Biology

Kompletterande metoder för att undersöka mitofagiskt flöde i bukspottkörtelns β-celler

Published: September 15, 2023 doi: 10.3791/65789

Elena Levi-D’Ancona^1,2, Vaibhav Sidarala¹, Scott A. Soleimanpour^1,3,4

¹Department of Internal Medicine, Division of Metabolism, Endocrinology and Diabetes, University of Michigan, Ann Arbor, ²Graduate Program in Immunology, University of Michigan Medical School, ³Department of Molecular and Integrative Physiology, University of Michigan, Ann Arbor, ⁴VA Ann Arbor Healthcare System

Summary

Detta protokoll beskriver två metoder för kvantitativ analys av mitofagi i bukspottkörtelns β-celler: för det första en kombination av cellpermeabla mitokondriespecifika färgämnen, och för det andra en genetiskt kodad mitofagireporter. Dessa två tekniker kompletterar varandra och kan användas baserat på specifika behov, vilket möjliggör flexibilitet och precision när det gäller att kvantitativt ta itu med mitokondriell kvalitetskontroll.

Abstract

Mitofagi är en kvalitetskontrollmekanism som är nödvändig för att upprätthålla optimal mitokondriell funktion. Dysfunktionell β-cellig mitofagi resulterar i otillräcklig insulinfrisättning. Avancerade kvantitativa bedömningar av mitofagi kräver ofta användning av genetiska rapportörer. Musmodellen mt-Keima, som uttrycker en mitokondrieriktad pH-känslig dubbelexcitationskvotmetrisk sond för kvantifiering av mitofagi via flödescytometri, har optimerats i β-celler. Förhållandet mellan sura och neutrala mt-Keima-våglängdsutsläpp kan användas för att på ett robust sätt kvantifiera mitofagi. Att använda genetiska mitofagirapportörer kan dock vara utmanande när man arbetar med komplexa genetiska musmodeller eller svårtransfekterade celler, såsom primära mänskliga öar. Detta protokoll beskriver en ny komplementär färgämnesbaserad metod för att kvantifiera β-cellsmitofagi i primära öar med hjälp av MtPhagy. MtPhagy är ett pH-känsligt, cellgenomsläppligt färgämne som ackumuleras i mitokondrierna och ökar dess fluorescensintensitet när mitokondrier befinner sig i miljöer med lågt pH, såsom lysosomer under mitofagi. Genom att kombinera MtFagy-färgämnet med Fluozin-3-AM, en Zn²⁺ -indikator som selekterar för β-celler, och tetrametylrhodamin, etylester (TMRE) för att bedöma mitokondriell membranpotential, kan mitofagiskt flöde kvantifieras specifikt i β-celler via flödescytometri. Dessa två tillvägagångssätt är mycket komplementära, vilket möjliggör flexibilitet och precision vid bedömning av mitokondriell kvalitetskontroll i många β-cellsmodeller.

Introduction

Bukspottkörtelns β-celler producerar och utsöndrar insulin för att möta metaboliska krav, och β-cellsdysfunktion är ansvarig för hyperglykemi och diabetesdebut vid både typ 1- och typ 2-diabetes. β-celler kopplar glukosmetabolism med insulinutsöndring via mitokondriell energi och metabolisk produktion, som beror på en reserv av funktionell mitokondriell massa ^1,2,3. För att upprätthålla optimal β-cellsfunktion förlitar sig β-celler på mitokondriella kvalitetskontrollmekanismer för att avlägsna åldrade eller skadade mitokondrier och bevara funktionell mitokondriell massa⁴. Selektiv mitokondriell autofagi, även känd som mitofagi, är en nyckelkomponent i den mitokondriella kvalitetskontrollvägen.

Bedömningar av mitofagi i levande celler förlitar sig ofta på förändringar i mitokondriellt pH som uppstår under mitofagi. Mitokondrier har ett svagt alkaliskt pH, och friska mitokondrier finns normalt i den pH-neutrala cytosolen. Under mitofagi inkorporeras skadade eller dysfunktionella mitokondrier selektivt i autofagosomer och elimineras så småningom i sura lysosomer⁵. Flera in vivo transgena mitofagiska reportermusmodeller, såsom mt-Keima⁶, mitoQC⁷ och CMMR⁸, såväl som transfekterbara mitofagiska sonder, såsom Cox8-EGFP-mCherry plasmid⁹, använder denna pH-förändring för att ge kvantitativa bedömningar av mitofagi. Användning av transgena möss som uttrycker den pH-känsliga dual-excitation ratiometriska sonden mt-Keima har optimerats för mitofagibedömningar i öar och β-celler via flödescytometri ^10,11. Förhållandet mellan sur och neutral mt-Keima-våglängdsemission (förhållandet mellan sur 561 nm och neutral 480 nm excitation) kan användas för att på ett robust sätt kvantifiera mitofagi ^6,12.

Detta protokoll beskriver ett optimerat tillvägagångssätt för att bedöma mitofagiflödet i primära öar och β-celler isolerade från mt-Keima transgena möss ^10,11. Även om mt-Keima är en mycket känslig sond kräver den antingen komplicerade djuravelssystem eller transfektion av celler, vilket ofta kan vara en utmaning när man arbetar i kombination med andra genetiska modeller eller med primära mänskliga öar. Dessutom kan användningen av flera fluorescenslasrar och detektorer för att identifiera neutrala och sura cellpopulationer begränsa den kombinatoriska användningen av andra fluorescerande rapportörer.

För att övervinna dessa utmaningar beskriver detta protokoll också en komplementär, enkelfluorescerande kanal, färgämnesbaserad metod för robust detektion av mitofagi i β-celler från isolerade musöar. Detta tillvägagångssätt, kallat MtPhagy-metoden, använder en kombination av tre cellpermeabla färgämnen för att selektera för β-celler, kvantifiera cellpopulationerna som aktivt genomgår mitofagi och bedöma mitokondriell membranpotential (MMP eller Δψm) samtidigt.

Det första av dessa färgämnen är Fluozin-3-AM, en cellpermeabel Zn²⁺-indikator med en Ex/Em 494/516 nm¹³. Musöar består av en heterogen population av funktionellt distinkta celler, inklusive α-, β-, δ- och PP-celler. β-celler utgör cirka 80 % av cellerna i musön och kan särskiljas från andra ö-celltyper på grund av deras höga Zn²⁺-koncentration i insulingranulat^14,15, vilket gör det möjligt att identifiera β-celler som den^höga populationen av Fluozin-3-AM. MtPhagy-färgämnet, ett pH-känsligt färgämne som immobiliseras på mitokondrier via en kemisk bindning och avger svag fluorescens, används också i detta protokoll¹⁶. Vid mitofaginiduktion inkorporeras skadade mitokondrier i den sura lysosomen, och MtFagy-färgämnet ökar sin fluorescensintensitet i miljön med lågt pH (Ex/Em 561/570-700 nm).

Dessutom används tetrametylrhodamin, etylester (TMRE), för att bedöma MMP. TMRE är ett cellpermeabelt positivt laddat färgämne (Ex/Em 552/575 nm) som binds av friska mitokondrier på grund av den relativa negativa laddningen som upprätthålls av deras membranpotential¹⁷. Skadade eller sjuka mitokondrier förlorar sin membranpotential, vilket resulterar i minskad förmåga att binda TMRE. Genom att använda dessa färgämnen tillsammans kan β-celler som genomgår mitofagi identifieras som Fluozin^highMtPhagy^highTMRE^low population via flödescytometri. Eftersom mitofagi är en dynamisk snarare än statisk process, optimerades detta protokoll för att bedöma mitofagiskt flöde med hjälp av valinomycin, en K⁺-jonofor som inducerar mitofagi efter avledning av MMP¹⁸. Jämförelse av mitofagi i närvaro och frånvaro av valinomycin möjliggör bedömning av mitofagiskt flöde i olika provgrupper.

Den nuvarande metodens färgämnesbaserade karaktär gör det möjligt att extrapolera den till mänskliga öar och andra celltyper som är svåra att transfektera och kringgår behovet av komplicerade djuravelssystem, till skillnad från mt-Keima-protokollet. Det övergripande målet med detta protokoll är att kvantifiera mitofagi i β-celler på encellsnivå via två oberoende flödescytometribaserade metoder. Sammantaget beskriver detta protokoll två kraftfulla och kompletterande metoder som möjliggör både precision och flexibilitet i den kvantitativa studien av mitokondriell kvalitetskontroll.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Djurstudierna som presenteras i detta protokoll har granskats och godkänts av University of Michigan Institutional Animal Care and Use Committee. Tjugo veckor gamla C57BL/6J-möss, på antingen en 15-veckors vanlig fettdiet (RFD) eller högfettdiet (HFD), användes för denna studie.

1. Bedömning av mitofagi med hjälp av den färgämnesbaserade MtPhagy-metoden (metod 1)

Förberedelse och behandling av musöar
1. Utför öodling och exponering för valinomycin genom att följa stegen nedan.
  1. Isolera holmar från möss med antingen vanlig fettdiet (RFD) eller fettrik kost (HFD, 60 kcal% fett¹⁹) enligt de tidigare beskrivna metoderna ^2,10.
  2. Odlingsprover från öar över natten vid 37 °C i RPMI-medium kompletterat med 100 enheter/ml antimykotisk-antibiotikum, 50 enheter/ml penicillin-streptomycin, 1 mM natriumpyruvat, 10 mM HEPES och 10 % fetalt bovint serum (FBS) (se materialförteckning). Detta medium kommer att kallas "ö-medium".
  3. Använd en pipett och plocka 100 öar per tillstånd i 6 cm petriskålar i 2 ml ömedium.
    OBS: Villkor som används för detta protokoll: (1) Ofärgad kontroll: ofärgade RFD-öar; (2) DAPI endast kontroll: RFD-öar färgade med DAPI; (3) Endast Fluozin-3-AM-kontroll: RFD-öar färgade med Fluozin-3-AM; (4) Endast MtPhagy kontroll: RFD-öar färgade med MtPhagy; 5. Endast TMRE-kontroll: RFD-öar färgade med TMRE. (6) RFD obehandlad: RFD-öar färgade med MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM och DAPI; (7) Valinomycinexponerade RFD-öar: RFD-öar som exponerats för valinomycin och färgats med MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM och DAPI. (8) HFD obehandlad: HFD-öar färgade med MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM och DAPI; (9) HFD-öar som exponerats för valinomycin: öar som exponerats för valinomycin och färgats med MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM och DAPI.
  4. För betingelserna (7) och (9) (se anmärkning ovan) som exponeras för valinomycin, tillsätt 2 μl 250 nΜ valinomycinbuljong (se materialtabell) till öar i petriskålen i 3 timmar för att inducera mitofagi.
2. Utför encellsdissociation.
  1. Efter 3 timmars exponering för valinomycin, plocka 100 öar från varje tillstånd i separata mikrocentrifugrör med hjälp av en pipett.
  2. Snurra holmarna vid 350 x g i 1 minut vid 10 °C och kassera supernatanten med en pipett.
  3. Tvätta proverna 2x med 1 ml 1x fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS), med centrifugeringssteg (350 x g/1 min, 10 °C) mellan varje tvätt. Kassera supernatanten med en pipett efter varje tvätt.
  4. För att dela upp öar i enstaka celler, tillsätt 500 μL 0,05 % trypsin (förvärmt till 37 °C) till mikrocentrifugröret i ett prov för att förhindra översmältning av öar. Pipettera upp och ner upprepade gånger tills holmarna är synligt spridda.
  5. Tillsätt omedelbart 1 ml förvärmt ö-medium för att neutralisera trypsin. Upprepa trypsinisering och neutralisering för varje sample, en i taget.
  6. Centrifugera proverna i 500 x g i 5 minuter vid 10 °C. Ta bort supernatanten med en pipett, var noga med att inte störa pelleten.
    OBS: Pellets kommer att vara känsligt för prover som exponeras för valinomycin.
  7. Tvätta prover 2x med RPMI-medium, utan fenolrött, kompletterat med 100 enheter/ml antimykotisk-antibiotikum, 50 enheter/ml penicillin-streptomycin, 1 mM natriumpyruvat, 10 mM HEPES och 10% bovint serumalbumin (BSA). Detta medium kommer att kallas "öflödesmedium". Centrifugera i olika steg (350 x g/1 min, 10 °C) mellan varje tvätt. Kassera supernatanten med en pipett efter varje tvätt.
3. Färga celler med MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM och DAPI för att förbereda för flödescytometri.
  1. Återsuspendera öprover i 500 μl ö-flödesmedium.
  2. Tillsätt 0,25 μL 100 μM MtPhagy (se Materialtabell) till rör som får MtPhagy färgämne (villkor 4, 6, 7, 8 och 9, OBS till steg 1.1.1).
  3. Tillsätt 0,25 μl 100 μM TMRE-stam (se materialtabell) till rör som får TMRE-färgämne (villkor 5, 6, 7, 8 och 9).
  4. Tillsätt 0,25 μl 1 mM Fluozin-3-AM-stam (se materialtabell) till rör som får Fluozin-3-AM färgämne (villkor 3, 6, 7, 8 och 9).
  5. Virvelrör på låg hastighet i 5 s för att blanda.
  6. Linda in mikrocentrifugrören i aluminiumfolie för att skydda mot ljus och inkubera vid 37 °C i 30 minuter. Halvvägs genom inkubationen, virvla rören med låg hastighet i 5-10 s för att blanda.
  7. Efter inkubationen centrifugeras proverna vid 350 x g i 1 minut vid 10 °C. Kassera supernatanten med en pipett.
  8. Återsuspendera proverna i ett 500 μl ö-flödesmedium. Tillsätt 0,2 μg/ml DAPI (se materialtabell) till villkoren 2, 6, 7, 8 och 9.
  9. Centrifugera proverna i 350 x g i 1 minut vid 10 °C. Kassera supernatanten med en pipett och återsuspendera i 500 μl flödesmedium för öar.
  10. Lägg proverna på is.
Flödescytometri
1. Starta instrumentet (se materialtabell).
  OBS: Alla flödescytometrar med lämpliga filter fungerar. Följande filter användes i denna studie: (1) VL1 för DAPI: Excitation/emission - 405 nm/440 nm (50 nm); (2) BL1 för fluozin-3-AM: excitation/emission - 488 nm/530 nm (30 nm); (3) BL2 för MtPhagy-färgämne: Excitation/emission - 488 nm/590 nm (40 nm). (4) YL1 för TMRE: Excitation/emission – 561 nm/585 nm (16 nm).
2. Justera spänningarna för framåt (FSC) och sidospridning (SSC) för att säkerställa att cellpopulationerna är i mitten av spridningsdiagrammet. För detta protokoll var spänningarna som användes 120 V för FSC och 260 V för SSC för att säkerställa att cellerna faller jämnt inom FSC-A jämfört med FSC. SSC-A-diagram (figur 1A).
3. För att utesluta icke-enskilda celler, lägg till en rektangulär grind på FSC-H vs. FSC-W följt av SSC-H vs. SSC-W (Figur 1B,C).
4. Justera spänningar och kompensation för DAPI för att filtrera efter levande β-celler. Ställ in fluorescensgrindar för varje fluorofor som används baserat på det ofärgade RFD-provet (figur 1D-F).
  OBS: Voltages som används för varje kanal: (1) VL1: 320-360 V; (2) BL1: 300-340 V; (3) BL2: 260-300 V; (4) YL1: 300–340 V.
5. När grindarna har upprättats samlar du in 10 000 händelser per exempel.
  OBS: Med hjälp av denna gating-metod bedömdes mitofaginivåerna under basala förhållanden och vid valinomycininduktion i både RFD- och HFD-öar (Figur 2).
6. Spara data som FCS-filer för analys.

2. Bedömning av mitofagi med hjälp av den genetiskt kodade mt-Keima-reportern (metod 2)

Förberedelse av musöar och encellsdissociation
1. Utför öodling och exponering för valinomycin genom att följa stegen nedan.
  1. Isolera langerhanska öar från möss av vildtyp (WT) och mt-Keima/+ (mt-Keima)^6. I denna metod användes 20 veckor gamla WT- eller mt-Keima/+-matade RFD-möss.
  2. Odlingsprover från öar över natten vid 37 °C i holmmedium.
  3. Använd en pipett och plocka 100 öar per tillstånd i 6 cm petriskålar med 2 ml ömedium.
    OBS: Villkor som används för detta protokoll: (1) Ofärgad kontroll: Ofärgade WT-öar; (2) DAPI endast kontroll: WT-öar färgade med DAPI; (3) Endast Fluozin-3-AM kontroll: WT-öar färgade med Fluozin-3-AM; (4) Endast kontroll av mt-Keima: Ofärgade öar i mt-Keima/+. (5) Obehandlade: mt-Keima/+ öar färgade med Fluozin-3-AM och DAPI; (6) Valinomycin: mt-Keima/+ öar som exponerats för valinomycin och färgats med Fluozin-3-AM och DAPI.
  4. För tillstånd (6) med exponering för valinomycin, tillsätt 2 μl 250 nM valinomycinbuljong till holmar i petriskål i 3 timmar för att inducera mitofagi.
2. Utför encellsdissociation.
  1. Utför encellsdissociationssteg enligt beskrivningen i steg 1.1.2.
3. Färga cellerna med Fluozin-3-AM och DAPI.
  1. Återsuspendera öprover i 500 μl ö-flödesmedium.
  2. Tillsätt 0,25 μl 1 mM Fluozin-3-AM-stam till rör som får Fluozin-3-AM-färgämne (villkor 3, 5 och 6).
  3. Inkubera cellerna vid 37 °C och fortsätt med DAPI-behandling enligt beskrivningen i steg 1.1.3.5–1.3.10.
Flödescytometri
1. Starta instrumentet. Vilken flödescytometer som helst med lämpliga filter fungerar.
  OBS: Följande filter användes i denna studie: (1) VL1 för DAPI: Excitation/emission - 405 nm/440 nm (50 nm); (2) BL1 för fluozin-3-AM: excitation/emission - 488 nm/530 nm (30 nm); (3) VL3 för mt-Keima neutral: Excitation/emission - 405 nm/603 nm (48 nm). (4) YL2 för mt-Keimasyra: Excitation/emission - 561 nm/620 nm (15 nm).
2. Justera FSC- och SSC-spänningar och uteslut icke-enskilda celler enligt beskrivningen i steg 1.2.2-1.2.3 (figur 3A-C).
3. Justera spänningar och kompensation för DAPI, Fluozin-3-AM och mt-Keima med hjälp av ofärgade och enstaka positiva kontroller (villkor 1-4) för att säkerställa att fluorescenspositiva cellpopulationer kan särskiljas från ofärgade celler. När lämplig kompensation har tillämpats på varje kanal, ställ in DAPI-negativ grind och Fluozin-3-AM positiva grindar för att filtrera efter levande β-celler (figur 3D-E).
4. Ställ in ett triangelgateringsschema med hjälp av det positiva provet mt-Keima (villkor 4) för att identifiera sura och neutrala cellpopulationer (figur 3F).
  OBS: Voltages som vanligtvis används för varje kanal: (1) VL1: 320-340 V; (2) BL2: 260-280 V; (3) VL3: 280-300 V; (4) YL2: 280-300 V.
5. När grindarna har upprättats samlar du in 10 000 händelser per exempel. Grind-scheman för villkoren 5 och 6 illustreras i figur 3A-G.
6. Spara data som FCS-filer för analys.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bedömning av mitofagi med hjälp av den färgämnesbaserade MtPhagy-metoden
Detta färgämnesbaserade tillvägagångssätt optimerades för att analysera mitofagiskt flöde i primära β-celler hos möss utan behov av en genetisk rapportör, med hjälp av Fluozin-3-AM, TMRE och MtPhagy samt DAPI för att utesluta döda celler. Genom att para ihop dessa färgämnen med valinomycin för att inducera mitofagi beskriver detta protokoll en färgämnesbaserad metod för att selektivt mäta mitofagiskt flöde i primära β-celler^{hos möss 18}. För de data som visades med denna MtPhagy-metod analyserades både basal och valinomycin-inducerad mitofagi i öar som isolerats från antingen vanlig fettdiet (RFD) eller fettrik kost (HFD, 60 kcal% fett) som matats med möss för att bedöma effekten av metabol stress på mitofagiflödet. För att identifiera den intressanta populationen inhägnades cellerna med hjälp av obehandlade RFD-öar. FSC- och SSC-spänningarna justerades först för att uppnå en jämn fördelning av cellerna på ett SSC-A-diagram jämfört med ett FSC-A-diagram (figur 1A). För att välja för enstaka celler, både FSC-H vs. FSC-W och SSC-H vs. SSC-W-diagram användes, där multiplar uteslöts på grund av deras högre signalvärden med högre bredd jämfört med enskilda celler (figur 1B,C). Därefter valdes DAPI-negativa celler för att utesluta döda celler²⁰ (figur 1D). Efter att ha etablerat primära grindar användes enkelfärgade kontroller för att etablera fluorescensgrindar för Fluozin-3-AM, MtPhagy och TMRE (Figur 1E-G) samt kompensationskontroller för flerfärgad fluorescensflödescytometri.

När dessa primära grindar och fluorescensgrindar hade etablerats definierades β-celler med högt utnyttjande av mitofagi som Fluozin^highMtPhagy^highTMRE^lowpopulation i kvadrant 3 (Q3) med användning av RFD utan valinomycinexponering (Figur 1H). Med hjälp av denna regleringsstrategi karakteriserades basala och valinomycin-inducerade mitofaginivåer i både RFD- och HFD-öar (Figur 2). För att kvantifiera mitofagiskt flöde, basalt vs. Valinomycin-inducerade mitofaginivåer jämfördes med följande förhållande:

Equation 1

Med hjälp av detta förhållande kvantifierades mitofagiskt flöde och jämfördes i RFD vs. HFD β-celler för att bedöma skillnader i mitofagi efter induktion av fetma och perifer insulinresistens. Kvantifiering av mitofagiskt flöde i RFD vs. HFD-proverna visas i figur 2E. Detta resultat belyser genomförbarheten av denna analys för att kvantifiera mitofagi i β-celler med hjälp av ett enkelt färgämnesbaserat tillvägagångssätt. Denna metod kan också användas i mänskliga öar, svårtransfekterade celler och öar isolerade från komplexa genetiska modeller där korsning med den transgena mt-Keima-modellen skulle vara besvärlig.

Bedömning av mitofagi med hjälp av den genetiskt kodade mt-Keima-reportern
Mt-Keima är ett fluorescerande protein med dubbel excitation sammansmält med en Cox8-lokaliseringssekvens som gör det möjligt att rikta in sig på det inre mitokondriemembranet. Den bimodala fluorescerande egenskapen hos mt-Keima gör det möjligt för den att växla sina excitationsspektra från den neutrala (405 nm) till sura (561 nm) våglängden, beroende på pH i det intracellulära facket⁶. Detta möjliggör en robust ratiometrisk fluorescensanalys av mitofagi, där en ökning av förhållandet mellan surt och neutralt indikerar mitofaginiduktion. I detta protokoll användes Fluozin-3-AM också för att selektera för β-celler via flödescytometri. I dessa representativa studier bedömdes mitofagiskt flöde med hjälp av öar isolerade från möss som utfodrades med en RFD-diet^10,11. FSC- och SSC-spänningarna justerades först för att uppnå en jämn fördelning av cellerna på en SSC-A vs. FSC-A-diagram (figur 3A). För att välja för enstaka celler, både FSC-H vs. FSC-W och SSC-H vs. SSC-W-diagram användes, där multiplar uteslöts på grund av deras högre signalvärden med högre bredd jämfört med enskilda celler (figur 3B,C). Spännings- och regleringsstrategin för DAPI och Fluozin-3-AM bestämdes med hjälp av enfärgade öar (figur 3D,E). Trianglar för de sura och neutrala populationerna identifierades sedan med hjälp av det mt-Keima-positiva provet utan exponering för valinomycin (figur 3F).

När dessa primära och fluorescensgrindar hade etablerats bedömdes mitofagiskt flöde med hjälp av basala och valinomycin-inducerade förändringar i mt-Keima-fluorescens (Figur 3F,G). För att kvantifiera mitofagiskt flöde, basal mitofagi vs. Valinomycin-inducerade nivåer jämfördes med följande förhållande:

Equation 2

Med hjälp av detta förhållande kvantifierades mitofagiflödet i RFD-celler. Kvantifiering av detta resultat visas i figur 3H. Det är viktigt att notera att dessa resultat är jämförbara med resultaten i RFD-öar som genererats med hjälp av MtFagy-metoden (figur 3H).

Figur 1: Grind-schema för MtPhagy-metoden. (A) Flödesdiagram som visar grindschema som ska väljas för alla celler. (B) Gating att välja för singlets baserat på FSC-H vs. FSC-W och (C) SSC-H vs. SSC-W. D) Grind för DAPI-negativa celler för att utesluta döda celler. (E) Gating för Fluozin-3-AM^högaceller att välja för β-celler. F) Regleringsschema för MtPhagy-färgämne för att identifiera^högcelligaMtPhagy-populationer och lågcelliga MtPhagy-populationer. G) Regleringsschema för TMRE för att identifiera^{TMRE hög}- och TMRE-lågcellpopulationer. (H) Kvadrantregleringsschema etablerat med obehandlade RFD-öar för att identifiera Fluozin^highMtPhagy^highTMRE^lowcells in quadrant 3 (Q3) som β-celler som genomgår mitofagi. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 2: Bedömning av mitofagiska flödesskillnader i mus-β-celler efter metabolisk stress med hjälp av MtPhagy gating-schemat. Representativa flödescytometridiagram för (A) obehandlade RFD β-celler, (B) obehandlade HFD β-celler, (C) valinomycin-exponerade RFD β-celler och (D) valinomycin-exponerade HFD β-celler. (E) Kvantifiering av mitofagiskt flöde i β-celler, beräknat med hjälp av ett förhållande mellan MtPhagy^höga^TMRE-låga celler som exponerats för valinomycin och MtPhagy^höga^TMRE-låga celler som inte exponerats för valinomycin, för både RFD- och HFD-prover. *p < 0,05 vid Students oparade t-test. n = 3/grupp. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 3: Grindschema för mt-Keima-metoden och jämförelse mellan de båda metoderna. (A) Flödesdiagram som visar grindschema att välja för alla celler. (B) Gating att välja för singlets baserat på FSC-H vs. FSC-W och (C) SSC-H vs. SSC-W. D) Grind för DAPI-negativa celler för att utesluta döda celler. (E) Gating för Fluozin-3-AM^högaceller att välja för β-celler. (F) Representativa flödescytometridiagram för mt-Keima/+ obehandlade celler och (G) mt-Keima/+ valinomycin-exponerade celler. H) Kvantifiering av mitofagiflödet i β-celler från RFD-matade möss, beräknat med hjälp av förhållandet mellan de sura/neutrala celler som exponerats för valinomycin och förhållandet mellan de sura/neutrala celler som inte exponerats för valinomycin med hjälp av mt-Keima-metoden och jämfört med MtFagy-metoden (data för MtFagy-protokollet visas ursprungligen i figur 2E). n = 3/grupp. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Detta protokoll beskrev två komplementära metoder för att kvantifiera mitofagiskt flöde i dissocierade primära musöar. Med hjälp av mt-Keima-metoden kvantifierades en ökning av mitofagi som en ökad kvot av sura (561 nm) / neutrala (405 nm) celler, medan i MtPhagy-metoden kvantifierades ökat mitofagiflöde som en ökning i Fluozin^highMtPhagy^highTMRE^lowcell population. Dessa metoder möjliggör snabba, kvantitativa och β-cellspecifika bedömningar av mitofagiflödet.

Båda metoderna är enkla tillvägagångssätt. Vissa steg i detta protokoll är dock avgörande för att uppnå kvalitet och reproducerbara resultat. Dessa steg inkluderar: (1) korrekt ö-dissociation för att erhålla en encellssuspension, men tillräckligt mild för att säkerställa ö-livskraft, (2) noggrann etablering av gating för att korrekt identifiera populationer av intresse, och (3) objektiv kvantifiering av flödescytometridata via mjukvaruverktyg för att säkerställa en opartisk bedömning av mitofagiflöde.

Vid val av vilken metod som ska användas bör hänsyn tas till celltypen och arten av de genetiska modeller som används. mt-Keima-metoden, som antingen används in vivo eller transfekteras in vitro, är en mycket citerad och välrenommerad metod för mitofagibedömning genom flödescytometri eller avbildning av levande celler²¹. Även om den färgämnesbaserade MtPhagy-metoden är ett nyare tillvägagångssätt jämfört med genetiska rapportörer, finns det fall då dess användning kan föredras framför mt-Keima. Faktum är att MtPhagy-metoden övervinner behovet av transfektion eller komplexa avelssystem, och MtPhagy-färgning tar bara 30 minuter och utförs omedelbart före flödescytometri. MtPhagy-metoden kan också med framgång användas i prover från små och medelstora mänskliga öar. Detta protokoll, som förlitar sig på antingen pH-känsliga mitokondriella färgämnen eller sonder för att direkt mäta mitofagi, skiljer sig från ett tidigare tillvägagångssätt från Mauro-Lizcano et. al som använde det membranpotentialkänsliga MitoTracker Deep Red-färgämnet och krävde användning av mitofagi och lysosomala hämmare för att kvantifiera mitofagiskt flöde genom flödescytometri²². Som Mauro-Lizcano et. Metoden har inte testats på holmar är det svårt att direkt jämföra den med effekten av de MtPhagy eller mt-Keima-metoder som beskrivs här. Sammantaget ger kombinationen av dessa metoder ett ökande antal alternativ för att noggrant bedöma mitofagiflödet i mycket kvantitativa levande encellsanalyser.

En nackdel med båda metoderna är att de är oförenliga med cellfixering. Även om båda metoderna är kompatibla med avbildningsmetoder för levande celler, interfererar cellfixering med pH-gradienten för både MtPhagy och mt-Keima över det lysosomala membranet ^7,16. Som ett alternativ har användning av mitoQC-mitofagireportern i fasta prover tidigare använts⁷. Dessutom är en begränsning för båda metoderna behovet av att dissociera öar före flödescytometri, vilket kan påverka cellviabiliteten. Därför är det viktigt att färga celler med DAPI för att övervaka cellviabiliteten efter ö-dissociation och se till att alla prover behandlas konsekvent. Efter DAPI-färgning hade proverna i genomsnitt 12,7 % ± 7,4 döda celler (figur 1D), vilket indikerar att >80 % av cellerna i varje prov kunde användas för analys. Övervakning av cellviabilitet i varje steg (efter isolering av öar, odling och sedan dissociation) kan dessutom vara användbart för att få kunskap om cellöverlevnad vid varje steg i proceduren. Variabilitet i tidpunkt mellan öisolering och encellsdissociation kan också påverka cellviabilitet och resultat. Därför rekommenderas det att vara konsekvent med timing i alla experiment.

Eftersom mitokondriell kvalitetskontroll är avgörande för β-cells hälsa och funktion, kan rigorösa bedömningar av mitofagi med hjälp av traditionella biokemiska eller avbildningsmetoder (inklusive omsättning av mitokondriella yttre membranproteiner, mitokondriell lokalisering till autofagosomer eller lysosomer och elektronmikroskopi) visa sig vara utmanande och tidskrävande. Därför är utvecklingen av effektiva och robusta mitofagiska reportersystem avgörande. Både mt-Keima- och MtPhagy-metoden är effektiva och möjliggör kvantitativa bedömningar av mitofagiflödet. Dessa två tekniker möjliggör både flexibilitet och precision när det gäller att ta itu med β-cells mitokondriell kvalitetskontroll och sondering av interaktioner mellan organeller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

SAS har erhållit anslagsfinansiering från Ono Pharmaceutical Co., Ltd. och är konsult för Novo Nordisk.

Acknowledgments

E.L-D. Parlamentet erkänner stöd från NIH (T32-AI007413 och T32-AG000114). SAS bekräftar stöd från JDRF (COE-2019-861), NIH (R01 DK135268, R01 DK108921, R01 DK135032, R01 DK136547, U01 DK127747), Department of Veterans Affairs (I01 BX004444), familjen Brehm och familjen Anthony.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibiotic-Antimycotic	Life Technologies	15240-062
Attune NxT Flow Cytometer	Thermofisher Scientific	A24858
Dimethyl Sulfoxide	Sigma-Aldrich	317275
Fatty Acid Free heat shock BSA powder	Equitech	BAH66
Fetal bovine serum	Gemini Bio	900-108
Fluozin-3AM	Thermofisher Scientific	F24195	100 μg Fluozin-3AM powder reconstituted in 51 μL DMSO and 51 μL Pluronic F-127 to reach 1 mM stock.
Gibco RPMI 1640 Medium	Fisher Scientific	11-875-093
HEPES (1M)	Life Technologies	15630-080
MtPhagy dye	Dojindo	MT02-10	5 μg MtPhagy powder reconstituted with 50 μL DMSO to reach 100 μM stock.
MtPhagy dye	Dojindo	MT02-10
Penicillin-Streptomycin (100x)	Life Technologies	15140-122	1x Solution used in procotol by diluting 1:10 in ddH₂O
Phosphate buffered saline, 10x	Fisher Scientific	BP399-20	1x Solution used in procotol by diluting 1:10 in ddH₂O
Sodium Pyruvate (100x)	Life Technologies	11360-070	5 μg MtPhagy powder reconstituted with 50 μL DMSO to reach 100 μM stock.
TMRE [Tetramethylrhodamine, ethyl ester, perchlorate]	Anaspec	AS-88061	TMRE powder reconstituted in DMSO to reach 100 μM stock.
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Thermofisher Scientific	25300054
Valinomycin	Sigma	V0627	Valinomycin powder reconsituted in DMSO to reach 250 nM stock.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

Kaufman, B. A., Li, C., Soleimanpour, S. A. Mitochondrial regulation of β-cell function: maintaining the momentum for insulin release. Molecular Aspects of Medicine. 42, 91-104 (2015).
Soleimanpour, S. A., et al. The diabetes susceptibility gene Clec16a regulates mitophagy. Cell. 157 (7), 1577-1590 (2014).
Pearson, G., et al. Clec16a, Nrdp1, and USP8 form a ubiquitin-dependent tripartite complex that regulates β-cell mitophagy. Diabetes. 67 (2), 265-277 (2018).
Hattori, N., Saiki, S., Imai, Y. Regulation by mitophagy. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 53, 147-150 (2014).
Berezhnov, A. V., et al. Intracellular pH modulates autophagy and mitophagy. Journal of Biological Chemistry. 291 (16), 8701-8708 (2016).
Sun, N., et al. Measuring in vivo mitophagy. Molecular Cell. 60 (4), 685-696 (2015).
McWilliams, T. G., et al. mito-QC illuminates mitophagy and mitochondrial architecture in vivo. Journal of Cell Biology. 214 (3), 333-345 (2016).
Aoyagi, K., et al. A new beta cell-specific mitophagy reporter mouse shows that metabolic stress leads to accumulation of dysfunctional mitochondria despite increased mitophagy. Diabetologia. 66 (1), 147-162 (2023).
Ma, X., Ding, W. X. A fluorescence imaging based-assay to monitor mitophagy in cultured hepatocytes and mouse liver. Liver Research. 5 (1), 16-20 (2021).
Sidarala, V., et al. Mitophagy protects β cells from inflammatory damage in diabetes. JCI Insight. 5 (24), 141138 (2020).
Gingerich, M. A., et al. An intrinsically disordered protein region encoded by the human disease gene CLEC16A regulates mitophagy. Autophagy. 19 (2), 525-543 (2023).
Sun, N., Malide, D., Liu, J., Rovira, I. I., Combs, C. A., Finkel, T. A fluorescence-based imaging method to measure in vitro and in vivo mitophagy using mt-Keima. Nature Protocols. 12 (8), 1576-1587 (2017).
Zhao, J., Bertoglio, B. A., Gee, K. R., Kay, A. R. The zinc indicator FluoZin-3 is not perturbed significantly by physiological levels of calcium or magnesium. Cell Calcium. 44 (4), 422-426 (2008).
Da Silva Xavier, G. The Cells of the Islets of Langerhans. Journal of Clinical Medicine. 7 (3), 54 (2018).
Thapa, B., et al. Imaging β-cell function using a zinc-responsive MRI contrast agent may identify first responder islets. Frontiers in Endocrinology. 12, 809867 (2022).
Iwashita, H., et al. Live cell imaging of mitochondrial autophagy with a novel fluorescent small molecule. ACS Chemical Biology. 12 (10), 2546-2551 (2017).
Crowley, L. C., Christensen, M. E., Waterhouse, N. J. Measuring mitochondrial transmembrane potential by TMRE staining. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (12), 087361 (2016).
Klein, B., Wörndl, K., Lütz-Meindl, U., Kerschbaum, H. H. Perturbation of intracellular K(+) homeostasis with valinomycin promotes cell death by mitochondrial swelling and autophagic processes. Apoptosis. 16 (11), 1101-1117 (2011).
Ji, Y., et al. Toll-like receptors TLR2 and TLR4 block the replication of pancreatic β cells in diet-induced obesity. Nature Immunology. 20 (6), 677-686 (2019).
Sauvat, A., et al. Quantification of cellular viability by automated microscopy and flow cytometry. Oncotarget. 6 (11), 9467-9475 (2015).
Liu, Y. T., et al. Mt-Keima detects PINK1-PRKN mitophagy in vivo with greater sensitivity than mito-QC. Autophagy. 17 (11), 3753-3762 (2021).
Mauro-Lizcano, M., et al. New method to assess mitophagy flux by flow cytometry. Autophagy. 11 (5), 833-843 (2015).

Biology

Kompletterande metoder för att undersöka mitofagiskt flöde i bukspottkörtelns β-celler

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.