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Approches complémentaires pour interroger le flux de mitophagie dans les cellules β pancréatiques

Published: September 15, 2023 doi: 10.3791/65789
Automatic Translation
1,2, 1, 1,3,4
1Department of Internal Medicine, Division of Metabolism, Endocrinology and Diabetes, University of Michigan, Ann Arbor, 2Graduate Program in Immunology, University of Michigan Medical School, 3Department of Molecular and Integrative Physiology, University of Michigan, Ann Arbor, 4VA Ann Arbor Healthcare System

Summary

Ce protocole décrit deux méthodes pour l’analyse quantitative de la mitophagie dans les cellules β pancréatiques : premièrement, une combinaison de colorants spécifiques aux mitochondries perméables aux cellules, et deuxièmement, un rapporteur de mitophagie génétiquement codé. Ces deux techniques sont complémentaires et peuvent être déployées en fonction de besoins spécifiques, ce qui permet une flexibilité et une précision dans l’adressage quantitatif du contrôle de la qualité mitochondriale.

Abstract

La mitophagie est un mécanisme de contrôle de la qualité nécessaire au maintien d’une fonction mitochondriale optimale. Une mitophagie dysfonctionnelle à β cellules entraîne une libération insuffisante d’insuline. Les évaluations quantitatives avancées de la mitophagie nécessitent souvent l’utilisation de rapporteurs génétiques. Le modèle murin mt-Keima, qui exprime une sonde à double rapport d’excitation sensible au pH ciblant les mitochondries pour quantifier la mitophagie par cytométrie en flux, a été optimisé dans les cellules β. Le rapport entre les émissions de longueur d’onde mt-Keima acides/neutres peut être utilisé pour quantifier de manière robuste la mitophagie. Cependant, l’utilisation de rapporteurs de mitophagie génétique peut être difficile lorsque l’on travaille avec des modèles murins génétiques complexes ou des cellules difficiles à transfecter, telles que les îlots humains primaires. Ce protocole décrit une nouvelle méthode complémentaire à base de colorants pour quantifier la mitophagie à cellules β dans les îlots primaires à l’aide de MtPhagy. MtPhagy est un colorant sensible au pH et perméable aux cellules qui s’accumule dans les mitochondries et augmente son intensité de fluorescence lorsque les mitochondries se trouvent dans des environnements à faible pH, tels que les lysosomes pendant la mitophagie. En combinant le colorant MtPhagy avec la fluozine-3-AM, un indicateur de Zn2+ qui sélectionne les cellules β, et la tétraméthylrhodamine, ester éthylique (TMRE) pour évaluer le potentiel de la membrane mitochondriale, le flux de mitophagie peut être quantifié spécifiquement dans les cellules β par cytométrie en flux. Ces deux approches sont très complémentaires, ce qui permet une flexibilité et une précision dans l’évaluation du contrôle de la qualité mitochondriale dans de nombreux modèles β cellules.

Introduction

Les cellules β pancréatiques produisent et sécrètent de l’insuline pour répondre aux demandes métaboliques, et le dysfonctionnement des cellules β est responsable de l’hyperglycémie et de l’apparition du diabète dans les diabètes de type 1 et de type 2. Les β-cellules couplent le métabolisme du glucose avec la sécrétion d’insuline via l’énergétique mitochondriale et la production métabolique, qui dépendent d’une réserve de masse mitochondriale fonctionnelle 1,2,3. Pour maintenir une fonction optimale des β cellules, les cellules β s’appuient sur des mécanismes de contrôle de la qualité mitochondriale pour éliminer les mitochondries âgées ou endommagées et préserver la masse mitochondriale fonctionnelle4. L’autophagie mitochondriale sélective, également connue sous le nom de mitophagie, est un élément clé de la voie de contrôle de la qualité mitochondriale.

Les évaluations de la mitophagie dans les cellules vivantes reposent souvent sur les changements du pH mitochondrial qui se produisent au cours de la mitophagie. Les mitochondries ont un pH légèrement alcalin et les mitochondries saines résident normalement dans le cytosol au pH neutre. Au cours de la mitophagie, les mitochondries endommagées ou dysfonctionnelles sont sélectivement incorporées dans les autophagosomes et finissent par être éliminées dans les lysosomes acides5. Plusieurs modèles murins rapporteurs de mitophagie transgénique in vivo, tels que mt-Keima6, mitoQC7 et CMMR8, ainsi que des sondes de mitophagie transfécondables, telles que le plasmide Cox8-EGFP-mCherry9, utilisent ce changement de pH pour fournir des évaluations quantitatives de la mitophagie. L’utilisation de souris transgéniques exprimant la sonde métrique à double rapport d’excitation sensible au pH mt-Keima a été optimisée pour les évaluations de mitophagie dans les îlots pancréatiques et les cellules β par cytométrie en flux10,11. Le rapport entre les émissions de longueur d’onde mt-Keima acides/neutres (le rapport entre l’excitation acide de 561 nm et l’excitation neutre de 480 nm) peut être utilisé pour quantifier de manière robuste la mitophagie 6,12.

Ce protocole décrit une approche optimisée pour évaluer le flux de mitophagie dans les îlots primaires et les cellules β isolées de souris transgéniques mt-Keima10,11. Bien que mt-Keima soit une sonde très sensible, elle nécessite soit des schémas de sélection animale compliqués, soit la transfection de cellules, ce qui peut souvent être difficile lorsqu’on travaille en combinaison avec d’autres modèles génétiques ou avec des îlots humains primaires. De plus, l’utilisation de plusieurs lasers et détecteurs à fluorescence pour identifier les populations cellulaires neutres et acides peut limiter l’utilisation combinatoire d’autres rapporteurs fluorescents.

Pour surmonter ces défis, ce protocole décrit également une méthode complémentaire, à canal fluorescent unique, à base de colorant, pour une détection robuste de la mitophagie dans les cellules β provenant d’îlots de souris isolés. Cette approche, connue sous le nom de méthode MtPhagogy, utilise une combinaison de trois colorants perméables aux cellules pour sélectionner les cellules β, quantifier les populations cellulaires subissant activement la mitophagie et évaluer simultanément le potentiel de membrane mitochondriale (MMP ou Δψm).

Le premier de ces colorants est le Fluozin-3-AM, un indicateur de Zn2+ perméable aux cellules avec un Ex/Em 494/516 nm13. Les îlots de souris comprennent une population hétérogène de cellules fonctionnellement distinctes, y compris des cellules α, β, δ et PP. Les cellules β comprennent environ 80 % des cellules de l’îlot de souris et se distinguent des autres types de cellules d’îlots en raison de leur concentration élevée en Zn2+ dans les granules d’insuline14,15, ce qui permet d’identifier les cellules β comme étant la populationélevée de Fluozin-3-AM. Le colorant MtPhago, un colorant sensible au pH qui est immobilisé sur les mitochondries via une liaison chimique et émet une faible fluorescence, est également utilisé dans ce protocole16. Lors de l’induction de la mitophagie, les mitochondries endommagées sont incorporées dans le lysosome acide et le colorant MtPhagy augmente son intensité de fluorescence dans l’environnement à faible pH (Ex/Em 561/570-700 nm).

De plus, la tétraméthylrhodamine, ester éthylique (TMRE), est utilisée pour évaluer la MMP. Le TMRE est un colorant chargé positivement perméable aux cellules (Ex/Em 552/575 nm) qui est séquestré par les mitochondries saines en raison de la charge négative relative maintenue par leur potentiel membranaire17. Les mitochondries endommagées ou malsaines dissipent leur potentiel membranaire, ce qui entraîne une diminution de la capacité à séquestrer l’ERM. En utilisant ces colorants ensemble, les cellules β subissant une mitophagie peuvent être identifiées comme la populationà haute teneur enFluozine à haute teneur en TMREparcytométrie en flux. Étant donné que la mitophagie est un processus dynamique plutôt que statique, ce protocole a été optimisé pour évaluer le flux de mitophagie à l’aide de la valinomycine, un ionophore K+ qui induit la mitophagie après dissipation de MMP18. La comparaison de la mitophagie en présence et en absence de valinomycine permet d’évaluer le flux de mitophagie dans différents groupes d’échantillons.

La nature colorante de l’approche actuelle permet de l’extrapoler aux îlots humains et à d’autres types de cellules difficiles à transfecter et de contourner la nécessité de schémas de sélection animale compliqués, contrairement au protocole mt-Keima. L’objectif principal de ce protocole est de quantifier la mitophagie dans les cellules β au niveau de la cellule unique via deux méthodes indépendantes basées sur la cytométrie en flux. Pris ensemble, ce protocole décrit deux méthodes puissantes et complémentaires qui permettent à la fois précision et flexibilité dans l’étude quantitative du contrôle de la qualité mitochondriale.

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Protocol

Les études animales présentées dans ce protocole ont été examinées et approuvées par le Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux de l’Université du Michigan. Des souris mâles C57BL/6J âgées de vingt semaines, soumises à un régime régulier de 15 semaines en graisses (RFD) ou à un régime riche en graisses (HFD), ont été utilisées pour cette étude.

1. Évaluation de la mitophagie par l’approche MtPhagy à base de colorant (Méthode 1)

  1. Préparation et traitement des îlots de la souris
    1. Effectuez la culture des îlots pancréatiques et l’exposition à la valinomycine en suivant les étapes ci-dessous.
      1. Isolez les îlots de souris d’un régime alimentaire régulier en graisses (RFD) ou d’un régime riche en graisses (HFD, 60 kcal% Fat19), en suivant les méthodes décrites précédemment 2,10.
      2. Cultiver des échantillons d’îlots pancréatiques pendant la nuit à 37 °C dans un milieu RPMI complété par 100 unités/mL d’antibiotique-antimycosique, 50 unités/mL de pénicilline-streptomycine, 1 mM de pyruvate de sodium, 10 mM de HEPES et 10 % de sérum de veau fœtal (FBS) (voir le tableau des matériaux). Ce milieu sera appelé « milieu d’îlot ».
      3. À l’aide d’une pipette, prélever 100 îlots par condition dans des boîtes de Pétri de 6 cm dans 2 mL de milieu d’îlots.
        REMARQUE : Conditions utilisées pour ce protocole : (1) Contrôle non coloré : îlots RFD non colorés ; (2) Contrôle DAPI uniquement : îlots RFD colorés avec DAPI ; (3) Contrôle de Fluozin-3-AM uniquement : îlots RFD colorés avec Fluozin-3-AM ; (4) Contrôle MtPhagy uniquement : îlots RFD colorés avec MtPhagy ; (5) Contrôle TMRE uniquement : îlots RFD colorés avec TMRE ; (6) RFD non traité : îlots RFD colorés avec MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM et DAPI ; (7) Îlots RFD exposés à la valinomycine : Îlots RFD exposés à la valinomycine et colorés avec MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM et DAPI ; (8) HFD non traité : îlots HFD colorés avec MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM et DAPI ; (9) Îlots HFD exposés à la valinomycine : Îlots HFD exposés à la valinomycine et colorés avec MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM et DAPI.
      4. Pour les conditions (7) et (9) (voir NOTE ci-dessus) exposées à la valinomycine, ajouter 2 μL de stock de valinomycine à 250 nΜ (voir tableau des matériaux) aux îlots de Pétri pendant 3 h pour induire la mitophagie.
    2. Effectuer la dissociation d’une seule cellule.
      1. Après 3 h d’exposition à la valinomycine, prélever 100 îlots de chaque condition dans des tubes de microcentrifugation séparés à l’aide d’une pipette.
      2. Essorer les îlots à 350 x g pendant 1 min à 10 °C et jeter le surnageant à l’aide d’une pipette.
      3. Laver les échantillons 2 fois avec 1 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS), en effectuant des étapes d’essorage (350 x g/1 min, 10 °C) entre chaque lavage. Jeter le surnageant à l’aide d’une pipette après chaque lavage.
      4. Pour dissocier les îlots en cellules individuelles, ajouter 500 μL de trypsine à 0,05 % (préchauffée à 37 °C) dans le tube de microcentrifugation d’un échantillon afin d’éviter une digestion excessive des îlots. Pipetez de haut en bas à plusieurs reprises jusqu’à ce que les îlots soient visiblement dispersés.
      5. Ajouter immédiatement 1 mL de milieu d’îlot préchauffé pour neutraliser la trypsine. Répétez la trypsinisation et la neutralisation pour chaque échantillon, un à la fois.
      6. Essorer les échantillons à 500 x g pendant 5 min à 10 °C. Retirer le surnageant à l’aide d’une pipette, en prenant soin de ne pas déranger la pastille.
        REMARQUE : Les pastilles seront délicates pour les échantillons exposés à la valinomycine.
      7. Laver les échantillons 2 fois avec un milieu RPMI, sans rouge phénolique, complété par 100 unités/mL d’antibiotique-antimycosique, 50 unités/mL de pénicilline-streptomycine, 1 mM de pyruvate de sodium, 10 mM de HEPES et 10 % d’albumine sérique bovine (BSA). Ce milieu sera appelé « milieu d’écoulement d’îlots ». Inclure des étapes d’essorage (350 x g/1 min, 10 °C) entre chaque lavage. Jeter le surnageant à l’aide d’une pipette après chaque lavage.
    3. Colorer les cellules avec MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM et DAPI pour les préparer à la cytométrie en flux.
      1. Remettre en suspension des échantillons d’îlots pancréatiques dans 500 μL de milieu d’écoulement d’îlots.
      2. Ajouter 0,25 μL de 100 μM de MtPhagy (voir le tableau des matériaux) aux tubes recevant le colorant MtPhagy (conditions 4, 6, 7, 8 et 9, NOTE à l’étape 1.1.1).
      3. Ajouter 0,25 μL de 100 μM de TMRE (voir le tableau des matériaux) aux tubes recevant le colorant TMRE (conditions 5, 6, 7, 8 et 9).
      4. Ajouter 0,25 μL de 1 mM de Fluozin-3-AM (voir le tableau des matériaux) aux tubes recevant le colorant Fluozin-3-AM (conditions 3, 6, 7, 8 et 9).
      5. Tubes vortex à basse vitesse pendant 5 s pour mélanger.
      6. Envelopper les tubes de la microcentrifugeuse dans du papier d’aluminium à l’abri de la lumière et incuber à 37 °C pendant 30 min. À mi-incubation, les tubes vortex à basse vitesse pendant 5 à 10 s se mélangent.
      7. Après incubation, centrifuger des échantillons à 350 x g pendant 1 min à 10 °C. Jeter le surnageant à l’aide d’une pipette.
      8. Remettre les échantillons en suspension dans un milieu d’écoulement d’îlot de 500 μL. Ajouter 0,2 μg/mL de DAPI (voir le tableau des matériaux) aux conditions 2, 6, 7, 8 et 9.
      9. Essorer les échantillons à 350 x g pendant 1 min à 10 °C. Jeter le surnageant à l’aide d’une pipette et remettre en suspension dans 500 μL de milieu d’écoulement des îlots pancréatiques.
      10. Placer les échantillons sur de la glace.
  2. Cytométrie en flux
    1. Démarrez l’instrument (voir Tableau des matériaux).
      REMARQUE : N’importe quel cytomètre en flux avec les filtres appropriés fonctionnera. Les filtres suivants ont été utilisés dans cette étude : (1) VL1 pour DAPI : Excitation/Émission - 405 nm/440 nm (50 nm) ; (2) BL1 pour Fluozin-3-AM : Excitation/Émission - 488 nm/530 nm (30 nm) ; (3) BL2 pour le colorant MtPhagy : Excitation/Émission - 488 nm/590 nm (40 nm) ; (4) YL1 pour TMRE : Excitation/Émission - 561 nm/585 nm (16 nm).
    2. Ajustez les tensions pour la diffusion directe (FSC) et latérale (SSC) pour vous assurer que les populations cellulaires sont au centre du nuage de points. Pour ce protocole, les tensions utilisées étaient de 120 V pour le FSC et de 260 V pour le SSC afin de garantir que les cellules se situent uniformément dans le FSC-A par rapport au FSC-A. Graphique SSC-A (figure 1A).
    3. Pour exclure les cellules non individuelles, ajoutez une porte rectangulaire sur FSC-H vs. FSC-W suivi de SSC-H vs. SSC-W (Figure 1B, C).
    4. Ajustez les tensions et la compensation pour le DAPI afin de filtrer les cellules β sous tension. Définir des grilles de fluorescence pour chaque fluorophore utilisé en fonction de l’échantillon RFD non coloré (figures 1D-F).
      REMARQUE : Tensions utilisées pour chaque canal : (1) VL1 : 320-360 V ; (2) BL1 : 300 à 340 V ; (3) BL2 : 260 à 300 V ; (4) YL1 : 300 à 340 V.
    5. Une fois les points de contrôle établis, collectez 10 000 événements par échantillon.
      NOTA : À l’aide de cette approche de déclenchement, les niveaux de mitophagie dans des conditions basales et lors de l’induction de la valinomycine ont été évalués dans les îlots RFD et HFD (Figure 2).
    6. Enregistrez les données sous forme de fichiers FCS pour les analyser.

2. Évaluation de la mitophagie à l’aide du rapporteur mt-Keima génétiquement codé (Méthode 2)

  1. Préparation d’îlots de souris et dissociation d’une cellule unique
    1. Effectuez la culture des îlots pancréatiques et l’exposition à la valinomycine en suivant les étapes ci-dessous.
      1. Isolez les îlots pancréatiques de souris de type sauvage (WT) et mt-Keima/+ (mt-Keima)6. Dans cette méthode, des souris mâles de 20 semaines nourries avec des souris RFD WT ou mt-Keima/+ ont été utilisées.
      2. Cultiver des échantillons d’îlots pancréatiques pendant la nuit à 37 °C dans un milieu d’îlots.
      3. À l’aide d’une pipette, prélever 100 îlots par condition dans des boîtes de Pétri de 6 cm avec 2 mL de milieu d’îlots.
        NOTA : Conditions utilisées pour ce protocole : (1) Témoin non coloré : îlots WT non colorés ; (2) Contrôle DAPI uniquement : îlots WT colorés au DAPI ; (3) Lutte contre la Fluozine-3-AM uniquement : îlots WT colorés à la Fluozine-3-AM ; (4) contrôle du mt-Keima uniquement : îlots mt-Keima/+ non colorés ; (5) Non traité : îlots mt-Keima/+ colorés à la Fluozin-3-AM et au DAPI ; (6) Valinomycine : îlots mt-Keima/+ exposés à la valinomycine et colorés à la fluozine-3-AM et au DAPI.
      4. Pour la condition (6) avec exposition à la valinomycine, ajouter 2 μL de stock de valinomycine à 250 nM aux îlots pancréatiques dans une boîte de Pétri pendant 3 h pour induire la mitophagie.
    2. Effectuer la dissociation d’une seule cellule.
      1. Effectuez les étapes de dissociation d’une seule cellule, comme décrit à l’étape 1.1.2.
    3. Colorer les cellules avec Fluozin-3-AM et DAPI.
      1. Remettre en suspension des échantillons d’îlots pancréatiques dans 500 μL de milieu d’écoulement d’îlots.
      2. Ajouter 0,25 μL de 1 mM de Fluozin-3-AM dans les tubes recevant le colorant Fluozin-3-AM (conditions 3, 5 et 6).
      3. Incuber les cellules à 37 °C et procéder au traitement DAPI, comme décrit aux étapes 1.1.3.5 à 1.3.10.
  2. Cytométrie en flux
    1. Démarrez l’instrument. N’importe quel cytomètre en flux avec les filtres appropriés fonctionnera.
      NOTA : Les filtres suivants ont été utilisés dans cette étude : (1) VL1 pour DAPI : Excitation/Émission - 405 nm/440 nm (50 nm) ; (2) BL1 pour Fluozin-3-AM : Excitation/Émission - 488 nm/530 nm (30 nm) ; (3) VL3 pour le neutre mt-Keima : Excitation/Émission - 405 nm/603 nm (48 nm) ; (4) YL2 pour l’acide mt-Keima : Excitation/Émission - 561 nm/620 nm (15 nm).
    2. Ajustez les tensions FSC et SSC et excluez les cellules non simples comme décrit aux étapes 1.2.2 à 1.2.3 (figures 3A à C).
    3. Ajustez les tensions et la compensation pour le DAPI, la Fluozine-3-AM et le mt-Keima à l’aide de témoins non colorés et à positif unique (conditions 1 à 4) pour vous assurer que les populations cellulaires positives à la fluorescence peuvent être distinguées des cellules non colorées. Une fois que la compensation appropriée a été appliquée à chaque canal, réglez la porte négative DAPI et les portes positives Fluozin-3-AM pour filtrer les cellules β vivantes (figures 3D-E).
    4. Mettre en place un schéma de contrôle triangulaire à l’aide de l’échantillon positif mt-Keima (condition 4) pour identifier les populations de cellules acides et neutres (Figure 3F).
      REMARQUE : Tensions généralement utilisées pour chaque canal : (1) VL1 : 320-340 V ; (2) BL2 : 260 à 280 V ; (3) VL3 : 280 à 300 V ; (4) YL2 : 280 à 300 V.
    5. Une fois les points de contrôle établis, collectez 10 000 événements par échantillon. Les schémas de déclenchement pour les conditions 5 et 6 sont illustrés à la figure 3A-G.
    6. Enregistrez les données sous forme de fichiers FCS pour les analyser.

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Representative Results

Évaluation de la mitophagie via l’approche MtPhagy à base de colorants
Cette approche basée sur les colorants a été optimisée pour analyser le flux de mitophagie dans les cellules β primaires de souris sans avoir besoin d’un rapporteur génétique, en utilisant Fluozin-3-AM, TMRE et MtPhagy ainsi que DAPI pour exclure les cellules mortes. En associant ces colorants à la valinomycine pour induire la mitophagie, ce protocole décrit une méthode à base de colorants pour mesurer sélectivement le flux de mitophagie dans les cellules β primaires de souris18. Pour les données présentées à l’aide de cette méthode MtPhagoy, la mitophagie basale et induite par la valinomycine a été analysée chez des îlots isolés de souris nourries avec un régime alimentaire régulier en graisses (RFD) ou un régime riche en graisses (HFD, 60 kcal% de matières grasses) afin d’évaluer l’effet du stress métabolique sur le flux de mitophagie. Pour identifier la population d’intérêt, les cellules ont été fermées à l’aide d’îlots RFD non traités. Les tensions FSC et SSC ont d’abord été ajustées pour obtenir une distribution uniforme des cellules sur un tracé SSC-A par rapport au FSC-A (Figure 1A). Pour sélectionner des cellules individuelles, à la fois FSC-H et FSC-H. FSC-W et SSC-H vs. Des diagrammes SSC-W ont été utilisés, où les multiplets ont été exclus en raison de leurs valeurs de signal de largeur plus élevées par rapport aux cellules individuelles (Figure 1B,C). Ensuite, les cellules DAPI-négatives ont été sélectionnées pour exclure les cellules mortes20 (Figure 1D). Après l’établissement des grilles primaires, des contrôles à coloration unique ont été utilisés pour établir des portes de fluorescence pour la Fluozine-3-AM, la MtPhagy et la TMRE (Figure 1E-G) ainsi que des contrôles de compensation pour la cytométrie en flux de fluorescence multicolore.

Une fois que ces grilles primaires et de fluorescence ont été établies, les cellules β à forte utilisation de la mitophagie ont été définies comme la population àfaible TMREà hauteteneur en Fluozine dans le quadrant 3 (Q3) en utilisant la RFD sans exposition à la valinomycine (Figure 1H). À l’aide de cette stratégie de déclenchement, les taux de mitophagie basale et induite par la valinomycine ont été caractérisés dans les îlots RFD et HFD (Figure 2). Pour quantifier le flux de mitophagie, basal vs. Les taux de mitophagie induite par la valinomycine ont été comparés en utilisant le rapport suivant :

Equation 1

À l’aide de ce rapport, le flux de mitophagie a été quantifié et comparé dans RFD vs. HFD β-cellules pour évaluer les différences de mitophagie suite à l’induction de l’obésité et de la résistance périphérique à l’insuline. Quantification du flux de mitophagie dans la RFD vs. Les échantillons HFD sont illustrés à la figure 2E. Ce résultat met en évidence la faisabilité de ce test pour quantifier la mitophagie dans les cellules β en utilisant une approche simple basée sur les colorants. Cette méthode peut également être employée dans les îlots humains, les cellules difficiles à transfecter et les îlots isolés à partir de modèles génétiques complexes où le croisement avec le modèle transgénique mt-Keima serait fastidieux.

Évaluation de la mitophagie à l’aide du rapporteur mt-Keima génétiquement codé
Mt-Keima est une protéine fluorescente à double excitation fusionnée avec une séquence de localisation Cox8 qui permet de la cibler sur la membrane mitochondriale interne. La propriété fluorescente bimodale de mt-Keima lui permet de faire passer ses spectres d’excitation de la longueur d’onde neutre (405 nm) à la longueur d’onde acide (561 nm), en fonction du pH du compartiment intracellulaire6. Cela permet une analyse de fluorescence ratiométrique robuste de la mitophagie, où une augmentation du rapport acide/neutre indique une induction de mitophagie. Dans ce protocole, la Fluozin-3-AM a également été utilisée pour sélectionner les cellules β par cytométrie en flux. Dans ces études représentatives, le flux mitophagique a été évalué à l’aide d’îlots isolés de souris nourries avec un régime RFD10,11. Les tensions FSC et SSC ont d’abord été ajustées pour obtenir une distribution uniforme des cellules sur un SSC-A vs. Tracé FSC-A (figure 3A). Pour sélectionner des cellules individuelles, à la fois FSC-H et FSC-H. FSC-W et SSC-H vs. Des diagrammes SSC-W ont été utilisés, où les multiplets ont été exclus en raison de leurs valeurs de signal de largeur plus élevées par rapport aux cellules individuelles (Figure 3B, C). La tension et la stratégie de déclenchement pour le DAPI et la Fluozin-3-AM ont été déterminées à l’aide d’îlots colorés à une seule couleur (Figure 3D,E). Des portes triangulaires pour les populations acides et neutres ont ensuite été identifiées à l’aide de l’échantillon positif au mt-Keima sans exposition à la valinomycine (figure 3F).

Une fois que ces portes primaires et de fluorescence ont été établies, le flux de mitophagie a été évalué à l’aide des changements basaux et induits par la valinomycine dans la fluorescence mt-Keima (Figure 3F,G). Pour quantifier le flux de mitophagie, la mitophagie basale vs. Les taux induits par la valinomycine ont été comparés à l’aide du rapport suivant :

Equation 2

À l’aide de ce rapport, le flux de mitophagie a été quantifié dans les cellules RFD. La quantification de ce résultat est illustrée à la figure 3H. Il est important de noter que ces résultats sont comparables à ceux obtenus dans les îlots RFD générés à l’aide de l’approche MtPhagy (Figure 3H).

Figure 1
Figure 1 : Schéma de contrôle pour la méthode MtPhago. (A) Diagramme de flux affichant le schéma de contrôle à sélectionner pour toutes les cellules. (B) Déclenchement pour sélectionner les singlets en fonction du FSC-H vs. FSC-W et (C) SSC-H c. SSC-W. (D) Déclenchement des cellules DAPI-négatives pour exclure les cellules mortes. (E) Déclenchement pour les celluleshautes de Fluozin-3-AM à sélectionner pour les cellules β. (F) Schéma de contrôle pour le colorant MtPhagy afin d’identifier les populations à cellulesélevées et àcellules faibles en MtPhago. (G) Schéma de contrôle pour l’ERM afin d’identifier les populationsà cellules élevées età faible TMRE. (H) Mise en place d’un schéma de contrôle des quadrants avec des îlots RFD non traités pour identifier les cellulesà forteteneuren Fluozine à haute teneur en TMRE dans le quadrant 3 (Q3) comme des cellules à β subissant une mitophagie. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Évaluation des différences de flux de mitophagie dans les cellules β de souris suite à un stress métabolique à l’aide du schéma de déclenchement MtPhago. Graphiques représentatifs de cytométrie en flux de β(A) cellules RFD non traitées, (B) de cellules HFD non traitées, (B) de β cellules HFD non traitées, (C) de β cellules RFD RFD exposées à la valinomycine et (D) de cellules HFD β exposées à la valinomycine. (E) Quantification du flux de mitophagie dans les cellules β, calculée à l’aide d’un rapport entre les cellulesà faible TMREélevéde MtPhagy exposées à la valinomycine et les cellulesà faible TMREélevéde MtPhagy non exposées à la valinomycine, pour les échantillons RFD et HFD. *p < 0,05 par le test t non apparié de Student. n = 3/groupe. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Schéma de déclenchement pour la méthode mt-Keima et comparaison entre les deux méthodes. (A) Diagramme de flux affichant le schéma de contrôle à sélectionner pour toutes les cellules. (B) Déclenchement pour sélectionner les singlets en fonction du FSC-H vs. FSC-W et (C) SSC-H c. SSC-W. (D) Déclenchement des cellules DAPI-négatives pour exclure les cellules mortes. (E) Déclenchement pour les celluleshautes de Fluozin-3-AM à sélectionner pour les cellules β. (F) Diagrammes représentatifs de cytométrie en flux de cellules non traitées mt-Keima/+ et (G) de cellules exposées à la valinomycine mt-Keima/+. (H) Quantification du flux de mitophagie dans les cellules β de souris nourries par RFD, calculée à l’aide d’un rapport entre les cellules acides/neutres exposées à la valinomycine et le rapport des cellules acides/neutres non exposées à la valinomycine à l’aide de la méthode mt-Keima et comparée à la méthode MtPhagy (données pour le protocole MtPhagy présentées à l’origine à la figure 2E). n = 3/groupe. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Ce protocole décrit deux méthodes complémentaires pour quantifier le flux de mitophagie dans les îlots primaires dissociés de souris. À l’aide de la méthode mt-Keima, une augmentation de la mitophagie a été quantifiée comme une augmentation du rapport entre les cellules acides (561 nm) et neutres (405 nm), tandis que dans la méthode MtPhago, l’augmentation du flux de mitophagie a été quantifiée comme une augmentation de la populationde cellules à faible TMREà haute teneur enFluozine. Ces méthodes permettent des évaluations rapides, quantitatives et spécifiques à β cellules du flux de mitophagie.

Les deux méthodes sont des approches simples. Cependant, certaines étapes de ce protocole sont cruciales pour obtenir des résultats de qualité et reproductibles. Ces étapes comprennent : (1) une dissociation correcte des îlots pour obtenir une suspension cellulaire unique, mais suffisamment douce pour assurer la viabilité des îlots, (2) l’établissement minutieux d’un déclenchement pour identifier correctement les populations d’intérêt, et (3) la quantification objective des données de cytométrie en flux via des outils logiciels pour assurer une évaluation non biaisée du flux mitophagien.

Lors du choix de la méthode à utiliser, le type de cellule et la nature des modèles génétiques utilisés doivent être pris en compte. La méthode mt-Keima, utilisée in vivo ou transfectée in vitro, est une méthode très citée et réputée pour l’évaluation de la mitophagie par cytométrie en flux ou imagerie de cellules vivantes21. Bien que la méthode MtPhagy à base de colorant soit une approche plus récente par rapport aux rapporteurs génétiques, il existe des cas où son utilisation peut être préférée à celle de mt-Keima. En effet, la méthode MtPhagy permet de s’affranchir de la nécessité d’une transfection ou de schémas d’élevage complexes, et la coloration MtPhagy ne prend que 30 min et est réalisée immédiatement avant la cytométrie en flux. L’approche MtPhagy peut également être utilisée avec succès dans des échantillons d’îlots humains primaires difficiles à transfecter. Ce protocole, qui s’appuie soit sur des colorants mitochondriaux sensibles au pH, soit sur des sondes pour mesurer directement la mitophagie, est distinct d’une approche antérieure de Mauro-Lizcano et. De plus, il n’y a pas d’autre moyen d’utiliser le colorant MitoTracker Deep Red sensible au potentiel membranaire et d’inhibiteurs lysosomaux pour quantifier le flux de mitophagie par cytométrie en flux22. Comme le Mauro-Lizcano et. Cette méthode n’a pas été testée dans les îlots, il est difficile de la comparer directement à l’efficacité des méthodes MtPhagy ou mt-Keima décrites ici. Prises ensemble, la combinaison de ces méthodes offre dans l’ensemble un nombre croissant d’options pour évaluer rigoureusement le flux de mitophagie dans des essais hautement quantitatifs de cellules uniques vivantes.

Un inconvénient des deux méthodes est leur incompatibilité avec la fixation cellulaire. Bien que les deux méthodes soient compatibles avec les approches d’imagerie des cellules vivantes, la fixation cellulaire interfère avec le gradient de pH de MtPhagy et de mt-Keima à travers la membrane lysosomale 7,16. Comme alternative, l’utilisation du rapporteur de mitophagie mitoQC dans des échantillons fixes a déjà été utilisée7. De plus, une limite pour les deux méthodes est la nécessité de dissocier les îlots avant la cytométrie en flux, ce qui peut avoir un impact sur la viabilité cellulaire. Par conséquent, il est essentiel de colorer les cellules avec du DAPI pour surveiller la viabilité cellulaire après la dissociation des îlots pancréatiques et s’assurer que tous les échantillons sont traités de manière cohérente. Après coloration DAPI, les échantillons présentaient en moyenne 12,7 % ± 7,4 cellules mortes (figure 1D), ce qui indique que >80 % des cellules de chaque échantillon pouvaient être utilisées pour l’analyse. La surveillance de la viabilité cellulaire à chaque étape (après l’isolement des îlots pancréatiques, la culture, puis la dissociation) peut être utile pour obtenir des connaissances sur la survie cellulaire à chaque étape de la procédure. La variabilité du temps entre l’isolement des îlots pancréatiques et la dissociation d’une seule cellule peut également affecter la viabilité cellulaire et les résultats. Par conséquent, il est recommandé de respecter le calendrier de toutes les expériences.

Comme le contrôle de la qualité mitochondriale est essentiel à la santé et au fonctionnement des cellules β, des évaluations rigoureuses de la mitophagie à l’aide d’approches biochimiques ou d’imagerie traditionnelles (y compris le renouvellement des protéines de la membrane externe mitochondriale, la localisation des mitochondries dans les autophagosomes ou les lysosomes et la microscopie électronique) peuvent s’avérer difficiles et longues. Ainsi, le développement de systèmes rapporteurs de mitophagie efficaces et robustes est crucial. Les approches mt-Keima et MtPhagy sont toutes deux efficaces et permettent des évaluations quantitatives du flux de mitophagie. Ces deux techniques permettent à la fois flexibilité et précision dans le contrôle de la qualité mitochondriale à cellules β et dans l’étude des interactions inter-organites.

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Disclosures

SAS a reçu une subvention d’Ono Pharmaceutical Co., Ltd. et est consultant pour Novo Nordisk.

Acknowledgments

E.L-D. reconnaît le soutien des NIH (T32-AI007413 et T32-AG000114). SAS reconnaît le soutien de la FRDJ (COE-2019-861), du NIH (R01 DK135268, R01 DK108921, R01 DK135032, R01 DK136547, U01 DK127747), du ministère des Anciens Combattants (I01 BX004444), de la famille Brehm et de la famille Anthony.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibiotic-Antimycotic Life Technologies 15240-062
Attune NxT Flow Cytometer Thermofisher Scientific A24858
Dimethyl Sulfoxide Sigma-Aldrich 317275
Fatty Acid Free heat shock BSA powder Equitech BAH66
Fetal bovine serum Gemini Bio 900-108
Fluozin-3AM  Thermofisher Scientific  F24195 100 μg Fluozin-3AM powder reconstituted in 51 μL DMSO and 51 μL Pluronic F-127 to reach 1 mM stock. 
Gibco RPMI 1640 Medium Fisher Scientific 11-875-093
HEPES (1M) Life Technologies 15630-080
MtPhagy dye Dojindo MT02-10 5 μg MtPhagy powder reconstituted with 50 μL DMSO to reach 100 μM stock. 
MtPhagy dye Dojindo MT02-10
Penicillin-Streptomycin (100x) Life Technologies 15140-122 1x Solution used in procotol by diluting 1:10 in ddH2O
Phosphate buffered saline, 10x Fisher Scientific BP399-20 1x Solution used in procotol by diluting 1:10 in ddH2O
Sodium Pyruvate (100x) Life Technologies 11360-070 5 μg MtPhagy powder reconstituted with 50 μL DMSO to reach 100 μM stock. 
TMRE [Tetramethylrhodamine, ethyl ester, perchlorate] Anaspec AS-88061 TMRE powder reconstituted in DMSO to reach 100 μM stock.
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Thermofisher Scientific 25300054
Valinomycin Sigma V0627 Valinomycin powder reconsituted in DMSO to reach 250 nM stock.

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References

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  22. Mauro-Lizcano, M., et al. New method to assess mitophagy flux by flow cytometry. Autophagy. 11 (5), 833-843 (2015).

Tags

Flux de mitophagie cellules pancréatiques β approches complémentaires rapporteurs génétiques modèle murin Mt-Keima quantification de la mitophagie cytométrie en flux sonde ratiométrique à double excitation sensible au PH émissions de longueurs d’onde Mt-Keima acides-à-neutres rapporteurs de mitophagie génétique modèles murins génétiques complexes cellules difficiles à transfecter îlots humains primaires méthode à base de colorant MtPhagie colorant perméable aux cellules lysosomes pendant la mitophagie fluozine-3-AM indicateur Zn2+ ester éthylique de tétraméthylrhodamine (TMRE) Potentiel membranaire mitochondrial
Approches complémentaires pour interroger le flux de mitophagie dans les cellules β pancréatiques
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Levi-D’Ancona, E., Sidarala, V., Soleimanpour, S. A. Complementary Approaches to Interrogate Mitophagy Flux in Pancreatic β-Cells. J. Vis. Exp. (199), e65789, doi:10.3791/65789 (2023).

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