 막 전위(MMP 또는 Δψm)를 동시에 평가합니다.
이 염료 중 첫 번째는 Ex/Em 494/516 nm13을 갖는 세포 투과성 Zn2+ 지시체인 Fluozin-3-AM입니다. 마우스 섬은 α, β, δ 및 PP 세포를 포함하여 기능적으로 구별되는 세포의 이질적인 집단으로 구성됩니다. β-세포는 마우스 섬 내 세포의 약 80%를 구성하며 인슐린 과립14,15 내의 높은 Zn2+ 농도로 인해 다른 섬 세포 유형과 구별할 수 있어 β 세포를 Fluozin-3-AM높은 집단으로 식별할 수 있습니다. 화학 결합을 통해 미토콘드리아에 고정되고 약한 형광을 방출하는 pH에 민감한 염료인 MtPhagy 염료도 이 프로토콜16에서 활용됩니다. 미토파지 유도 시 손상된 미토콘드리아가 산성 리소좀에 통합되고 MtPhagy 염료는 낮은 pH 환경(Ex/Em 561/570-700nm) 내에서 형광 강도를 증가시킵니다.
또한 테트라메틸로다민, 에틸 에스테르(TMRE)를 사용하여 MMP를 평가합니다. TMRE는 세포 투과성 양전하를 띤 염료(Ex/Em 552/575 nm)로, 막 전위17에 의해 유지되는 상대적인 음전하로 인해 건강한 미토콘드리아에 의해 격리됩니다. 손상되거나 건강하지 않은 미토콘드리아는 막 전위를 소멸시켜 TMRE를 격리하는 능력을 감소시킵니다. 이러한 염료를 함께 활용하면 미토파지를 겪는 β 세포를 유세포 분석을 통해 FluozinhighMtPhagyhighTMRElow population으로 식별할 수 있습니다. 미토파지는 정적 과정이 아닌 동적 과정이기 때문에 이 프로토콜은 MMP18의 소산 후 미토파지를 유도하는 K+-이온단인 발리노마이신을 사용하여 미토파지 플럭스를 평가하도록 최적화되었습니다. valinomycin의 존재와 부재 상태에서 미토파지를 비교하면 다양한 샘플 그룹에서 미토파지 플럭스를 평가할 수 있습니다.
현재 접근 방식의 염료 기반 특성으로 인해 인간 섬 및 기타 transfection이 어려운 세포 유형으로 외삽할 수 있으며 mt-Keima 프로토콜과 달리 복잡한 동물 육종 계획의 필요성을 피할 수 있습니다. 이 프로토콜의 가장 중요한 목표는 두 가지 독립적인 유세포 분석 기반 방법을 통해 단일 세포 수준에서 β 세포의 미토파지를 정량화하는 것입니다. 종합하면, 이 프로토콜은 미토콘드리아 품질 관리의 정량적 연구에서 정확성과 유연성을 모두 허용하는 두 가지 강력하고 보완적인 방법을 설명합니다.
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Protocol
이 프로토콜에 제시된 동물 연구는 University of Michigan Institutional Animal Care and Use Committee에서 검토 및 승인했습니다. 이 연구에는 15주 일반 지방 식단(RFD) 또는 고지방 식단(HFD)을 섭취한 20주 된 수컷 C57BL/6J 마우스가 사용되었습니다.
1. 염료 기반 MtPhagy 접근법을 통한 미토파지 평가(방법 1)
- 쥐 섬 준비 및 처리
- 아래 단계에 따라 섬 배양 및 valinomycin 노출을 수행합니다.
- 앞서 설명한 방법 2,10에 따라 일반 지방 식단(RFD) 또는 고지방 식단(HFD, 60kcal% 지방19) 마우스에서 섬을 분리합니다.
- 100 units/mL 항진균제-항생제, 50 units/mL 페니실린-스트렙토마이신, 1 mM 나트륨 피루브산, 10 mM HEPES 및 10% 소 태아 혈청(FBS)이 보충된 RPMI 배지에서 37°C에서 밤새 배양 섬 샘플을 채취합니다( 재료 표 참조). 이 매체를 "섬 매체"라고 합니다.
- 피펫을 사용하여 상태당 100개의 작은 섬을 2mL의 섬 배지에 담긴 6cm 페트리 접시에 담습니다.
참고: 이 프로토콜에 사용된 조건: (1) 염색되지 않은 대조군: 염색되지 않은 RFD 섬; (2) DAPI 전용 제어: DAPI로 염색된 RFD 섬; (3) 플루오진-3-AM 전용 대조군: 플루오진-3-AM으로 염색된 RFD 섬; (4) MtPhagy 전용 대조군: MtPhagy로 염색된 RFD 섬; (5) TMRE 전용 제어: TMRE로 염색된 RFD 섬; (6) 처리되지 않은 RFD: MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM 및 DAPI로 염색된 RFD 섬; (7) 발리노마이신에 노출된 RFD 섬: 발리노마이신에 노출되고 MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM 및 DAPI로 염색된 RFD 섬; (8) 처리되지 않은 HFD: MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM 및 DAPI로 염색된 HFD 섬; (9) 발리노마이신에 노출된 HFD 섬: 발리노마이신에 노출되고 MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM 및 DAPI로 염색된 HFD 섬. - 발리노마이신에 노출된 조건 (7) 및 (9)(위의 참고 참조)의 경우, 250nΜ 발리노마이신 스톡( 재료 표 참조) 2μL를 페트리 접시의 섬에 3시간 동안 추가하여 미토파지를 유도합니다.
- 단일 셀 해리를 수행합니다.
- 발리노마이신에 3시간 노출된 후 피펫을 사용하여 각 조건에서 100개의 작은 섬을 별도의 마이크로 원심분리기 튜브에 넣습니다.
- 10°C에서 350 x g 에서 1분 동안 섬을 회전시키고 피펫을 사용하여 상층액을 버립니다.
- 1mL 1x 인산염 완충 식염수(PBS)로 시료를 2회 세척하고 각 세척 사이에 스핀 단계(350 x g/1분, 10°C)를 사용합니다. 세척 후에는 피펫으로 상층액을 버리십시오.
- 섬을 단일 세포로 분리하려면 500μL의 0.05% 트립신(37°C로 예열)을 한 샘플의 마이크로 원심분리 튜브에 추가하여 섬의 과분해를 방지합니다. 섬이 눈에 띄게 분산될 때까지 피펫을 위아래로 반복합니다.
- 트립신을 중화하기 위해 미리 예열된 섬 배지 1mL를 즉시 추가합니다. 각 샘플에 대해 트립신화 및 중화를 한 번에 하나씩 반복합니다.
- 샘플을 500 x g 에서 10°C에서 5분 동안 회전시킵니다. 펠릿을 방해하지 않도록 주의하면서 피펫으로 상층액을 제거합니다.
참고: 펠릿은 발리노마이신에 노출된 샘플에 섬세합니다. - RPMI 배지, 페놀 레드 없음, 100 units/mL 항진균제-항생제, 50 units/mL 페니실린-스트렙토마이신, 1 mM 나트륨 피루브산, 10 mM HEPES 및 10% 소 혈청 알부민(BSA)으로 샘플을 2회 세척합니다. 이 매체는 "섬 유동 매체"라고 합니다. 각 세탁 사이에 탈수 단계(350 x g/1분, 10°C)를 포함합니다. 세척 후에는 피펫으로 상층액을 버리십시오.
- 유세포 분석을 준비하기 위해 MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM 및 DAPI로 세포를 염색합니다.
- 500 μL의 islet 유동 매체에 islet 샘플을 재현탁시킵니다.
- MtPhagy 염료를 받는 튜브에 0.25μL의 100μM MtPhagy 스톡( 재료 표 참조)을 추가합니다(조건 4, 6, 7, 8 및 9, 1.1.1단계 참고).
- TMRE 염료를 받는 튜브에 0.25μL의 100μM TMRE 스톡( 재료 표 참조)을 추가합니다(조건 5, 6, 7, 8 및 9).
- Fluozin-3-AM 염료를 투여하는 튜브에 0.25μL의 1mM Fluozin-3-AM 스톡( 재료 표 참조)을 추가합니다(조건 3, 6, 7, 8 및 9).
- 5초 동안 저속으로 소용돌이 튜브를 혼합합니다.
- 미세 원심분리기 튜브를 알루미늄 호일로 싸서 빛으로부터 보호하고 37°C에서 30분 동안 배양합니다. 배양 중간에 5-10초 동안 저속으로 소용돌이 튜브가 혼합됩니다.
- 배양 후 350 x g 에서 10°C에서 1분 동안 샘플을 원심분리합니다. 피펫을 사용하여 상층액을 폐기하십시오.
- 500 μL islet 유동 매체에 시료를 재현탁시킵니다. 조건 2, 6, 7, 8 및 9에 0.2μg/mL DAPI(재료 표 참조)를 추가합니다.
- 샘플을 350 x g 에서 10°C에서 1분 동안 회전시킵니다. 피펫을 사용하여 상층액을 버리고 500μL의 islet 유동 매체에 재현탁합니다.
- 얼음 위에 샘플을 놓습니다.
- 아래 단계에 따라 섬 배양 및 valinomycin 노출을 수행합니다.
- 유세포 분석
- 계측기를 시작합니다( 재료 표 참조).
참고: 적절한 필터가 있는 모든 유세포 분석기가 작동합니다. 이 연구에서는 다음 필터를 사용했습니다: (1) DAPI용 VL1: 여기/방출 - 405nm/440nm(50nm); (2) Fluozin-3-AM용 BL1: 여기/방출 - 488nm/530nm(30nm); (3) MtPhagy 염료용 BL2: 여기/방출 - 488nm/590nm(40nm); (4) TMRE용 YL1: 여기/방출 - 561nm/585nm(16nm). - 순방향(FSC) 및 측면 산란(SSC)에 대한 전압을 조정하여 세포 집단이 산점도 플롯의 중심에 오도록 합니다. 이 프로토콜의 경우 사용된 전압은 FSC의 경우 120V, SSC의 경우 260V로 셀이 FSC-A 대 균등하게 떨어지도록 했습니다. SSC-A 플롯(그림 1A).
- 단일 셀이 아닌 세포를 제외하려면 FSC-H 대 에 직사각형 게이트를 추가합니다. FSC-W에 이어 SSC-H 대 SSC-W(그림 1B,C).
- DAPI에 대한 전압 및 보정을 조정하여 라이브 β 셀을 필터링합니다. 염색되지 않은 RFD 샘플을 기반으로 사용되는 각 형광단에 대한 형광 게이트를 설정합니다(그림 1D-F).
알림: 각 채널에 사용되는 전압: (1) VL1: 320-360V; (2) BL1: 300-340V; (3) BL2: 260-300V; (4) YL1 : 300-340 V. - 게이트가 설정되면 샘플당 10,000개의 이벤트를 수집합니다.
참고: 이 게이팅 접근법을 활용하여 기초 조건 및 발리노마이신 유도 시 미토파지 수준을 RFD 및 HFD 섬 모두에서 평가했습니다(그림 2). - 분석을 위해 데이터를 FCS 파일로 저장합니다.
- 계측기를 시작합니다( 재료 표 참조).
2. 유전적으로 암호화된 mt-Keima 리포터를 이용한 미토파지 평가(방법 2)
- 마우스 islet 준비 및 single-cell dissociation
- 아래 단계에 따라 섬 배양 및 valinomycin 노출을 수행합니다.
- 야생형(WT) 및 mt-Keima/+(mt-Keima) 마우스에서 췌장 섬을 분리합니다6. 이 방법에서는 20주 된 수컷 WT 또는 mt-Keima/+ 먹이 RFD 마우스를 사용했습니다.
- 37°C에서 하룻밤 동안 섬 배지에서 배양 섬 샘플을 채취합니다.
- 피펫을 사용하여 상태당 100개의 섬을 2mL의 섬 배지가 있는 6cm 페트리 접시에 담습니다.
참고: 이 프로토콜에 사용된 조건: (1) 염색되지 않은 대조군: 염색되지 않은 WT 섬; (2) DAPI 전용 제어: DAPI로 염색된 WT 섬; (3) 플루오진-3-AM 전용 대조군: 플루오진-3-AM으로 염색된 WT 섬; (4) mt-Keima 전용 제어: 염색되지 않은 mt-Keima/+ 섬; (5) 미처리: Fluozin-3-AM 및 DAPI로 염색된 mt-Keima/+ 섬; (6) Valinomycin: valinomycin에 노출되고 Fluozin-3-AM 및 DAPI로 염색된 mt-Keima/+ 섬. - 발리노마이신에 노출된 조건 (6)의 경우, 250nM 발리노마이신 스톡 2μL를 페트리 접시의 섬에 3시간 동안 추가하여 미토파지를 유도합니다.
- 단일 셀 해리를 수행합니다.
- 1.1.2단계에 설명된 대로 단일 셀 분리 단계를 수행합니다.
- Fluozin-3-AM 및 DAPI를 사용한 염색 세포.
- 500 μL의 islet 유동 매체에 islet 샘플을 재현탁시킵니다.
- Fluozin-3-AM 염료를 받는 튜브에 0.25μL의 1mM Fluozin-3-AM 스톡을 추가합니다(조건 3, 5 및 6).
- 37°C에서 세포를 배양하고 1.1.3.5-1.3.10단계에 설명된 대로 DAPI 처리를 진행합니다.
- 아래 단계에 따라 섬 배양 및 valinomycin 노출을 수행합니다.
- 유세포 분석
- 계측기를 시작합니다. 적절한 필터가 있는 모든 유세포 분석기가 작동합니다.
참고: 이 연구에서는 다음 필터를 사용했습니다: (1) DAPI용 VL1: 여기/방출 - 405nm/440nm(50nm); (2) Fluozin-3-AM용 BL1: 여기/방출 - 488nm/530nm(30nm); (3) mt-Keima 중성용 VL3: 여기/방출 - 405nm/603nm(48nm); (4) mt-Keima 산의 경우 YL2: 여기/방출 - 561nm/620nm(15nm). - FSC 및 SSC 전압을 조정하고 1.2.2-1.2.3 단계에 설명된 대로 비단일 셀을 제외합니다(그림 3A-C).
- 형광 양성 세포 집단이 염색되지 않은 세포와 구별할 수 있도록 염색되지 않은 단일 양성 대조군(조건 1-4)을 사용하여 DAPI, Fluozin-3-AM 및 mt-Keima에 대한 전압 및 보정을 조정합니다. 각 채널에 적절한 보정이 적용되면 DAPI 음성 게이트 및 Fluozin-3-AM 양성 게이트를 설정하여 살아있는 β 세포를 필터링합니다(그림 3D-E).
- mt-Keima 양성 샘플(조건 4)을 사용하여 산성 및 중성 세포 집단을 식별하는 삼각 게이팅 체계를 설정합니다(그림 3F).
알림: 각 채널에 일반적으로 사용되는 전압: (1) VL1: 320-340V; (2) BL2: 260-280V; (3) VL3: 280-300V; (4) YL2 : 280-300 V. - 게이트가 설정되면 샘플당 10,000개의 이벤트를 수집합니다. 조건 5 및 6에 대한 게이팅 체계는 그림 3A-G에 나와 있습니다.
- 분석을 위해 데이터를 FCS 파일로 저장합니다.
- 계측기를 시작합니다. 적절한 필터가 있는 모든 유세포 분석기가 작동합니다.
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Representative Results
염료 기반 MtPhagy 접근법을 통한 미토파지 평가
이 염료 기반 접근법은 죽은 세포를 배제하기 위해 DAPI뿐만 아니라 Fluozin-3-AM, TMRE, MtPhagy를 사용하여 유전자 리포터 없이 일차 마우스 β세포 내의 미토파지 플럭스를 분석하도록 최적화되었습니다. 이러한 염료를 발리노마이신과 짝을 이루어 미토파지를 유도함으로써, 이 프로토콜은 일차 마우스 β-세포에서 미토파지 플럭스를 선택적으로 측정하기 위한 염료 기반 방법을 개략적으로 설명한다18. 이 MtPhagy 방법을 사용하여 표시된 데이터의 경우, 대사 스트레스가 미토파지 플럭스에 미치는 영향을 평가하기 위해 일반 지방 식단(RFD) 또는 고지방 식단(HFD, 60kcal% 지방)을 먹인 쥐에서 분리된 섬에서 기저 및 발리노마이신 유도 미토파지를 모두 분석했습니다. 관심 집단을 식별하기 위해 처리되지 않은 RFD 섬을 사용하여 세포를 게이트했습니다. FSC 및 SSC 전압은 먼저 SSC-A 대 FSC-A 플롯에서 세포의 균일한 분포를 얻기 위해 조정되었습니다(그림 1A). 단일 셀을 선택하려면 FSC-H 대 FSC-W 및 SSC-H 대 SSC-W 플롯이 사용되었는데, 여기서 다중은 단일 셀에 비해 더 높은 폭 신호 값으로 인해 제외되었습니다(그림 1B,C). 다음으로, 죽은 세포(20)를 배제하기 위해 DAPI-음성 세포를 선택하였다(도 1D). 1차 게이트를 설정한 후 단일 염색 대조군을 사용하여 Fluozin-3-AM, MtPhagy 및 TMRE(그림 1E-G)에 대한 형광 게이트와 다색 형광 유세포 분석을 위한 보정 대조군을 설정했습니다.
이러한 일차 및 형광 게이트가 설정되면 미토파지 활용도가 높은 β 세포를 발리노마이신 노출 없이 RFD를 사용하여 3사분면(Q3)에서 FluozinhighMtPhagyhighTMRElow population으로 정의되었습니다(그림 1H). 이 게이팅 전략을 사용하여 기저 및 발리노마이신 유도 미토파지 수준은 RFD 및 HFD 섬 모두에서 특성화되었습니다(그림 2). 미토파지 플럭스(mitophagy flux)를 정량화하기 위해, basal vs. 발리노마이신-유도 미토파지 수치는 다음 비율을 사용하여 비교하였다:
이 비율을 사용하여 미토파지 플럭스를 정량화하고 RFD와 비교했습니다. 비만 및 말초 인슐린 저항성 유도에 따른 미토파지의 차이를 평가하기 위한 HFD β 세포. RFD의 미토파지 플럭스 정량화 vs. HFD 샘플은 그림 2E에 나와 있습니다. 이 결과는 간단한 염료 기반 접근법을 사용하여 β 세포의 미토파지를 정량화하기 위한 이 분석의 타당성을 강조합니다. 이 방법은 또한 인간 섬, 형질주입이 어려운 세포 및 mt-Keima 형질전환 모델로의 교차가 번거로운 복잡한 유전자 모델에서 분리된 섬에도 사용할 수 있습니다.
유전적으로 인코딩된 mt-Keima 리포터를 사용한 미토파지 평가
Mt-Keima는 내부 미토콘드리아 막에 대한 표적화를 가능하게 하는 Cox8 국소화 서열과 융합된 이중 여기 형광 단백질입니다. mt-Keima의 이중 모드 형광 특성을 통해 세포 내 구획6의 pH에 따라 여기 스펙트럼을 중성(405nm)에서 산성(561nm) 파장으로 전환할 수 있습니다. 이를 통해 산성 대 중성 비율의 증가가 미토파지 유도를 나타내는 미토파지의 강력한 비율계량 형광 분석이 가능합니다. 이 프로토콜에서 Fluozin-3-AM은 유세포 분석을 통해 β 세포를 선택하는 데에도 사용되었습니다. 이러한 대표적인 연구에서, 미토파지 플럭스는 RFD 식단을 먹인 마우스에서 분리된 섬을 사용하여 평가되었습니다10,11. FSC 및 SSC 전압은 먼저 SSC-A 대 세포의 균일한 분포를 달성하기 위해 조정되었습니다. FSC-A 플롯(그림 3A). 단일 셀을 선택하려면 FSC-H 대 FSC-W 및 SSC-H 대 SSC-W 플롯이 사용되었는데, 여기서 다중은 단일 셀에 비해 폭이 더 큰 신호 값으로 인해 제외되었습니다(그림 3B,C). DAPI 및 Fluozin-3-AM에 대한 전압 및 게이팅 전략은 단일 염색 섬을 사용하여 결정되었습니다(그림 3D,E). 그런 다음 산성 및 중성 집단에 대한 삼각형 게이트는 발리노마이신에 노출되지 않은 mt-Keima 양성 샘플을 사용하여 식별되었습니다(그림 3F).
이러한 1차 및 형광 게이트가 설정되면 mt-Keima 형광의 기저 및 발리노마이신 유도 변화를 사용하여 미토파지 플럭스를 평가했습니다(그림 3F,G). 미토파지 플럭스를 정량화하기 위해, 기초 미토파지 vs. 발리노마이신 유도 수치는 다음 비율을 사용하여 비교하였다:
이 비율을 사용하여 RFD 세포에서 미토파지 플럭스를 정량화했습니다. 이 결과의 정량화는 그림 3H에 나와 있습니다. 중요한 것은 이러한 결과가 MtPhagy 접근법을 사용하여 생성된 RFD 섬의 결과와 비슷하다는 것입니다(그림 3H).
그림 1: MtPhagy 방법에 대한 게이팅 체계. (A) 모든 셀에 대해 선택할 게이팅 체계를 표시하는 흐름도. (B) FSC-H 대 다음을 기반으로 단일항을 선택하는 게이팅 FSC-W 및 (C) SSC-H 대 SSC-W입니다. (D) 죽은 세포를 제외하기 위한 DAPI 음성 세포의 게이팅. (E) β-세포에 대해 선택할 수 있는 Fluozin-3-AM고 세포용 게이팅. (F) MtPhagy고 세포 및 MtPhagy저 세포 집단을 식별하기 위한 MtPhagy 염료의 게이팅 방식. (G) TMRE고 세포 및 TMRE저 세포 집단을 식별하기 위한 TMRE의 게이팅 체계. (H) 3사분면(Q3)의 FluozinhighMtPhagyhighTMRElow 세포를 mitophagy를 겪고 있는 β 세포로 식별하기 위해 처리되지 않은 RFD 섬으로 설정된 사분면 게이팅 체계. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: MtPhagy 게이팅 체계를 사용하여 대사 스트레스에 따른 마우스 β 세포의 미토파지 플럭스 차이 평가. (A) 처리되지 않은 RFD β 세포, (B) 처리되지 않은 HFD β 세포, (C) 발리노마이신 노출 RFD β 세포 및 (D) 발리노마이신 노출 HFD β 세포의 대표적인 유세포 분석 플롯. (E) RFD 및 HFD 샘플 모두에 대해 valinomycin에 노출된 MtPhagyhighTMRElow cell과 valinomycin에 노출되지 않은 MtPhagyhighTMRElow cell의 비율을 사용하여 계산된 β 세포의 미토파지 플럭스 정량화. *p < 스튜던트 쌍을 이루지 않은 t-검정에 의해 0.05. n = 3/그룹. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: mt-Keima 방법의 게이팅 방식 및 두 방법 간의 비교. (A) 모든 셀에 대해 선택할 게이팅 체계를 표시하는 흐름도. (B) FSC-H 대 다음을 기반으로 단일항을 선택하는 게이팅 FSC-W 및 (C) SSC-H 대 SSC-W입니다. (D) 죽은 세포를 제외하기 위한 DAPI 음성 세포의 게이팅. (E) β-세포에 대해 선택할 수 있는 Fluozin-3-AM고 세포용 게이팅. (F) mt-Keima/+ 미처리 세포 및 (G) mt-Keima/+ valinomycin에 노출된 세포의 대표적인 유세포 분석 플롯. (H) MT-Keima 방법을 사용하여 valinomycin에 노출된 산성/중성 세포와 valinomycin에 노출되지 않은 산성/중성 세포의 비율을 사용하여 계산하고 MtPhagy 방법과 비교한 RFD 공급 마우스의 β 세포에서 미토파지 플럭스의 미토파지 플럭스 정량화(원래 그림 2E에 표시된 MtPhagy 프로토콜에 대한 데이터). n = 3/그룹. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 프로토콜은 해리된 1차 마우스 섬에서 미토파지 플럭스를 정량화하기 위한 두 가지 보완적인 방법을 설명했습니다. mt-Keima 방법을 사용하여 미토파지의 증가는 산성(561nm)/중성(405nm) 세포의 증가된 비율로 정량화된 반면, MtPhagy 방법에서는 증가된 미토파지 플럭스가 FluozinhighMtPhagy높은TMRE낮은 세포 집단의 증가로 정량화되었습니다. 이러한 방법을 사용하면 미토파지 플럭스에 대한 신속하고 정량적이며 세포 β 특이적 평가가 가능합니다.
두 방법 모두 간단한 접근 방식입니다. 그러나 이 프로토콜의 특정 단계는 품질과 재현 가능한 결과를 얻는 데 매우 중요합니다. 이러한 단계에는 (1) 단일 세포 현탁액을 얻기 위한 적절한 섬 해리, 그러나 섬 생존력을 보장할 수 있을 만큼 충분히 경미한 분리, (2) 관심 집단을 올바르게 식별하기 위한 게이팅의 신중한 설정, (3) 미토파지 플럭스의 편향되지 않은 평가를 보장하기 위한 소프트웨어 도구를 통한 유세포 분석 데이터의 객관적인 정량화가 포함됩니다.
사용할 방법을 선택할 때 사용되는 유전자 모델의 세포 유형과 특성을 고려해야 합니다. in vivo 또는 in vitro에서 transfection된 mt-Keima 방법은 유세포 분석 또는 라이브 셀 이미징에 의한 미토파지 평가에서 많이 인용되고 잘 알려진 방법입니다21. 염료 기반 MtPhagy 방법은 유전자 리포터에 비해 새로운 접근 방식이지만 mt-Keima보다 사용이 선호되는 경우가 있습니다. 실제로, MtPhagy 분석법은 transfection 또는 복잡한 증식 계획의 필요성을 극복하며, MtPhagy 염색은 30분밖에 걸리지 않으며 유세포 분석 직전에 수행됩니다. MtPhagy 접근법은 transfection이 어려운 1차 인간 섬 샘플에도 성공적으로 사용할 수 있습니다. pH에 민감한 미토콘드리아 염료 또는 프로브를 사용하여 미토파지를 직접 측정하는 이 프로토콜은 Mauro-Lizcano 등의 이전 접근 방식과 다릅니다. 막 전위에 민감한 MitoTracker Deep Red 염료를 사용하고 유세포 분석으로 미토파지 플럭스를 정량화하기 위해 미토파지 및 리소좀 억제제를 사용해야 했습니다22. Mauro-Lizcano 등으로. al 방법은 섬에서 테스트되지 않았으므로 여기에 설명된 MtPhagy 또는 mt-Keima 방법의 효능과 직접 비교하기는 어렵습니다. 종합하면, 이러한 방법의 조합은 전체적으로 매우 정량적인 살아있는 단일 세포 분석에서 미토파지 플럭스를 엄격하게 평가할 수 있는 점점 더 많은 옵션을 제공합니다.
두 방법 모두 세포 고정과 호환되지 않는다는 단점이 있습니다. 두 방법 모두 살아있는 세포 이미징 접근법과 호환되지만 세포 고정은 리소좀 막 7,16을 가로지르는 MtPhagy 및 mt-Keima의 pH 구배를 방해합니다. 대안으로, 조정 표본에 있는 mitoQC mitophagy 보고자의 사용은 이전에 채택되었습니다7. 또한 두 방법 모두 유세포 분석 전에 섬을 해리해야 한다는 한계가 있으며, 이는 세포 생존율에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서 섬 해리 후 세포 생존율을 모니터링하고 모든 샘플이 일관되게 처리되도록 하기 위해 DAPI로 세포를 염색하는 것이 중요합니다. DAPI 염색 후 샘플은 평균 12.7% ± 7.4개의 죽은 세포를 가지고 있었으며(그림 1D), 이는 각 샘플의 세포 >80%를 분석에 사용할 수 있음을 나타냅니다. 각 단계(섬 분리, 배양 및 해리 후)에서 세포 생존율의 모니터링은 절차의 각 단계에서 세포 생존에 대한 지식을 획득하는 데 추가적으로 유용할 수 있습니다. 섬 분리와 단일 세포 해리 사이의 타이밍 가변성도 세포 생존율과 결과에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서 모든 실험에서 타이밍을 일관되게 유지하는 것이 좋습니다.
미토콘드리아 품질 관리는 β세포 건강과 기능에 매우 중요하기 때문에 기존의 생화학적 또는 이미징 접근 방식(미토콘드리아 외막 단백질의 회전율, 자가포식 또는 리소좀에 대한 미토콘드리아 국소화, 전자 현미경 검사)을 사용하여 미토파지를 엄격하게 평가하는 것은 어렵고 시간이 많이 소요될 수 있습니다. 따라서 효과적이고 강력한 미토파지 리포터 시스템의 개발이 중요합니다. mt-Keima 및 MtPhagy 접근법은 모두 효율적이며 미토파지 플럭스의 정량적 평가가 가능합니다. 이 두 가지 기술은 β세포 미토콘드리아 품질 관리를 처리하고 세포 기관 간 상호 작용을 조사하는 데 유연성과 정밀도를 모두 허용합니다.
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Disclosures
SAS는 Ono Pharmaceutical Co., Ltd.로부터 보조금을 받았으며 Novo Nordisk의 컨설턴트입니다.
Acknowledgments
E.L-D. NIH(T32-AI007413 및 T32-AG000114)의 지원을 인정합니다. SAS는 JDRF(COE-2019-861), NIH(R01 DK135268, R01 DK108921, R01 DK135032, R01 DK136547, U01 DK127747), 재향군인회(I01 BX004444), Brehm 가족 및 Anthony 가족의 지원을 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibiotic-Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| Attune NxT Flow Cytometer | Thermofisher Scientific | A24858 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | 317275 | |
| Fatty Acid Free heat shock BSA powder | Equitech | BAH66 | |
| Fetal bovine serum | Gemini Bio | 900-108 | |
| Fluozin-3AM | Thermofisher Scientific | F24195 | 100 μg Fluozin-3AM powder reconstituted in 51 μL DMSO and 51 μL Pluronic F-127 to reach 1 mM stock. |
| Gibco RPMI 1640 Medium | Fisher Scientific | 11-875-093 | |
| HEPES (1M) | Life Technologies | 15630-080 | |
| MtPhagy dye | Dojindo | MT02-10 | 5 μg MtPhagy powder reconstituted with 50 μL DMSO to reach 100 μM stock. |
| MtPhagy dye | Dojindo | MT02-10 | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | Life Technologies | 15140-122 | 1x Solution used in procotol by diluting 1:10 in ddH2O |
| Phosphate buffered saline, 10x | Fisher Scientific | BP399-20 | 1x Solution used in procotol by diluting 1:10 in ddH2O |
| Sodium Pyruvate (100x) | Life Technologies | 11360-070 | 5 μg MtPhagy powder reconstituted with 50 μL DMSO to reach 100 μM stock. |
| TMRE [Tetramethylrhodamine, ethyl ester, perchlorate] | Anaspec | AS-88061 | TMRE powder reconstituted in DMSO to reach 100 μM stock. |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermofisher Scientific | 25300054 | |
| Valinomycin | Sigma | V0627 | Valinomycin powder reconsituted in DMSO to reach 250 nM stock. |
References
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