Biology

Komplementære tilnærminger for å forhøre mitofagifluks i bukspyttkjertelen β-celler

Published: September 15, 2023 doi: 10.3791/65789

Elena Levi-D’Ancona^1,2, Vaibhav Sidarala¹, Scott A. Soleimanpour^1,3,4

¹Department of Internal Medicine, Division of Metabolism, Endocrinology and Diabetes, University of Michigan, Ann Arbor, ²Graduate Program in Immunology, University of Michigan Medical School, ³Department of Molecular and Integrative Physiology, University of Michigan, Ann Arbor, ⁴VA Ann Arbor Healthcare System

Summary

Denne protokollen skisserer to metoder for kvantitativ analyse av mitofagi i bukspyttkjertelen β-celler: For det første en kombinasjon av cellepermeable mitokondrie-spesifikke fargestoffer, og for det andre, en genetisk kodet mitofagi reporter. Disse to teknikkene er komplementære og kan distribueres basert på spesifikke behov, noe som gir fleksibilitet og presisjon i kvantitativt adressering av mitokondriell kvalitetskontroll.

Abstract

Mitophagy er en kvalitetskontrollmekanisme som er nødvendig for å opprettholde optimal mitokondriell funksjon. Dysfunksjonell β-celle mitofagi resulterer i utilstrekkelig insulinfrigivelse. Avanserte kvantitative vurderinger av mitofagi krever ofte bruk av genetiske reportere. Mt-Keima-musemodellen, som uttrykker en mitokondrie-målrettet pH-sensitiv dual-excitasjonsratiometrisk sonde for kvantifisering av mitofagi via flowcytometri, er optimalisert i β-celler. Forholdet mellom sure og nøytrale mt-Keima bølgelengdeutslipp kan brukes til å kvantifisere mitofagi robust. Imidlertid kan bruk av genetiske mitofagireportere være utfordrende når du arbeider med komplekse genetiske musemodeller eller vanskelig å transfektere celler, for eksempel primære menneskelige øyer. Denne protokollen beskriver en ny komplementær fargestoffbasert metode for å kvantifisere β-celle mitofagi i primære øyer ved hjelp av MtPhagy. MtPhagy er et pH-følsomt, cellepermeabelt fargestoff som akkumuleres i mitokondriene og øker fluorescensintensiteten når mitokondrier er i lave pH-miljøer, som lysosomer under mitofagi. Ved å kombinere MtPhagy-fargestoffet med Fluozin-3-AM, en Zn²⁺ -indikator som selekterer for β-celler, og tetrametylrhodamin, etylester (TMRE) for å vurdere mitokondriemembranpotensialet, kan mitofagifluks kvantifiseres spesifikt i β-celler via flowcytometri. Disse to tilnærmingene er svært komplementære, noe som gir fleksibilitet og presisjon i vurderingen av mitokondriell kvalitetskontroll i mange β-cellemodeller.

Introduction

Bukspyttkjertel β-celler produserer og utskiller insulin for å møte metabolske krav, og β-celle dysfunksjon er ansvarlig for hyperglykemi og diabetesutbrudd i både type 1 og type 2 diabetes. β-celler kobler glukosemetabolisme med insulinsekresjon via mitokondriell energetikk og metabolsk utgang, som avhenger av en reserve av funksjonell mitokondriemasse ^1,2,3. For å opprettholde optimal β-cellefunksjon er β-cellene avhengige av mitokondrielle kvalitetskontrollmekanismer for å fjerne gamle eller skadede mitokondrier og bevare funksjonell mitokondriemasse⁴. Selektiv mitokondriell autofagi, også kjent som mitofagi, er en nøkkelkomponent i mitokondriell kvalitetskontrollvei.

Vurderinger av mitofagi i levende celler er ofte avhengige av endringer i mitokondriell pH som oppstår under mitofagi. Mitokondrier har en svakt alkalisk pH, og sunne mitokondrier ligger normalt i den pH-nøytrale cytosolen. Under mitofagi blir skadede eller dysfunksjonelle mitokondrier selektivt innlemmet i autofagosomer og til slutt ryddet i sure lysosomer⁵. Flere in vivo transgene mitophagy reportermusemodeller, som mt-Keima⁶, mitoQC⁷ og CMMR⁸, samt transfektable mitofagiprober, som Cox8-EGFP-mCherry plasmid⁹, bruker denne pH-endringen for å gi kvantitative vurderinger av mitofagi. Bruk av transgene mus som uttrykker den mt-Keima pH-sensitive dual-excitation ratiometric probe har blitt optimalisert for mitofagivurderinger i øyer og β-celler via flowcytometri^10,11. Forholdet mellom sure og nøytrale mt-Keima bølgelengdeutslipp (forholdet mellom sur 561 nm og nøytral 480 nm eksitasjon) kan brukes til å kvantifisere mitofagi ^6,12.

Denne protokollen beskriver en optimalisert tilnærming for å vurdere mitofagifluks i primære øyer og β-celler isolert fra mt-Keima transgene mus^10,11. Mens mt-Keima er en svært følsom sonde, krever det enten kompliserte dyreavlsordninger eller transfeksjon av celler, noe som ofte kan være utfordrende når man arbeider i kombinasjon med andre genetiske modeller eller med primære menneskelige øyer. I tillegg kan bruk av flere fluorescenslasere og detektorer for å identifisere nøytrale og sure cellepopulasjoner begrense den kombinatoriske bruken av andre fluorescerende reportere.

For å overvinne disse utfordringene beskriver denne protokollen også en komplementær, enkelt fluorescerende kanal, fargestoffbasert metode for robust påvisning av mitofagi i β-celler fra isolerte museøyer. Denne tilnærmingen, referert til som MtPhagy-metoden, benytter en kombinasjon av tre cellepermeable fargestoffer for å velge for β-celler, kvantifisere cellepopulasjonene som aktivt gjennomgår mitofagi og vurdere mitokondriemembranpotensial (MMP eller Δψm) samtidig.

Den første av disse fargestoffene er Fluozin-3-AM, en cellegjennomtrengelig Zn²⁺ indikator med en Ex / Em 494/516 nm¹³. Museøyer omfatter en heterogen populasjon av funksjonelt distinkte celler, inkludert α-, β-, δ- og PP-celler. β-celler utgjør omtrent 80% av cellene i museøya og kan skilles fra andre øycelletyper på grunn av deres høye Zn²⁺ konsentrasjon i insulingranulat^14,15, noe som muliggjør identifisering av β-celler som Fluozin-3-AM^høy populasjon. MtPhagy-fargestoffet, et pH-følsomt fargestoff som immobiliseres på mitokondrier via en kjemisk binding og avgir svak fluorescens, brukes også i denne protokollen¹⁶. Ved mitofaginduksjon inkorporeres skadede mitokondrier i det sure lysosomet, og MtPhagy-fargestoffet øker fluorescensintensiteten i det lave pH-miljøet (Ex / Em 561/570-700 nm).

I tillegg brukes tetrametylrhodamin, etylester (TMRE), til å vurdere MMP. TMRE er et cellegjennomtrengelig positivt ladet fargestoff (Ex / Em 552 / 575 nm) som er sekvestrert av sunne mitokondrier på grunn av den relative negative ladningen som opprettholdes av membranpotensialet¹⁷. Skadede eller usunne mitokondrier sprer membranpotensialet, noe som resulterer i redusert evne til å binde TMRE. Ved å bruke disse fargestoffene sammen, kan β-celler som gjennomgår mitofagi identifiseres som Fluozin^høyMtPhagy^høyTMRE^lav populasjon via flowcytometri. Siden mitofagi er en dynamisk snarere enn statisk prosess, ble denne protokollen optimalisert for å vurdere mitofagifluks ved bruk av valinomycin, en K ⁺-ionofor som induserer mitofagi etter spredning av MMP¹⁸. Sammenligning av mitofagi i nærvær og fravær av valinomycin muliggjør vurdering av mitofagifluks i forskjellige prøvegrupper.

Den fargebaserte naturen til den nåværende tilnærmingen gjør det mulig å ekstrapolere til menneskelige øyer og andre vanskelig å transfektere celletyper og omgå behovet for kompliserte dyreavlsordninger, i motsetning til mt-Keima-protokollen. Det overordnede målet med denne protokollen er å kvantifisere mitofagi i β-celler på encellenivå via to uavhengige flowcytometribaserte metoder. Til sammen beskriver denne protokollen to kraftige og komplementære metoder som muliggjør både presisjon og fleksibilitet i den kvantitative studien av mitokondriell kvalitetskontroll.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dyrestudiene presentert i denne protokollen ble gjennomgått og godkjent av University of Michigan Institutional Animal Care and Use Committee. Tjue uker gamle mannlige C57BL / 6J-mus, på enten en 15-ukers vanlig fettdiett (RFD) eller fettfattig diett (HFD), ble brukt til denne studien.

1. Vurdering av mitofagi via fargestoffbasert MtPhagy tilnærming (metode 1)

Mus holme forberedelse og behandling
1. Utfør holmekultur og valinomycineksponering ved å følge trinnene nedenfor.
  1. Isoler holmer fra enten vanlig fettdiett (RFD) eller fettrik diett (HFD, 60 kcal% fett¹⁹) mus, etter de tidligere beskrevne metodene ^2,10.
  2. Dyrkningsprøver over natten ved 37 °C i RPMI-medium supplert med 100 enheter/ml antimykotisk-antibiotika, 50 enheter/ml penicillin-streptomycin, 1 mM natriumpyruvat, 10 mM HEPES og 10 % føtal bovint serum (FBS) (se materialfortegnelse). Dette mediet vil bli referert til som "holmemedium".
  3. Bruk en pipette til å plukke 100 holmer per tilstand i 6 cm petriskåler i 2 ml holmemedium.
    MERK: Betingelser som brukes for denne protokollen: (1) Ufarget kontroll: ufargede RFD-holmer; (2) DAPI bare kontroll: RFD holmer farget med DAPI; (3) Fluozin-3-AM bare kontroll: RFD holmer farget med Fluozin-3-AM; (4) MtPhagy eneste kontroll: RFD holmer farget med MtPhagy; (5) TMRE bare kontroll: RFD holmer farget med TMRE; (6) RFD ubehandlet: RFD-holmer farget med MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM og DAPI; (7) Valinomycin-eksponerte RFD-øyer: RFD-øyer utsatt for valinomycin og farget med MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM og DAPI; (8) HFD ubehandlet: HFD-øyer farget med MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM og DAPI; (9) Valinomycin-eksponerte HFD-øyer: HFD-øyer utsatt for valinomycin og farget med MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM og DAPI.
  4. For tilstander (7) og (9) (se MERK ovenfor) eksponert for valinomycin, tilsett 2 μL av 250 nΜ valinomycinstamme (se materialfortegnelse) til holmer i petriskålen i 3 timer for å indusere mitofagi.
2. Utfør enkeltcelledissosiasjon.
  1. Etter 3 timers valinomycineksponering, velg 100 øyer fra hver tilstand i separate mikrosentrifugerør ved hjelp av en pipette.
  2. Spinn holmer ved 350 x g i 1 min ved 10 °C og kast supernatanten med en pipette.
  3. Vaskprøver 2x med 1 ml 1x fosfatbufret saltvann (PBS), med sentrifugeringstrinn (350 x g/1 min, 10 °C) mellom hver vask. Kast supernatanten med en pipette etter hver vask.
  4. For å dissosiere øyer i enkeltceller, tilsett 500 μL 0,05% trypsin (forvarmet til 37 ° C) til mikrosentrifugerøret i en prøve for å forhindre overfordøyelse av øyer. Pipett opp og ned gjentatte ganger til holmene er synlig spredt.
  5. Tilsett umiddelbart 1 ml forvarmet holmemedium for å nøytralisere trypsin. Gjenta trypsinisering og nøytralisering for hver prøve, en om gangen.
  6. Spinnprøver ved 500 x g i 5 minutter ved 10 °C. Fjern supernatanten med en pipette, pass på at pelleten ikke forstyrres.
    MERK: Pellet vil være delikat for prøver utsatt for valinomycin.
  7. Vaskprøver 2x med RPMI-medium, ingen fenolrødt, supplert med 100 enheter/ml antimykotisk-antibiotika, 50 enheter/ml penicillin-streptomycin, 1 mM natriumpyruvat, 10 mM HEPES og 10% bovint serumalbumin (BSA). Dette mediet vil bli referert til som "holmestrømningsmedium". Inkluder sentrifugeringstrinn (350 x g/1 min, 10 °C) mellom hver vask. Kast supernatanten med en pipette etter hver vask.
3. Flekk celler med MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM og DAPI for å forberede for flowcytometri.
  1. Resuspender holmeprøver i 500 μL holmestrømningsmedium.
  2. Tilsett 0,25 μL 100 μM MtPhagy stock (se materialfortegnelse) til rør som mottar MtPhagy fargestoff (tilstand 4, 6, 7, 8 og 9, NOTE til trinn 1.1.1).
  3. Tilsett 0,25 μL 100 μM TMRE-lager (se materialfortegnelse) til rør som mottar TMRE-fargestoff (tilstand 5, 6, 7, 8 og 9).
  4. Tilsett 0,25 μL 1 mM Fluozin-3-AM-stamstoff (se materialfortegnelse) til rør som mottar Fluozin-3-AM-fargestoff (forhold 3, 6, 7, 8 og 9).
  5. Vortexrør ved lav hastighet i 5 s å blande.
  6. Pakk mikrosentrifugerørene inn i aluminiumsfolie for å beskytte mot lys og inkuber ved 37 °C i 30 minutter. Halvveis gjennom inkubasjon, virvelrør ved lav hastighet for 5-10 s å blande.
  7. Etter inkubering, sentrifugeprøver ved 350 x g i 1 min ved 10 °C. Kast supernatanten med en pipette.
  8. Resuspendere prøver i 500 μL holmestrømningsmedium. Legg til 0,2 μg/ml DAPI (se materialfortegnelse) til betingelsene 2, 6, 7, 8 og 9.
  9. Spinnprøver ved 350 x g i 1 minutt ved 10 °C. Kast supernatanten med en pipette og resuspender i 500 mikrol øystrømningsmedium.
  10. Legg prøver på is.
Flowcytometri
1. Oppstart av instrumentet (se Materialliste).
  MERK: Ethvert flowcytometer med passende filtre vil fungere. Følgende filtre ble brukt i denne studien: (1) VL1 for DAPI: Eksitasjon / utslipp - 405 nm / 440 nm (50 nm); (2) BL1 for Fluozin-3-AM: Eksitasjon / utslipp - 488 nm / 530 nm (30 nm); (3) BL2 for MtPhagy fargestoff: Eksitasjon / utslipp - 488 nm / 590 nm (40 nm); (4) YL1 for TMRE: Eksitasjon / utslipp - 561 nm / 585 nm (16 nm).
2. Juster spenningene for fremover (FSC) og sidespredning (SSC) for å sikre at cellepopulasjoner er i sentrum av spredningsplottet. For denne protokollen var spenningene som ble brukt 120 V for FSC og 260 V for SSC for å sikre at cellene faller jevnt innenfor FSC-A vs. SSC-A-plottet (figur 1A).
3. Hvis du vil ekskludere ikke-enkeltceller, legger du til en rektangulær port på FSC-H vs. FSC-W etterfulgt av SSC-H vs. SSC-W (figur 1B,C).
4. Juster spenninger og kompensasjon for DAPI for å filtrere etter levende β-celler. Sett fluorescensporter for hver fluorofor som brukes basert på den ufargede RFD-prøven (figur 1D-F).
  MERK: Spenninger som brukes for hver kanal: (1) VL1: 320-360 V; (2) BL1: 300-340 V; (3) BL2: 260-300 V; (4) YL1: 300-340 V.
5. Når portene er etablert, samle inn 10 000 hendelser per prøve.
  MERK: Ved hjelp av denne gating-tilnærmingen ble mitofaginivåer under basale forhold og ved valinomycininduksjon vurdert i både RFD- og HFD-øyer (figur 2).
6. Lagre data som FCS-filer for analyse.

2. Vurdering av mitofagi ved hjelp av den genetisk kodede mt-Keima reporteren (metode 2)

Mus holme forberedelse og single-cell dissosiasjon
1. Utfør holmekultur og valinomycineksponering ved å følge trinnene nedenfor.
  1. Isoler pankreasøyer fra villtype (WT) og mt-Keima/+ (mt-Keima) mus⁶. I denne metoden ble 20 uker gamle mannlige WT eller mt-Keima / + matet RFD-mus brukt.
  2. Dyrkningsprøver over natten ved 37 °C i holmemedium.
  3. Bruk en pipette til å plukke 100 holmer per tilstand i 6 cm petriskåler med 2 ml holmemedium.
    MERK: Betingelser som brukes for denne protokollen: (1) Ufarget kontroll: Ufargede WT-holmer; (2) DAPI bare kontroll: WT holmer farget med DAPI; (3) Fluozin-3-AM bare kontroll: WT holmer farget med Fluozin-3-AM; (4) mt-Keima bare kontroll: Unstained mt-Keima / + holmer; (5) Ubehandlet: mt-Keima/+ holmer farget med Fluozin-3-AM og DAPI; (6) Valinomycin: mt-Keima/+ øyer utsatt for valinomycin og farget med Fluozin-3-AM og DAPI.
  4. For tilstand (6) med valinomycineksponering, tilsett 2 μL av 250 nM valinomycinbestand til holmer i petriskål i 3 timer for å indusere mitofagi.
2. Utfør single-cell dissosiasjon.
  1. Utfør trinn for dissosiasjon av enkeltceller, som beskrevet i trinn 1.1.2.
3. Flekkceller med Fluozin-3-AM og DAPI.
  1. Resuspender holmeprøver i 500 μL holmestrømningsmedium.
  2. Tilsett 0,25 μL 1 mM Fluozin-3-AM-lager til rør som mottar Fluozin-3-AM-fargestoff (forhold 3, 5 og 6).
  3. Inkuber celler ved 37 °C og fortsett til DAPI-behandling, som beskrevet i trinn 1.1.3.5-1.3.10.
Flowcytometri
1. Oppstart av instrumentet. Ethvert flowcytometer med passende filtre vil fungere.
  MERK: Følgende filtre ble brukt i denne studien: (1) VL1 for DAPI: Eksitasjon / utslipp - 405 nm / 440 nm (50 nm); (2) BL1 for Fluozin-3-AM: Eksitasjon / utslipp - 488 nm / 530 nm (30 nm); (3) VL3 for mt-Keima nøytral: Eksitasjon / utslipp - 405 nm / 603 nm (48 nm); (4) YL2 for mt-Keima syre: Eksitasjon / utslipp - 561 nm / 620 nm (15 nm).
2. Juster FSC- og SSC-spenninger og ekskluder ikke-enkeltceller som beskrevet i trinn 1.2.2-1.2.3 (figur 3A-C).
3. Juster spenninger og kompensasjon for DAPI, Fluozin-3-AM og mt-Keima ved hjelp av ufargede og enkeltpositive kontroller (forhold 1-4) for å sikre at fluorescenspositive cellepopulasjoner kan skilles fra ufargede celler. Når passende kompensasjon er brukt på hver kanal, setter du opp DAPI negativ port og Fluozin-3-AM positive porter for å filtrere etter levende β-celler (figur 3D-E).
4. Sett opp et trekant gating skjema ved hjelp av mt-Keima positiv prøve (tilstand 4) for å identifisere sure og nøytrale cellepopulasjoner (figur 3F).
  MERK: Spenninger som vanligvis brukes for hver kanal: (1) VL1: 320-340 V; (2) BL2: 260-280 V; (3) VL3: 280-300 V; (4) YL2: 280-300 V.
5. Når portene er etablert, samle inn 10 000 hendelser per prøve. Reguleringsskjemaer for vilkår 5 og 6 er illustrert i figur 3A-G.
6. Lagre data som FCS-filer for analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vurdering av mitofagi via fargestoffbasert MtPhagy-tilnærming
Denne fargestoffbaserte tilnærmingen ble optimalisert for å analysere mitofagifluks i primære mus β-celler uten behov for en genetisk reporter, ved hjelp av Fluozin-3-AM, TMRE og MtPhagy samt DAPI for å utelukke døde celler. Ved å parre disse fargestoffene med valinomycin for å indusere mitofagi, skisserer denne protokollen en fargestoffbasert metode for selektivt å måle mitofagifluks i primære mus β-celler¹⁸. For dataene vist ved hjelp av denne MtPhagy-metoden ble både basal og valinomycin-indusert mitofagi analysert i øyer isolert fra enten vanlig fettdiett (RFD) eller høyt fett diett (HFD, 60 kcal% fett) matet mus for å vurdere effekten av metabolsk stress på mitofagifluks. For å identifisere populasjonen av interesse, ble cellene styrt ved hjelp av ubehandlede RFD-øyer. FSC- og SSC-spenninger ble først justert for å oppnå en jevn fordeling av celler på et SSC-A vs. FSC-A-plott (figur 1A). For å velge for enkeltceller, både FSC-H vs. FSC-W og SSC-H vs. SSC-W-plott ble brukt, hvor multipletter ble ekskludert på grunn av deres høyere breddesignalverdier sammenlignet med enkeltceller (figur 1B,C). Deretter ble DAPI-negative celler valgt for å utelukke døde celler²⁰ (figur 1D). Etter etablering av primære porter ble enkeltfargede kontroller benyttet for å etablere fluorescensporter for Fluozin-3-AM, MtPhagy og TMRE (figur 1E-G) samt kompensasjonskontroller for flerfarget fluorescensstrømningscytometri.

Når disse primær- og fluorescensportene ble etablert, ble β-celler med høy utnyttelse av mitofagi definert som Fluozin^highMtPhagy^highTMRE^lowpopulation in quadrant 3 (Q3) ved bruk av RFD uten valinomycineksponering (figur 1H). Ved hjelp av denne gatingstrategien ble basale og valinomycininduserte mitofaginivåer karakterisert i både RFD- og HFD-øyer (figur 2). For å kvantifisere mitofagifluks, basal vs. Valinomycininduserte mitofaginivåer ble sammenlignet ved bruk av følgende forhold:

Equation 1

Ved å bruke dette forholdet ble mitofagifluks kvantifisert og sammenlignet i RFD vs. HFD-β-celler for å vurdere forskjeller i mitofagi etter induksjon av fedme og perifer insulinresistens. Kvantifisering av mitofagifluks i RFD vs. HFD-prøver er vist i figur 2E. Dette resultatet fremhever muligheten for denne analysen for å kvantifisere mitofagi i β-celler ved hjelp av en enkel fargestoffbasert tilnærming. Denne metoden kan også brukes i menneskelige øyer, vanskelig å transfektere celler og øyer isolert fra komplekse genetiske modeller hvor kryssing til mt-Keima transgen modell ville være tungvint.

Vurdering av mitofagi ved hjelp av den genetisk kodede mt-Keima reporteren
Mt-Keima er et dobbelt eksitasjonsfluorescerende protein fusjonert med en Cox8-lokaliseringssekvens som gjør det mulig å målrette mot den indre mitokondriemembranen. Den bimodale fluorescerende egenskapen til mt-Keima gjør det mulig å bytte eksitasjonsspektra fra nøytral (405 nm) til sur (561 nm) bølgelengde, avhengig av pH i det intracellulære rommet⁶. Dette muliggjør en robust ratiometrisk fluorescensanalyse av mitofagi, hvor en økning i surt til nøytralt forhold indikerer mitofaginduksjon. I denne protokollen ble Fluozin-3-AM også brukt til å selektere for β-celler via flowcytometri. I disse representative studiene ble mitofagifluks vurdert ved hjelp av øyer isolert fra mus som fikk en RFD-diett^10,11. FSC- og SSC-spenninger ble først justert for å oppnå en jevn fordeling av celler på en SSC-A vs. FSC-A-plottet (figur 3A). For å velge for enkeltceller, både FSC-H vs. FSC-W og SSC-H vs. SSC-W-plott ble brukt, hvor multipletter ble ekskludert på grunn av deres høyere bredde signalverdier sammenlignet med enkeltceller (figur 3B, C). Spennings- og gatingstrategien for DAPI og Fluozin-3-AM ble bestemt ved hjelp av enkeltbeisede øyer (figur 3D,E). Triangelporter for de sure og nøytrale populasjonene ble deretter identifisert ved hjelp av mt-Keima positiv prøve uten valinomycineksponering (figur 3F).

Når disse primære og fluorescensportene ble etablert, ble mitofagifluks vurdert ved hjelp av basale og valinomycininduserte endringer i mt-Keima fluorescens (figur 3F,G). For å kvantifisere mitofagifluks, basal mitofagi vs. Valinomycininduserte nivåer ble sammenlignet ved hjelp av følgende forhold:

Equation 2

Ved hjelp av dette forholdet ble mitofagifluks kvantifisert i RFD-celler. Kvantifisering av dette resultatet er vist i figur 3H. Det er viktig at disse resultatene er sammenlignbare med resultatene i RFD-holmer generert ved hjelp av MtPhagy-tilnærmingen (figur 3H).

Figur 1: Gating scheme for MtPhagy metoden. (A) Flytplott som viser gatingskjema for å velge for alle celler. (B) Gating for å velge for singleter basert på FSC-H vs. FSC-W og (C) SSC-H vs. SSC-W. (D) Gating for DAPI-negative celler for å utelukke døde celler. (E) Gating for Fluozin-3-AM^høyeceller for å velge for β-celler. (F) Gating skjema for MtPhagy fargestoff for å identifisere MtPhagy^høyog MtPhagy^lavcelle populasjoner. (G) Gating skjema for TMRE å identifisere TMRE^høyog TMRE^lavcelle populasjoner. (H) Kvadrant gating skjema etablert med ubehandlede RFD øyer for å identifisere Fluozin^høyMtPhagy^høyTMRE^laveceller i kvadrant 3 (Q3) som β-celler gjennomgår mitofagi. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2: Vurdering av mitofagifluksforskjeller i mus β-celler etter metabolsk stress ved bruk av MtPhagy gating-skjemaet. Representative flowcytometriplott av (A) ubehandlede RFD-β-celler, (B) ubehandlede HFD-β-celler, (C) valinomycineksponerte RFD-β-celler og (D) valinomycineksponerte HFD-β-celler. (E) Kvantifisering av mitofagifluks i β-celler, beregnet ved hjelp av et forhold mellom MtPhagy^høyeTMRE^lave celler eksponert for valinomycin og MtPhagy^høyeTMRE^lave celler som ikke er utsatt for valinomycin, for både RFD- og HFD-prøver. *p < 0,05 med Student sin uparede t-test. n = 3/gruppe. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3: Gating skjema for mt-Keima metoden og sammenligning mellom begge metodene. (A) Flytplott som viser gatingskjema for å velge for alle celler. (B) Gating for å velge for singleter basert på FSC-H vs. FSC-W og (C) SSC-H vs. SSC-W. (D) Gating for DAPI-negative celler for å utelukke døde celler. (E) Gating for Fluozin-3-AM^høyeceller for å velge for β-celler. (F) Representative flowcytometriplott av mt-Keima/+ ubehandlede celler og (G) mt-Keima/+ valinomycin-eksponerte celler. (H) Kvantifisering av mitofagifluks i β-celler fra RFD-fôrede mus, beregnet ved å bruke et forhold mellom de sure/nøytrale cellene eksponert for valinomycin og forholdet mellom de sure/nøytrale cellene som ikke ble eksponert for valinomycin ved bruk av mt-Keima-metoden og sammenlignet med MtPhagy-metoden (data for MtPhagy-protokollen opprinnelig vist i figur 2E). n = 3/gruppe. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokollen beskrev to komplementære metoder for å kvantifisere mitofagifluks i dissosierte primære museøyer. Ved hjelp av mt-Keima-metoden ble en økning i mitofagi kvantifisert som et økt forhold mellom sure (561 nm) / nøytrale (405 nm) celler, mens i MtPhagy-metoden ble økt mitofagifluks kvantifisert som en økning i Fluozin^høyMtPhagy^høyTMRE^lavcellepopulasjon. Disse metodene tillater raske, kvantitative og β-cellespesifikke vurderinger av mitofagifluks.

Begge metodene er enkle tilnærminger. Imidlertid er visse trinn i denne protokollen avgjørende for å oppnå kvalitet og reproduserbare resultater. Disse trinnene inkluderer: (1) riktig holme dissosiasjon for å oppnå en enkelt celle suspensjon, men mild nok til å sikre holme levedyktighet, (2) forsiktig etablering av gating for å korrekt identifisere populasjoner av interesse, og (3) objektiv kvantifisering av flowcytometri data via programvareverktøy for å sikre en objektiv vurdering av mitophagy fluks.

Når du velger hvilken metode som skal brukes, bør celletypen og arten av de genetiske modellene som brukes, vurderes. Mt-Keima-metoden, enten brukt in vivo eller transfeksjonert in vitro, er en høyt sitert og vel ansett metode for mitofagivurdering ved flowcytometri eller levende celleavbildning²¹. Mens den fargebaserte MtPhagy-metoden er en nyere tilnærming sammenlignet med genetiske reportere, er det tilfeller der bruken kan foretrekkes fremfor mt-Keima. Faktisk overvinner MtPhagy-metoden behovet for transfeksjon eller komplekse avlsordninger, og MtPhagy-farging tar bare 30 minutter og utføres umiddelbart før flowcytometri. MtPhagy-tilnærmingen kan med hell brukes i vanskelige å transfektere primære menneskelige øyprøver også. Denne protokollen, som er avhengig av enten pH-følsomme mitokondrielle fargestoffer eller sonder for å måle mitofagi direkte, er forskjellig fra en tidligere tilnærming fra Mauro-Lizcano et. al som benyttet membranpotensialsensitivt MitoTracker Deep Red-fargestoff og krevde bruk av mitofagi og lysosomale hemmere for å kvantifisere mitofagifluks ved flowcytometri²². Som Mauro-Lizcano et. al-metoden er ikke testet i øyer, det er vanskelig å direkte sammenligne den med effekten av MtPhagy eller mt-Keima metodene beskrevet her. Samlet sett gir kombinasjonen av disse metodene totalt et økende antall alternativer for å nøye vurdere mitofagifluks i svært kvantitative levende enkeltcelleanalyser.

En ulempe for begge metodene er deres inkompatibilitet med cellefiksering. Selv om begge metodene er kompatible med levende celleavbildningsmetoder, forstyrrer cellefiksering pH-gradienten til både MtPhagy og mt-Keima over den lysosomale membranen ^7,16. Som et alternativ har bruk av mitoQC mitophagy reporter i faste prøver tidligere vært benyttet⁷. I tillegg er en begrensning for begge metodene behovet for å dissosiere holmer før flowcytometri, noe som kan påvirke cellens levedyktighet. Derfor er det viktig å flekke celler med DAPI for å overvåke cellens levedyktighet etter holme dissosiasjon og sikre at alle prøver behandles konsekvent. Etter DAPI-farging hadde prøvene i gjennomsnitt 12,7 % ± 7,4 døde celler (figur 1D), noe som indikerer at >80 % av cellene i hver prøve kunne brukes til analyse. Overvåking av cellenes levedyktighet på hvert stadium (etter øyisolering, kultur og deretter dissosiasjon) kan i tillegg være nyttig for å få kunnskap om celleoverlevelse ved hvert trinn i prosedyren. Variabilitet i timing mellom holmeisolering og enkeltcelledissosiasjon kan også påvirke cellens levedyktighet og resultater. Derfor anbefales det å være konsistent med timing på tvers av alle eksperimenter.

Siden mitokondriell kvalitetskontroll er avgjørende for β-celle helse og funksjon, kan strenge vurderinger av mitofagi ved hjelp av tradisjonelle biokjemiske eller bildebehandlingsmetoder (inkludert omsetning av mitokondrielle ytre membranproteiner, mitokondriell lokalisering til autofagosomer eller lysosomer og elektronmikroskopi) være utfordrende og tidkrevende. Derfor er utviklingen av effektive og robuste mitofagi-reportersystemer avgjørende. Både mt-Keima og MtPhagy tilnærmingen er effektiv og tillater kvantitative vurderinger av mitophagy fluks. Disse to teknikkene tillater både fleksibilitet og presisjon i å adressere β-celle mitokondriell kvalitetskontroll og undersøke interorganelle interaksjoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

SAS har mottatt tilskuddsstøtte fra Ono Pharmaceutical Co., Ltd. og er konsulent for Novo Nordisk.

Acknowledgments

E.L-D. anerkjenner støtte fra NIH (T32-AI007413 og T32-AG000114). SAS anerkjenner støtte fra JDRF (COE-2019-861), NIH (R01 DK135268, R01 DK108921, R01 DK135032, R01 DK136547, U01 DK127747), Department of Veterans Affairs (I01 BX004444), Brehm-familien og Anthony-familien.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibiotic-Antimycotic	Life Technologies	15240-062
Attune NxT Flow Cytometer	Thermofisher Scientific	A24858
Dimethyl Sulfoxide	Sigma-Aldrich	317275
Fatty Acid Free heat shock BSA powder	Equitech	BAH66
Fetal bovine serum	Gemini Bio	900-108
Fluozin-3AM	Thermofisher Scientific	F24195	100 μg Fluozin-3AM powder reconstituted in 51 μL DMSO and 51 μL Pluronic F-127 to reach 1 mM stock.
Gibco RPMI 1640 Medium	Fisher Scientific	11-875-093
HEPES (1M)	Life Technologies	15630-080
MtPhagy dye	Dojindo	MT02-10	5 μg MtPhagy powder reconstituted with 50 μL DMSO to reach 100 μM stock.
MtPhagy dye	Dojindo	MT02-10
Penicillin-Streptomycin (100x)	Life Technologies	15140-122	1x Solution used in procotol by diluting 1:10 in ddH₂O
Phosphate buffered saline, 10x	Fisher Scientific	BP399-20	1x Solution used in procotol by diluting 1:10 in ddH₂O
Sodium Pyruvate (100x)	Life Technologies	11360-070	5 μg MtPhagy powder reconstituted with 50 μL DMSO to reach 100 μM stock.
TMRE [Tetramethylrhodamine, ethyl ester, perchlorate]	Anaspec	AS-88061	TMRE powder reconstituted in DMSO to reach 100 μM stock.
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Thermofisher Scientific	25300054
Valinomycin	Sigma	V0627	Valinomycin powder reconsituted in DMSO to reach 250 nM stock.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

Kaufman, B. A., Li, C., Soleimanpour, S. A. Mitochondrial regulation of β-cell function: maintaining the momentum for insulin release. Molecular Aspects of Medicine. 42, 91-104 (2015).
Soleimanpour, S. A., et al. The diabetes susceptibility gene Clec16a regulates mitophagy. Cell. 157 (7), 1577-1590 (2014).
Pearson, G., et al. Clec16a, Nrdp1, and USP8 form a ubiquitin-dependent tripartite complex that regulates β-cell mitophagy. Diabetes. 67 (2), 265-277 (2018).
Hattori, N., Saiki, S., Imai, Y. Regulation by mitophagy. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 53, 147-150 (2014).
Berezhnov, A. V., et al. Intracellular pH modulates autophagy and mitophagy. Journal of Biological Chemistry. 291 (16), 8701-8708 (2016).
Sun, N., et al. Measuring in vivo mitophagy. Molecular Cell. 60 (4), 685-696 (2015).
McWilliams, T. G., et al. mito-QC illuminates mitophagy and mitochondrial architecture in vivo. Journal of Cell Biology. 214 (3), 333-345 (2016).
Aoyagi, K., et al. A new beta cell-specific mitophagy reporter mouse shows that metabolic stress leads to accumulation of dysfunctional mitochondria despite increased mitophagy. Diabetologia. 66 (1), 147-162 (2023).
Ma, X., Ding, W. X. A fluorescence imaging based-assay to monitor mitophagy in cultured hepatocytes and mouse liver. Liver Research. 5 (1), 16-20 (2021).
Sidarala, V., et al. Mitophagy protects β cells from inflammatory damage in diabetes. JCI Insight. 5 (24), 141138 (2020).
Gingerich, M. A., et al. An intrinsically disordered protein region encoded by the human disease gene CLEC16A regulates mitophagy. Autophagy. 19 (2), 525-543 (2023).
Sun, N., Malide, D., Liu, J., Rovira, I. I., Combs, C. A., Finkel, T. A fluorescence-based imaging method to measure in vitro and in vivo mitophagy using mt-Keima. Nature Protocols. 12 (8), 1576-1587 (2017).
Zhao, J., Bertoglio, B. A., Gee, K. R., Kay, A. R. The zinc indicator FluoZin-3 is not perturbed significantly by physiological levels of calcium or magnesium. Cell Calcium. 44 (4), 422-426 (2008).
Da Silva Xavier, G. The Cells of the Islets of Langerhans. Journal of Clinical Medicine. 7 (3), 54 (2018).
Thapa, B., et al. Imaging β-cell function using a zinc-responsive MRI contrast agent may identify first responder islets. Frontiers in Endocrinology. 12, 809867 (2022).
Iwashita, H., et al. Live cell imaging of mitochondrial autophagy with a novel fluorescent small molecule. ACS Chemical Biology. 12 (10), 2546-2551 (2017).
Crowley, L. C., Christensen, M. E., Waterhouse, N. J. Measuring mitochondrial transmembrane potential by TMRE staining. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (12), 087361 (2016).
Klein, B., Wörndl, K., Lütz-Meindl, U., Kerschbaum, H. H. Perturbation of intracellular K(+) homeostasis with valinomycin promotes cell death by mitochondrial swelling and autophagic processes. Apoptosis. 16 (11), 1101-1117 (2011).
Ji, Y., et al. Toll-like receptors TLR2 and TLR4 block the replication of pancreatic β cells in diet-induced obesity. Nature Immunology. 20 (6), 677-686 (2019).
Sauvat, A., et al. Quantification of cellular viability by automated microscopy and flow cytometry. Oncotarget. 6 (11), 9467-9475 (2015).
Liu, Y. T., et al. Mt-Keima detects PINK1-PRKN mitophagy in vivo with greater sensitivity than mito-QC. Autophagy. 17 (11), 3753-3762 (2021).
Mauro-Lizcano, M., et al. New method to assess mitophagy flux by flow cytometry. Autophagy. 11 (5), 833-843 (2015).

Biology

Komplementære tilnærminger for å forhøre mitofagifluks i bukspyttkjertelen β-celler

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.