Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Pankreas β Hücrelerinde Mitofaji Akısını Sorgulamak İçin Tamamlayıcı Yaklaşımlar

Published: September 15, 2023 doi: 10.3791/65789
Automatic Translation
1,2, 1, 1,3,4
1Department of Internal Medicine, Division of Metabolism, Endocrinology and Diabetes, University of Michigan, Ann Arbor, 2Graduate Program in Immunology, University of Michigan Medical School, 3Department of Molecular and Integrative Physiology, University of Michigan, Ann Arbor, 4VA Ann Arbor Healthcare System

Summary

Bu protokol, pankreas β hücrelerinde mitofajinin kantitatif analizi için iki yöntemi özetlemektedir: birincisi, hücre geçirgen mitokondriye özgü boyaların bir kombinasyonu ve ikincisi, genetik olarak kodlanmış bir mitofaji raporlayıcısı. Bu iki teknik tamamlayıcıdır ve belirli ihtiyaçlara göre konuşlandırılabilir, bu da mitokondriyal kalite kontrolünün nicel olarak ele alınmasında esneklik ve kesinlik sağlar.

Abstract

Mitofaji, optimal mitokondriyal fonksiyonu sürdürmek için gerekli bir kalite kontrol mekanizmasıdır. Disfonksiyonel β hücreli mitofaji, yetersiz insülin salınımına neden olur. Mitofajinin gelişmiş kantitatif değerlendirmeleri genellikle genetik raportörlerin kullanılmasını gerektirir. Akış sitometrisi yoluyla mitofajiyi ölçmek için mitokondri hedefli pH'a duyarlı çift uyarma oranı metrik probunu ifade eden mt-Keima fare modeli, β hücrelerde optimize edilmiştir. Asidik-nötr mt-Keima dalga boyu emisyonlarının oranı, mitofajiyi sağlam bir şekilde ölçmek için kullanılabilir. Bununla birlikte, karmaşık genetik fare modelleri veya birincil insan adacıkları gibi transfekte edilmesi zor hücrelerle çalışırken genetik mitofaji raportörlerini kullanmak zor olabilir. Bu protokol, MtFagy kullanarak birincil adacıklarda β hücreli mitofajiyi ölçmek için yeni bir tamamlayıcı boya bazlı yöntemi açıklar. MtFagy, mitokondride biriken ve mitofaji sırasında lizozomlar gibi mitokondri düşük pH'lı ortamlarda olduğunda floresan yoğunluğunu artıran, pH'a duyarlı, hücre geçirgen bir boyadır. MtFagy boyasını, β hücrelerini seçen bir Zn2+ göstergesi olan Fluozin-3-ve mitokondriyal membran potansiyelini değerlendirmek için Tetrametilrodamin, etil ester (TMRE) ile birleştirerek, mitofaji akısı, akış sitometrisi yoluyla β hücrelerde spesifik olarak ölçülebilir. Bu iki yaklaşım oldukça tamamlayıcıdır ve çok sayıda β hücreli modelde mitokondriyal kalite kontrolünün değerlendirilmesinde esneklik ve kesinlik sağlar.

Introduction

Pankreas β hücreleri, metabolik talepleri karşılamak için insülin üretir ve salgılar ve β hücre disfonksiyonu, hem tip 1 hem de tip 2 diyabette hiperglisemi ve diyabet başlangıcından sorumludur. β-Hücreler, fonksiyonel mitokondriyal kütlerezervine bağlı olan mitokondriyal enerji ve metabolik çıktı yoluyla glikoz metabolizmasını insülin sekresyonu ile birleştirir 1,2,3. Optimal β hücre fonksiyonunu sürdürmek için, β hücreleri, yaşlı veya hasarlı mitokondriyi uzaklaştırmak ve fonksiyonel mitokondriyal kütleyi korumak için mitokondriyal kalite kontrol mekanizmalarına güvenir4. Mitofaji olarak da bilinen seçici mitokondriyal otofaji, mitokondriyal kalite kontrol yolunun önemli bir bileşenidir.

Canlı hücrelerde mitofaji değerlendirmeleri genellikle mitofaji sırasında meydana gelen mitokondriyal pH'daki değişikliklere dayanır. Mitokondri hafif alkali bir pH'a sahiptir ve sağlıklı mitokondri normalde pH-nötr sitozolde bulunur. Mitofaji sırasında, hasarlı veya işlevsiz mitokondri seçici olarak otofagozomlara dahil edilir ve sonunda asidik lizozomlar5 içinde temizlenir. mt-Keima6, mitoQC7 ve CMMR8 gibi birkaç in vivo transgenik mitofaji raportör fare modelinin yanı sıra Cox8-EGFP-mCherry plazmid9 gibi transfekte edilebilir mitofaji probları, mitofajinin kantitatif değerlendirmelerini sağlamak için bu pH değişimini kullanır. mt-Keima pH'a duyarlı çift uyarma oranı metrik probunu eksprese eden transgenik farelerin kullanımı, akış sitometrisi10,11 yoluyla adacıklarda ve β hücrelerinde mitofaji değerlendirmeleri için optimize edilmiştir. Asidik-nötr mt-Keima dalga boyu emisyonlarının oranı (asidik 561 nm'nin nötr 480 nm uyarıma oranı) mitofajiyi 6,12 sağlam bir şekilde ölçmek için kullanılabilir.

Bu protokol, mt-Keima transgenik farelerinden izole edilen primer adacıklarda ve β hücrelerinde mitofaji akısını değerlendirmek için optimize edilmiş bir yaklaşımı açıklar10,11. mt-Keima oldukça hassas bir prob olsa da, ya karmaşık hayvan yetiştirme şemaları ya da hücrelerin transfeksiyonunu gerektirir, bu da diğer genetik modellerle veya birincil insan adacıklarıyla birlikte çalışırken genellikle zor olabilir. Ek olarak, nötr ve asidik hücre popülasyonlarını tanımlamak için çoklu floresan lazerlerin ve dedektörlerin kullanılması, diğer floresan raportörlerin kombinatoryal kullanımını sınırlayabilir.

Bu zorlukların üstesinden gelmek için, bu protokol aynı zamanda izole fare adacıklarından β hücrelerinde mitofajinin sağlam tespiti için tamamlayıcı, tek floresan kanallı, boya bazlı bir yöntemi de açıklar. MtFagy yöntemi olarak adlandırılan bu yaklaşım, β hücrelerini seçmek, aktif olarak mitofaji geçiren hücre popülasyonlarını ölçmek ve aynı anda mitokondriyal membran potansiyelini (MMP veya Δψm) değerlendirmek için üç hücre geçirgen boyanın bir kombinasyonunu kullanır.

Bu boyalardan ilki, Ex/Em 494/516 nm13'e sahip hücre geçirgen bir Zn2+ göstergesi olan Fluozin-3-'dir. Fare adacıkları, α, β, δ- ve PP hücreleri dahil olmak üzere işlevsel olarak farklı hücrelerden oluşan heterojen bir popülasyon içerir. β-Hücreleri, fare adacığı içindeki hücrelerin yaklaşık% 80'ini oluşturur ve insülin granülleri14,15 içindeki yüksek Zn2+ konsantrasyonları nedeniyle diğer adacık hücre tiplerinden ayırt edilebilir, bu da β hücrelerinin Fluozin-3-yüksek popülasyonu olarak tanımlanmasına izin verir. Kimyasal bir bağ yoluyla mitokondri üzerinde hareketsiz hale getirilen ve zayıf floresan yayan pH'a duyarlı bir boya olan MtPhagy boyası da bu protokoldekullanılmaktadır 16. Mitofaji indüksiyonu üzerine, hasarlı mitokondri asidik lizozoma dahil edilir ve MtFagy boyası, düşük pH ortamında (Ex/Em 561/570-700 nm) floresan yoğunluğunu arttırır.

Ek olarak, MMP'yi değerlendirmek için Tetrametilrodamin, etil ester (TMRE) kullanılır. TMRE, membran potansiyeli 17 tarafından desteklenen nispi negatif yük nedeniyle sağlıklı mitokondri tarafından tutulan, hücre geçirgen pozitif yüklü bir boyadır (Ex/Em552/575 nm). Hasarlı veya sağlıksız mitokondri, membran potansiyellerini dağıtır ve bu da TMRE'yi ayırma yeteneğinin azalmasına neden olur. Bu boyalar birlikte kullanıldığında, mitofajiye uğrayan β hücreleri, akış sitometrisi yoluyla FluozinyüksekMtFajiyüksekTMREdüşük popülasyonu olarak tanımlanabilir. Mitofaji statik bir süreçten ziyade dinamik bir süreç olduğundan, bu protokol, MMP18'in dağılmasını takiben mitofajiyi indükleyen bir K+-iyonofor olan valinomisin kullanılarak mitofaji akısını değerlendirmek için optimize edilmiştir. Valinomisin varlığında ve yokluğunda mitofajinin karşılaştırılması, farklı örneklem gruplarında mitofaji akısının değerlendirilmesine olanak tanır.

Mevcut yaklaşımın boya bazlı doğası, insan adacıklarına ve diğer transfekte edilmesi zor hücre tiplerine tahmin edilmesine izin verir ve mt-Keima protokolünün aksine karmaşık hayvan yetiştirme şemalarına olan ihtiyacı ortadan kaldırır. Bu protokolün genel amacı, iki bağımsız akış sitometrisi tabanlı yöntemle tek hücre düzeyinde β hücrelerde mitofajiyi ölçmektir. Birlikte ele alındığında, bu protokol, mitokondriyal kalite kontrolünün kantitatif çalışmasında hem kesinlik hem de esneklik sağlayan iki güçlü ve tamamlayıcı yöntemi açıklar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bu protokolde sunulan hayvan çalışmaları, Michigan Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır. Bu çalışma için 15 haftalık düzenli yağ diyeti (RFD) veya yüksek yağlı diyet (HFD) kullanan yirmi haftalık erkek C57BL / 6J fareleri kullanıldı.

1. Boya bazlı MtFagy yaklaşımı ile mitofajinin değerlendirilmesi (Yöntem 1)

  1. Fare adacığı hazırlama ve tedavi
    1. Aşağıdaki adımları izleyerek adacık kültürü ve valinomisin maruziyetini gerçekleştirin.
      1. Daha önce açıklanan yöntemleri izleyerek düzenli yağ diyeti (RFD) veya yüksek yağlı diyet (HFD,% 60 kcal%Yağ 19) farelerinden adacıkları izole edin 2,10.
      2. 100 ünite/mL antimikotik-antibiyotik, 50 ünite/mL penisilin-streptomisin, 1 mM sodyum piruvat, 10 mM HEPES ve %10 fetal sığır serumu (FBS) ile takviye edilmiş RPMI ortamında gece boyunca 37 °C'de kültür adacık örnekleri (bkz. Bu ortam "adacık ortamı" olarak anılacaktır.
      3. Bir pipet kullanarak, 2 mL adacık ortamında 6 cm'lik Petri kaplarına koşul başına 100 adacık seçin.
        NOT: Bu protokol için kullanılan koşullar: (1) Boyanmamış kontrol: boyanmamış RFD adacıkları; (2) Yalnızca DAPI kontrolü: DAPI ile boyanmış RFD adacıkları; (3) Fluozin-3-sadece kontrol: Fluozin-3-ile boyanmış RFD adacıkları; (4) Sadece MtFaji kontrolü: MtFaji ile boyanmış RFD adacıkları; (5) Sadece TMRE kontrolü: TMRE ile boyanmış RFD adacıkları; (6) RFD işlenmemiş: MtFaji, TMRE, Fluozin-3-ve DAPI ile boyanmış RFD adacıkları; (7) Valinomisine maruz kalan RFD adacıkları: Valinomisine maruz kalan ve MtFaji, TMRE, Fluozin-3-ve DAPI ile boyanmış RFD adacıkları; (8) HFD işlenmemiş: MtFaji, TMRE, Fluozin-3-ve DAPI ile boyanmış HFD adacıkları; (9) Valinomisine maruz kalan HFD adacıkları: Valinomisine maruz kalan ve MtFaji, TMRE, Fluozin-3-ve DAPI ile boyanmış HFD adacıkları.
      4. Valinomisin'e maruz kalan (7) ve (9) koşullar için (yukarıdaki NOT'a bakınız), mitofajiyi indüklemek için Petri kabındaki adacıklara 3 saat boyunca 2 μL 250 nΜ valinomisin stoğu (Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin.
    2. Tek hücre ayrışması gerçekleştirin.
      1. 3 saat valinomisin maruziyetinden sonra, bir pipet kullanarak her koşuldan 100 adacığı ayrı mikrosantrifüj tüplerine seçin.
      2. Adacıkları 10 °C'de 1 dakika boyunca 350 x g'da döndürün ve süpernatanı bir pipet kullanarak atın.
      3. Numuneleri 2 kez 1 mL 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ile, her yıkama arasında sıkma adımlarıyla (350 x g / 1 dk, 10 ° C) yıkayın. Her yıkamadan sonra süpernatanı bir pipetle atın.
      4. Adacıkları tek hücrelere ayırmak için, adacıkların aşırı sindirimini önlemek için bir numunenin mikrosantrifüj tüpüne 500 μL% 0.05 tripsin (önceden 37 ° C'ye ısıtılmış) ekleyin. Adacıklar gözle görülür şekilde dağılana kadar tekrar tekrar yukarı ve aşağı pipetleyin.
      5. Tripsini nötralize etmek için hemen 1 mL önceden ısıtılmış adacık ortamı ekleyin. Her numune için tripsinizasyon ve nötralizasyonu teker teker tekrarlayın.
      6. Numuneleri 500 x g'da 10 °C'de 5 dakika döndürün. Süpernatanı bir pipetle çıkarın, peleti rahatsız etmemeye dikkat edin.
        NOT: Valinomisin'e maruz kalan numuneler için pelet hassas olacaktır.
      7. Numuneleri 2x RPMI ortamıyla, fenol kırmızısı olmadan, 100 birim / mL antimikotik-antibiyotik, 50 birim / mL penisilin-streptomisin, 1 mM sodyum piruvat, 10 mM HEPES ve% 10 sığır serum albümini (BSA) ile desteklenmiş yıkayın. Bu ortam "adacık akış ortamı" olarak anılacaktır. Her yıkama arasında sıkma adımlarını (350 x g/1 dk, 10 °C) ekleyin. Her yıkamadan sonra süpernatanı bir pipetle atın.
    3. Akış sitometrisine hazırlanmak için hücreleri MtFagy, TMRE, Fluozin-3-ve DAPI ile boyayın.
      1. Adacık numunelerini 500 μL adacık akış ortamında yeniden süspanse edin.
      2. MtPhagy boyası alan tüplere 0.25 μL 100 μM MtFaji stoğu ekleyin (Malzeme Tablosuna bakın) (koşullar 4, 6, 7, 8 ve 9, adım 1.1.1'e NOT).
      3. TMRE boyası alan tüplere 0.25 μL 100 μM TMRE stoğu ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız) (koşullar 5, 6, 7, 8 ve 9).
      4. Fluozin-3-boyası alan tüplere (koşullar 3, 6, 7, 8 ve 9) 0.25 μL 1 mM Fluozin-3-stoğu ( Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin.
      5. Vorteks tüpleri 5 saniye boyunca düşük hızda karıştırın.
      6. Işıktan korumak için mikrosantrifüj tüplerini alüminyum folyoya sarın ve 37 °C'de 30 dakika inkübe edin. İnkübasyonun yarısında, vorteks tüplerini 5-10 saniye boyunca düşük hızda karıştırın.
      7. İnkübasyondan sonra, numuneleri 10 °C'de 1 dakika boyunca 350 x g'da santrifüjleyin. Bir pipet kullanarak süpernatanı atın.
      8. Numuneleri 500 μL adacık akış ortamında yeniden süspanse edin. 2, 6, 7, 8 ve 9 koşullarına 0,2 μg/mL DAPI (Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin.
      9. Numuneleri 350 x g'da 10 °C'de 1 dakika döndürün. Bir pipet kullanarak süpernatanı atın ve 500 μL adacık akış ortamında yeniden süspanse edin.
      10. Numuneleri buzun üzerine yerleştirin.
  2. Akış sitometrisi
    1. Cihazı başlatın (Malzeme Tablosuna bakın).
      NOT: Uygun filtrelere sahip herhangi bir akış sitometresi çalışacaktır. Bu çalışmada aşağıdaki filtreler kullanılmıştır: (1) DAPI için VL1: Uyarma/Emisyon - 405 nm/440 nm (50 nm); (2) Fluozin-3-için BL1: Uyarma / Emisyon - 488 nm / 530 nm (30 nm); (3) MtFagy boyası için BL2: Uyarma/Emisyon - 488 nm/590 nm (40 nm); (4) TMRE için YL1: Uyarma/Emisyon - 561 nm/585 nm (16 nm).
    2. Hücre popülasyonlarının dağılım grafiğinin merkezinde olduğundan emin olmak için ileri (FSC) ve yan saçılma (SSC) voltajlarını ayarlayın. Bu protokol için kullanılan voltajlar, hücrelerin FSC-A vs. içinde eşit şekilde düşmesini sağlamak için FSC için 120 V ve SSC için 260 V idi. SSC-A grafiği (Şekil 1A).
    3. Tek olmayan hücreleri hariç tutmak için, FSC-H vs. FSC-W ve ardından SSC-H vs. SSC-W (Şekil 1B,C).
    4. Canlı β hücrelerini filtrelemek için DAPI'nin voltajlarını ve kompanzasyonunu ayarlayın. Boyanmamış RFD örneğine dayalı olarak kullanılan her florofor için floresan kapıları ayarlayın (Şekil 1D-F).
      NOT: Her kanal için kullanılan voltajlar: (1) VL1: 320-360 V; (2) BL1: 300-340 V; (3) BL2: 260-300 V; (4) YL1: 300-340 V.
    5. Geçitler oluşturulduktan sonra örnek başına 10.000 olay toplayın.
      NOT: Bu geçit yaklaşımı kullanılarak, hem RFD hem de HFD adacıklarında bazal koşullar altında ve valinomisin indüksiyonu üzerine mitofaji seviyeleri değerlendirildi (Şekil 2).
    6. Analiz için verileri FCS dosyaları olarak kaydedin.

2. Genetik olarak kodlanmış mt-Keima raportörü kullanılarak mitofajinin değerlendirilmesi (Yöntem 2)

  1. Fare adacık hazırlığı ve tek hücreli ayrışma
    1. Aşağıdaki adımları izleyerek adacık kültürü ve valinomisin maruziyetini gerçekleştirin.
      1. Pankreas adacıklarını vahşi tip (WT) ve mt-Keima/+ (mt-Keima) farelerinden izole edin6. Bu yöntemde 20 haftalık erkek WT veya mt-Keima/+ ile beslenen RFD fareler kullanıldı.
      2. Kültür adacık örnekleri, adacık ortamında 37 °C'de gece boyunca alınır.
      3. Bir pipet kullanarak, 2 mL adacık ortamı olan 6 cm'lik Petri kaplarına koşul başına 100 adacık seçin.
        NOT: Bu protokol için kullanılan koşullar: (1) Boyanmamış kontrol: Boyanmamış WT adacıkları; (2) Yalnızca DAPI kontrolü: DAPI ile boyanmış WT adacıkları; (3) Fluozin-3-sadece kontrol: Fluozin-3-ile boyanmış WT adacıkları; (4) mt-Keima sadece kontrol: Boyanmamış mt-Keima/+ adacıkları; (5) Tedavi edilmemiş: Fluozin-3-ve DAPI ile boyanmış mt-Keima/+ adacıkları; (6) Valinomisin: mt-Keima/+ valinomisine maruz kalan ve Fluozin-3-ve DAPI ile boyanmış adacıklar.
      4. Valinomisin maruziyeti olan durum (6) için, mitofajiyi indüklemek için Petri kabındaki adacıklara 3 saat boyunca 2 μL 250 nM valinomisin stoğu ekleyin.
    2. Tek hücreli ayrışma gerçekleştirin.
      1. Adım 1.1.2'de açıklandığı gibi tek hücreli ayrışma adımlarını gerçekleştirin.
    3. Hücreleri Fluozin-3-ve DAPI ile boyayın.
      1. Adacık numunelerini 500 μL adacık akış ortamında yeniden süspanse edin.
      2. Fluozin-3-boyası alan tüplere 0,25 μL 1 mM Fluozin-3-stoğu ekleyin (koşullar 3, 5 ve 6).
      3. Hücreleri 37 ° C'de inkübe edin ve 1.1.3.5-1.3.10 adımlarında açıklandığı gibi DAPI tedavisine devam edin.
  2. Akış sitometrisi
    1. Enstrümanı başlatın. Uygun filtrelere sahip herhangi bir akış sitometresi çalışacaktır.
      NOT: Bu çalışmada aşağıdaki filtreler kullanılmıştır: (1) DAPI için VL1: Uyarma/Emisyon - 405 nm/440 nm (50 nm); (2) Fluozin-3-için BL1: Uyarma / Emisyon - 488 nm / 530 nm (30 nm); (3) mt-Keima nötr için VL3: Uyarma/Emisyon - 405 nm/603 nm (48 nm); (4) mt-Keima asidi için YL2: Uyarma / Emisyon - 561 nm / 620 nm (15 nm).
    2. FSC ve SSC voltajlarını ayarlayın ve 1.2.2-1.2.3 adımlarında açıklandığı gibi tek olmayan hücreleri hariç tutun (Şekil 3A-C).
    3. Floresan pozitif hücre popülasyonlarının boyanmamış hücrelerden ayırt edilebilmesini sağlamak için boyanmamış ve tek pozitif kontroller (koşullar 1-4) kullanarak DAPI, Fluozin-3-ve mt-Keima için voltajları ve kompanzasyonları ayarlayın. Her kanala uygun kompanzasyon uygulandıktan sonra, canlı β hücrelerini filtrelemek için DAPI negatif kapısı ve Fluozin-3-pozitif kapıları ayarlayın (Şekil 3D-E).
    4. Asidik ve nötr hücre popülasyonlarını tanımlamak için mt-Keima pozitif örneğini (koşul 4) kullanarak bir üçgen geçit şeması oluşturun (Şekil 3F).
      NOT: CilttagHer kanal için tipik olarak kullanılır: (1) VL1: 320-340 V; (2) BL2: 260-280 V; (3) VL3: 280-300 V; (4) YL2: 280-300 V.
    5. Geçitler oluşturulduktan sonra örnek başına 10.000 olay toplayın. Koşullar 5 ve 6 için geçit şemaları Şekil 3A-G'de gösterilmiştir.
    6. Analiz için verileri FCS dosyaları olarak kaydedin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Boya bazlı MtFagy yaklaşımı ile mitofajinin değerlendirilmesi
Bu boya bazlı yaklaşım, ölü hücreleri dışlamak için DAPI'nin yanı sıra Fluozin-3-, TMRE ve MtPhagy kullanılarak, genetik bir raportöre ihtiyaç duymadan birincil fare β hücrelerindeki mitofaji akışını analiz etmek için optimize edilmiştir. Bu protokol, mitofajiyi indüklemek için bu boyaları valinomisin ile eşleştirerek, birincil fare β hücrelerinde mitofaji akısını seçici olarak ölçmek için boya bazlı bir yöntemi ana hatlarıyla belirtir18. Bu MtFagy yöntemi kullanılarak gösterilen veriler için, metabolik stresin mitofaji akısı üzerindeki etkisini değerlendirmek için düzenli yağ diyeti (RFD) veya yüksek yağlı diyetten (HFD,% 60 kcal% Yağ) izole edilen adacıklarda hem bazal hem de valinomisin kaynaklı mitofaji analiz edildi. İlgilenilen popülasyonu tanımlamak için, hücreler işlenmemiş RFD adacıkları kullanılarak kapılandı. FSC ve SSC voltajları ilk olarak bir SSC-A ve FSC-A grafiği üzerinde hücrelerin eşit dağılımını elde etmek için ayarlandı (Şekil 1A). Tek hücreleri seçmek için, hem FSC-H hem de FSC-W ve SSC-H ile karşılaştırıldığında. Tek hücrelere kıyasla daha yüksek genişlik sinyal değerleri nedeniyle çoğulların hariç tutulduğu SSC-W grafikleri kullanıldı (Şekil 1B,C). Daha sonra, ölü hücreleri20 dışlamak için DAPI-negatif hücreler seçildi (Şekil 1D). Birincil kapılar kurulduktan sonra, Fluozin-3-, MtFaji ve TMRE (Şekil 1E-G) için floresan kapıları ve çok renkli floresan akış sitometrisi için kompanzasyon kontrolleri oluşturmak için tek lekeli kontroller kullanıldı.

Bu primer ve floresan kapılar kurulduktan sonra, mitofaji kullanımı yüksek olan β hücreleri, valinomisin maruziyeti olmadan RFD kullanılarak kadran 3'te (Q3) FluozinyüksekMtFajiyüksekTMREdüşük popülasyonu olarak tanımlandı (Şekil 1H). Bu geçit stratejisi kullanılarak, hem RFD hem de HFD adacıklarında bazal ve valinomisin ile indüklenen mitofaji seviyeleri karakterize edildi (Şekil 2). Mitofaji akısını ölçmek için, bazal vs. Valinomisin ile indüklenen mitofaji düzeyleri aşağıdaki oran kullanılarak karşılaştırıldı:

Equation 1

Bu oran kullanılarak, mitofaji akısı ölçüldü ve RFD ile karşılaştırıldı. Obezite ve periferik insülin direncinin indüksiyonunu takiben mitofajideki farklılıkları değerlendirmek için HFD β hücreleri. RFD'de mitofaji akısının ölçülmesi vs. HFD örnekleri Şekil 2E'de gösterilmektedir. Bu sonuç, basit bir boya bazlı yaklaşım kullanarak β hücrelerinde mitofajiyi ölçmek için bu testin fizibilitesini vurgulamaktadır. Bu yöntem aynı zamanda insan adacıklarında, transfekte edilmesi zor hücrelerde ve mt-Keima transgenik modeline geçişin hantal olacağı karmaşık genetik modellerden izole edilen adacıklarda da kullanılabilir.

Genetik olarak kodlanmış mt-Keima raportörü kullanılarak mitofajinin değerlendirilmesi
Mt-Keima, iç mitokondriyal membrana hedeflenmesini sağlayan bir Cox8 lokalizasyon dizisi ile kaynaşmış bir çift uyarma floresan proteinidir. mt-Keima'nın çift modlu floresan özelliği, hücre içi bölmenin6 pH'ına bağlı olarak uyarma spektrumlarını nötrden (405 nm) asidik (561 nm) dalga boyuna geçirmesine izin verir. Bu, asidik-nötr oranındaki bir artışın mitofaji indüksiyonunu gösterdiği mitofajinin sağlam bir oransal floresan analizini sağlar. Bu protokolde, akış sitometrisi yoluyla β hücrelerini seçmek için Fluozin-3-de kullanıldı. Bu temsili çalışmalarda, mitofaji akısı, RFD diyeti ile beslenen farelerden izole edilen adacıklar kullanılarak değerlendirildi10,11. FSC ve SSC voltajları ilk olarak bir SSC-A vs. FSC-A grafiği (Şekil 3A). Tek hücreleri seçmek için, hem FSC-H hem de FSC-W ve SSC-H ile karşılaştırıldığında. Tek hücrelere kıyasla daha yüksek genişlik sinyal değerleri nedeniyle multipletlerin hariç tutulduğu SSC-W grafikleri kullanıldı (Şekil 3B,C). DAPI ve Fluozin-3-için voltaj ve geçit stratejisi, tek lekeli adacıklar kullanılarak belirlendi (Şekil 3D,E). Asidik ve nötr popülasyonlar için üçgen kapılar daha sonra valinomisin maruziyeti olmadan mt-Keima pozitif numunesi kullanılarak tanımlandı (Şekil 3F).

Bu primer ve floresan kapılar kurulduktan sonra, mt-Keima floresansında bazal ve valinomisin kaynaklı değişiklikler kullanılarak mitofaji akısı değerlendirildi (Şekil 3F, G). Mitofaji akısını ölçmek için, bazal mitofaji vs. Valinomisin ile indüklenen seviyeler aşağıdaki oran kullanılarak karşılaştırıldı:

Equation 2

Bu oran kullanılarak, RFD hücrelerinde mitofaji akısı ölçüldü. Bu sonucun niceliği Şekil 3H'de gösterilmiştir. Daha da önemlisi, bu sonuçlar MtPhagy yaklaşımı kullanılarak oluşturulan RFD adacıklarındaki sonuçlarla karşılaştırılabilir (Şekil 3H).

Figure 1
Şekil 1: MtPhagy yöntemi için geçit şeması. (A) Tüm hücreler için seçilecek geçit şemasını gösteren akış grafiği. (B) FSC-H vs. FSC-W ve (C) SSC-H ve SSC-W'yi seçin. (D) Ölü hücreleri dışlamak için DAPI negatif hücreler için geçit. (E) β hücreli için seçilecek Fluozin-3-yüksek hücreleri için geçit. (F) MtPhagyyüksek ve MtPhagydüşük hücre popülasyonlarını tanımlamak için MtPhagy boyası için geçit şeması. (G) TMREyüksek ve TMREdüşük hücre popülasyonlarını tanımlamak için TMRE için geçit şeması. (H) Çeyrek 3'teki (Q3) FluozinyüksekMtFajiyüksekTMREdüşük hücrelerini mitofajiye uğrayan β hücreler olarak tanımlamak için işlenmemiş RFD adacıkları ile oluşturulan çeyrek geçit şeması. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: MtPhagy geçit şeması kullanılarak metabolik stresi takiben fare β hücrelerindeki mitofaji akı farklılıklarının değerlendirilmesi. (A) tedavi edilmemiş RFD β hücreleri, (B) işlenmemiş HFD β hücreleri, (C) valinomisine maruz RFD β hücreleri ve (D) valinomisine maruz kalan HFD β hücrelerinin temsili akış sitometrisi grafikleri. (E) Hem RFD hem de HFD numuneleri için valinomisine maruz kalan MtFajiyüksekTMREdüşük hücrelerinin, valinomisine maruz kalmayan MtPhagyyüksekTMREdüşük hücrelerine oranı kullanılarak hesaplanan β hücrelerinde mitofaji akısının miktarının belirlenmesi. *p < 0.05 Student'ın eşleştirilmemiş t-testi ile. n = 3/grup. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: mt-Keima yöntemi için geçit şeması ve her iki yöntem arasındaki karşılaştırma. (A) Tüm hücreler için seçilecek geçit şemasını gösteren akış grafiği. (B) FSC-H vs. FSC-W ve (C) SSC-H ve SSC-W'yi seçin. (D) Ölü hücreleri dışlamak için DAPI negatif hücreler için geçit. (E) β hücreli için seçilecek Fluozin-3-yüksek hücreleri için geçit. (F) mt-Keima/+ işlenmemiş hücrelerin ve (G) mt-Keima/+ valinomisine maruz kalan hücrelerin temsili akış sitometrisi grafikleri. (H) RFD ile beslenen farelerden alınan β hücrelerinde mitofaji akısının miktarının belirlenmesi, valinomisine maruz kalan asidik / nötr hücrelerin mt-Keima yöntemi kullanılarak valinomisine maruz kalmayan asidik / nötr hücrelerin oranı kullanılarak hesaplanır ve MtPhagy yöntemiyle karşılaştırılır (orijinal olarak Şekil 2E'de gösterilen MtPhagy protokolü verileri). n = 3/grup. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu protokol, ayrışmış primer fare adacıklarında mitofaji akısını ölçmek için iki tamamlayıcı yöntemi tanımladı. Mt-Keima yöntemi kullanılarak, mitofajideki bir artış, asidik (561 nm) / nötr (405 nm) hücrelerin oranının artması olarak ölçülürken, MtFaji yönteminde, artan mitofaji akısı, FluozinyüksekMtFajiyüksekTMREdüşük hücre popülasyonunda bir artış olarak ölçüldü. Bu yöntemler, mitofaji akısının hızlı, kantitatif ve β hücreye özgü değerlendirmelerine izin verir.

Her iki yöntem de basit yaklaşımlardır. Bununla birlikte, bu protokol dahilindeki bazı adımlar, kaliteli ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için çok önemlidir. Bu adımlar şunları içerir: (1) tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için uygun adacık ayrışması, ancak adacık canlılığını sağlayacak kadar hafif, (2) ilgilenilen popülasyonları doğru bir şekilde tanımlamak için dikkatli bir şekilde geçit oluşturulması ve (3) mitofaji akısının tarafsız bir değerlendirmesini sağlamak için yazılım araçları aracılığıyla akış sitometrisi verilerinin objektif olarak ölçülmesi.

Hangi yöntemin kullanılacağı seçilirken, kullanılan genetik modellerin hücre tipi ve doğası göz önünde bulundurulmalıdır. İn vivo olarak kullanılan veya in vitro transfekte edilen mt-Keima yöntemi, akış sitometrisi veya canlı hücre görüntüleme ile mitofaji değerlendirmesi için oldukça alıntı yapılan ve saygın bir yöntemdir21. Boya bazlı MtPhagy yöntemi, genetik raporlayıcılara kıyasla daha yeni bir yaklaşım olsa da, kullanımının mt-Keima'ya tercih edilebileceği durumlar vardır. Gerçekten de, MtPhagy yöntemi, transfeksiyon veya karmaşık üreme şemalarına olan ihtiyacın üstesinden gelir ve MtPhagy boyama sadece 30 dakika sürer ve akış sitometrisinden hemen önce gerçekleştirilir. MtPhagy yaklaşımı, transfekte edilmesi zor birincil insan adacık örneklerinde de başarıyla kullanılabilir. Mitofajiyi doğrudan ölçmek için pH'a duyarlı mitokondriyal boyalara veya problara dayanan bu protokol, Mauro-Lizcano et. Membran potansiyeline duyarlı MitoTracker Deep Red boyasını kullanan ve akış sitometrisi22 ile mitofaji akısını ölçmek için mitofaji ve lizozomal inhibitörlerin kullanılmasını gerektiren. Mauro-Lizcano et. al yöntemi adacıklarda test edilmemiştir, burada açıklanan MtPhagy veya mt-Keima yöntemlerinin etkinliği ile doğrudan karşılaştırmak zordur. Birlikte ele alındığında, bu yöntemlerin kombinasyonu, yüksek kantitatif canlı tek hücreli tahlillerde mitofaji akısını titizlikle değerlendirmek için toplamda artan sayıda seçenek sağlar.

Her iki yöntemin de dezavantajı, hücre fiksasyonu ile uyumsuzluklarıdır. Her iki yöntem de canlı hücre görüntüleme yaklaşımlarıyla uyumlu olmasına rağmen, hücre fiksasyonu, lizozomal membran boyunca hem MtFagy hem de mt-Keima'nın pH gradyanına müdahale eder 7,16. Alternatif olarak, sabit numunelerde mitoQC mitofaji raporlayıcısının kullanımı daha önce kullanılmıştır7. Ek olarak, her iki yöntem için de bir sınırlama, hücre canlılığını etkileyebilecek akış sitometrisinden önce adacıkların ayrıştırılması ihtiyacıdır. Bu nedenle, adacık ayrışmasını takiben hücre canlılığını izlemek ve tüm numunelerin tutarlı bir şekilde işlenmesini sağlamak için hücreleri DAPI ile boyamak çok önemlidir. DAPI boyamayı takiben, numunelerde ortalama %12.7 ± 7.4 ölü hücre vardı (Şekil 1D), bu da her numunedeki hücrelerin %>80'inin analiz için kullanılabileceğini gösteriyor. Her aşamada hücre canlılığının izlenmesi (adacık izolasyonu, kültür ve daha sonra ayrışmayı takiben), prosedürün her adımında hücre sağkalımı hakkında bilgi edinmek için ek olarak yararlı olabilir. Adacık izolasyonu ve tek hücre ayrışması arasındaki zamanlamadaki değişkenlik de hücre canlılığını ve sonuçlarını etkileyebilir. Bu nedenle, tüm deneylerde zamanlama ile tutarlı kalmanız önerilir.

Mitokondriyal kalite kontrolü, β hücre sağlığı ve işlevi için kritik öneme sahip olduğundan, geleneksel biyokimyasal veya görüntüleme yaklaşımları (mitokondriyal dış zar proteinlerinin devri, otofagozomlara mitokondriyal lokalizasyon ve elektron mikroskobu dahil) kullanılarak mitofajinin titiz değerlendirmeleri zor ve zaman alıcı olabilir. Bu nedenle, etkili ve sağlam mitofaji raportör sistemlerinin geliştirilmesi çok önemlidir. Hem mt-Keima hem de MtPhagy yaklaşımı etkilidir ve mitofaji akısının nicel değerlendirmelerine izin verir. Bu iki teknik, β hücreli mitokondriyal kalite kontrolünün ele alınmasında ve organeller arası etkileşimlerin araştırılmasında hem esneklik hem de hassasiyet sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

SAS, Ono Pharmaceutical Co., Ltd.'den hibe fonu almıştır ve Novo Nordisk'in danışmanıdır.

Acknowledgments

E.L-D. NIH'den (T32-AI007413 ve T32-AG000114) destek alır. SAS, JDRF (COE-2019-861), NIH (R01 DK135268, R01 DK108921, R01 DK135032, R01 DK136547, U01 DK127747), Gazi İşleri Bakanlığı (I01 BX004444), Brehm ailesi ve Anthony ailesi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibiotic-Antimycotic Life Technologies 15240-062
Attune NxT Flow Cytometer Thermofisher Scientific A24858
Dimethyl Sulfoxide Sigma-Aldrich 317275
Fatty Acid Free heat shock BSA powder Equitech BAH66
Fetal bovine serum Gemini Bio 900-108
Fluozin-3AM  Thermofisher Scientific  F24195 100 μg Fluozin-3AM powder reconstituted in 51 μL DMSO and 51 μL Pluronic F-127 to reach 1 mM stock. 
Gibco RPMI 1640 Medium Fisher Scientific 11-875-093
HEPES (1M) Life Technologies 15630-080
MtPhagy dye Dojindo MT02-10 5 μg MtPhagy powder reconstituted with 50 μL DMSO to reach 100 μM stock. 
MtPhagy dye Dojindo MT02-10
Penicillin-Streptomycin (100x) Life Technologies 15140-122 1x Solution used in procotol by diluting 1:10 in ddH2O
Phosphate buffered saline, 10x Fisher Scientific BP399-20 1x Solution used in procotol by diluting 1:10 in ddH2O
Sodium Pyruvate (100x) Life Technologies 11360-070 5 μg MtPhagy powder reconstituted with 50 μL DMSO to reach 100 μM stock. 
TMRE [Tetramethylrhodamine, ethyl ester, perchlorate] Anaspec AS-88061 TMRE powder reconstituted in DMSO to reach 100 μM stock.
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Thermofisher Scientific 25300054
Valinomycin Sigma V0627 Valinomycin powder reconsituted in DMSO to reach 250 nM stock.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kaufman, B. A., Li, C., Soleimanpour, S. A. Mitochondrial regulation of β-cell function: maintaining the momentum for insulin release. Molecular Aspects of Medicine. 42, 91-104 (2015).
  2. Soleimanpour, S. A., et al. The diabetes susceptibility gene Clec16a regulates mitophagy. Cell. 157 (7), 1577-1590 (2014).
  3. Pearson, G., et al. Clec16a, Nrdp1, and USP8 form a ubiquitin-dependent tripartite complex that regulates β-cell mitophagy. Diabetes. 67 (2), 265-277 (2018).
  4. Hattori, N., Saiki, S., Imai, Y. Regulation by mitophagy. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 53, 147-150 (2014).
  5. Berezhnov, A. V., et al. Intracellular pH modulates autophagy and mitophagy. Journal of Biological Chemistry. 291 (16), 8701-8708 (2016).
  6. Sun, N., et al. Measuring in vivo mitophagy. Molecular Cell. 60 (4), 685-696 (2015).
  7. McWilliams, T. G., et al. mito-QC illuminates mitophagy and mitochondrial architecture in vivo. Journal of Cell Biology. 214 (3), 333-345 (2016).
  8. Aoyagi, K., et al. A new beta cell-specific mitophagy reporter mouse shows that metabolic stress leads to accumulation of dysfunctional mitochondria despite increased mitophagy. Diabetologia. 66 (1), 147-162 (2023).
  9. Ma, X., Ding, W. X. A fluorescence imaging based-assay to monitor mitophagy in cultured hepatocytes and mouse liver. Liver Research. 5 (1), 16-20 (2021).
  10. Sidarala, V., et al. Mitophagy protects β cells from inflammatory damage in diabetes. JCI Insight. 5 (24), 141138 (2020).
  11. Gingerich, M. A., et al. An intrinsically disordered protein region encoded by the human disease gene CLEC16A regulates mitophagy. Autophagy. 19 (2), 525-543 (2023).
  12. Sun, N., Malide, D., Liu, J., Rovira, I. I., Combs, C. A., Finkel, T. A fluorescence-based imaging method to measure in vitro and in vivo mitophagy using mt-Keima. Nature Protocols. 12 (8), 1576-1587 (2017).
  13. Zhao, J., Bertoglio, B. A., Gee, K. R., Kay, A. R. The zinc indicator FluoZin-3 is not perturbed significantly by physiological levels of calcium or magnesium. Cell Calcium. 44 (4), 422-426 (2008).
  14. Da Silva Xavier, G. The Cells of the Islets of Langerhans. Journal of Clinical Medicine. 7 (3), 54 (2018).
  15. Thapa, B., et al. Imaging β-cell function using a zinc-responsive MRI contrast agent may identify first responder islets. Frontiers in Endocrinology. 12, 809867 (2022).
  16. Iwashita, H., et al. Live cell imaging of mitochondrial autophagy with a novel fluorescent small molecule. ACS Chemical Biology. 12 (10), 2546-2551 (2017).
  17. Crowley, L. C., Christensen, M. E., Waterhouse, N. J. Measuring mitochondrial transmembrane potential by TMRE staining. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (12), 087361 (2016).
  18. Klein, B., Wörndl, K., Lütz-Meindl, U., Kerschbaum, H. H. Perturbation of intracellular K(+) homeostasis with valinomycin promotes cell death by mitochondrial swelling and autophagic processes. Apoptosis. 16 (11), 1101-1117 (2011).
  19. Ji, Y., et al. Toll-like receptors TLR2 and TLR4 block the replication of pancreatic β cells in diet-induced obesity. Nature Immunology. 20 (6), 677-686 (2019).
  20. Sauvat, A., et al. Quantification of cellular viability by automated microscopy and flow cytometry. Oncotarget. 6 (11), 9467-9475 (2015).
  21. Liu, Y. T., et al. Mt-Keima detects PINK1-PRKN mitophagy in vivo with greater sensitivity than mito-QC. Autophagy. 17 (11), 3753-3762 (2021).
  22. Mauro-Lizcano, M., et al. New method to assess mitophagy flux by flow cytometry. Autophagy. 11 (5), 833-843 (2015).

Tags

Mitofaji Akısı Pankreas β-hücreleri Tamamlayıcı Yaklaşımlar Genetik Raportörler Mt-Keima Fare Modeli Mitofajinin Ölçülmesi Akış Sitometrisi PH'a Duyarlı Çift Uyarma Oranlı Prob Asidik-nötr Mt-Keima Dalga Boyu Emisyonları Genetik Mitofaji Raportörleri Karmaşık Genetik Fare Modelleri Transfekte Edilmesi Zor Hücreler Birincil İnsan Adacıkları Boya Bazlı Yöntem MtFaji Hücre Geçirgen Boya Mitofaji Sırasında Lizozomlar Fluozin-3- Zn2+ İndikatörü Tetrametilrodamin Etil Ester (TMRE) Mitokondriyal Membran Potansiyeli
Pankreas β Hücrelerinde Mitofaji Akısını Sorgulamak İçin Tamamlayıcı Yaklaşımlar
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Levi-D’Ancona, E., Sidarala,… More

Levi-D’Ancona, E., Sidarala, V., Soleimanpour, S. A. Complementary Approaches to Interrogate Mitophagy Flux in Pancreatic β-Cells. J. Vis. Exp. (199), e65789, doi:10.3791/65789 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter