Summary
Dit protocol schetst twee methoden voor de kwantitatieve analyse van mitofagie in pancreas-β-cellen: ten eerste een combinatie van celdoorlatende mitochondriën-specifieke kleurstoffen en ten tweede een genetisch gecodeerde mitofagie-reporter. Deze twee technieken vullen elkaar aan en kunnen worden ingezet op basis van specifieke behoeften, waardoor flexibiliteit en precisie mogelijk zijn bij het kwantitatief aanpakken van mitochondriale kwaliteitscontrole.
Abstract
Mitofagie is een kwaliteitscontrolemechanisme dat nodig is om een optimale mitochondriale functie te behouden. Disfunctionele β-cel mitofagie resulteert in onvoldoende insulineafgifte. Geavanceerde kwantitatieve beoordelingen van mitofagie vereisen vaak het gebruik van genetische verslaggevers. Het mt-Keima-muismodel, dat een mitochondriën-gerichte pH-gevoelige dual-excitatie ratiometrische sonde uitdrukt voor het kwantificeren van mitofagie via flowcytometrie, is geoptimaliseerd in β-cellen. De verhouding tussen zure en neutrale mt-Keima-golflengte-emissies kan worden gebruikt om mitofagie robuust te kwantificeren. Het gebruik van genetische mitofagieverslaggevers kan echter een uitdaging zijn bij het werken met complexe genetische muismodellen of moeilijk te transfecteren cellen, zoals primaire menselijke eilandjes. Dit protocol beschrijft een nieuwe complementaire, op kleurstof gebaseerde methode om β-celmitofagie in primaire eilandjes te kwantificeren met behulp van MtPhagy. MtPhagy is een pH-gevoelige, celdoorlatende kleurstof die zich ophoopt in de mitochondriën en de fluorescentie-intensiteit verhoogt wanneer mitochondriën zich in omgevingen met een lage pH bevinden, zoals lysosomen tijdens mitofagie. Door de MtPhagy-kleurstof te combineren met Fluozin-3-AM, een Zn2+ -indicator die selecteert voor β-cellen, en Tetramethylrhodamine, ethylester (TMRE) om het mitochondriale membraanpotentieel te beoordelen, kan mitofagieflux specifiek in β-cellen worden gekwantificeerd via flowcytometrie. Deze twee benaderingen zijn zeer complementair en zorgen voor flexibiliteit en precisie bij het beoordelen van de mitochondriale kwaliteitscontrole in tal van β-celmodellen.
Introduction
Pancreas-β-cellen produceren en scheiden insuline af om aan de metabole eisen te voldoen, en β-celdisfunctie is verantwoordelijk voor hyperglykemie en het ontstaan van diabetes bij zowel type 1- als type 2-diabetes. β-cellen koppelen het glucosemetabolisme aan insulinesecretie via mitochondriale energetica en metabole output, die afhankelijk zijn van een reserve van functionele mitochondriale massa 1,2,3. Om een optimale functie van β cellen te behouden, vertrouwen β-cellen op mitochondriale kwaliteitscontrolemechanismen om verouderde of beschadigde mitochondriën te verwijderen en functionele mitochondrialemassa te behouden. Selectieve mitochondriale autofagie, ook bekend als mitofagie, is een belangrijk onderdeel van de mitochondriale kwaliteitscontroleroute.
Beoordelingen van mitofagie in levende cellen zijn vaak afhankelijk van veranderingen in de mitochondriale pH die optreden tijdens mitofagie. Mitochondriën hebben een licht alkalische pH en gezonde mitochondriën bevinden zich normaal gesproken in het pH-neutrale cytosol. Tijdens mitofagie worden beschadigde of disfunctionele mitochondriën selectief opgenomen in autofagosomen en uiteindelijk opgeruimd in zure lysosomen5. Verschillende in vivo transgene mitofagie-reportermuismodellen, zoals mt-Keima6, mitoQC7 en CMMR8, evenals transfecteerbare mitofagie-sondes, zoals de Cox8-EGFP-mCherry-plasmide9, maken gebruik van deze pH-verandering om kwantitatieve beoordelingen van mitofagie te geven. Het gebruik van transgene muizen die de mt-Keima pH-gevoelige dual-excitatie ratiometrische sonde tot expressie brengen, is geoptimaliseerd voor mitofagiebeoordelingen in eilandjes en β-cellen via flowcytometrie10,11. De verhouding tussen zure en neutrale mt-Keima-golflengte-emissies (de verhouding tussen zure 561 nm en neutrale 480 nm excitatie) kan worden gebruikt om mitofagie 6,12 robuust te kwantificeren.
Dit protocol beschrijft een geoptimaliseerde benadering om mitofagieflux te beoordelen in primaire eilandjes en β-cellen geïsoleerd uit mt-Keima transgene muizen 10,11. Hoewel mt-Keima een zeer gevoelige sonde is, vereist het ofwel gecompliceerde fokprogramma's voor dieren of de transfectie van cellen, wat vaak een uitdaging kan zijn wanneer het werkt in combinatie met andere genetische modellen of met primaire menselijke eilandjes. Bovendien kan het gebruik van meerdere fluorescentielasers en -detectoren om neutrale en zure celpopulaties te identificeren, het combinatorische gebruik van andere fluorescerende reporters beperken.
Om deze uitdagingen het hoofd te bieden, beschrijft dit protocol ook een aanvullende, op kleurstof gebaseerde methode met één fluorescerend kanaal voor robuuste detectie van mitofagie in β-cellen van geïsoleerde muiseilandjes. Deze benadering, ook wel de MtPhagy-methode genoemd, maakt gebruik van een combinatie van drie celdoorlatende kleurstoffen om β-cellen te selecteren, de celpopulaties te kwantificeren die actief mitofagie ondergaan en tegelijkertijd het mitochondriale membraanpotentieel (MMP of Δψm) te beoordelen.
De eerste van deze kleurstoffen is Fluozin-3-AM, een celdoorlatende Zn2+ indicator met een Ex/Em 494/516 nm13. Muizeneilandjes bestaan uit een heterogene populatie van functioneel verschillende cellen, waaronder α-, β-, δ- en PP-cellen. β-cellen omvatten ongeveer 80% van de cellen in het muiseilandje en kunnen worden onderscheiden van andere eilandjesceltypen door hun hoge Zn2+-concentratie in insulinekorrels14,15, waardoor β-cellen kunnen worden geïdentificeerd als de Fluozin-3-AMhoge populatie. De MtPhagy-kleurstof, een pH-gevoelige kleurstof die via een chemische binding op mitochondriën wordt geïmmobiliseerd en zwakke fluorescentie afgeeft, wordt ook in dit protocol gebruikt16. Bij mitofagie-inductie worden beschadigde mitochondriën opgenomen in het zure lysosoom en verhoogt de MtPhagy-kleurstof de fluorescentie-intensiteit in de omgeving met een lage pH (Ex/Em 561/570-700 nm).
Daarnaast wordt tetramethylrhodamine, ethylester (TMRE), gebruikt om MMP te beoordelen. TMRE is een celdoorlatende positief geladen kleurstof (Ex/Em 552/575 nm) die wordt afgezonderd door gezonde mitochondriën vanwege de relatieve negatieve lading die wordt ondersteund door hun membraanpotentiaal17. Beschadigde of ongezonde mitochondriën verdrijven hun membraanpotentieel, wat resulteert in een verminderd vermogen om TMRE te sekwestreren. Door deze kleurstoffen samen te gebruiken, kunnen β-cellen die mitofagie ondergaan, worden geïdentificeerd als de FluozinhogeMtPhagyhogeTMRElage populatie via flowcytometrie. Aangezien mitofagie een dynamisch in plaats van statisch proces is, is dit protocol geoptimaliseerd om mitofagieflux te beoordelen met behulp van valinomycine, een K+-ionofoor die mitofagie induceert na dissipatie van MMP18. Vergelijking van mitofagie in de aan- en afwezigheid van valinomycine maakt het mogelijk om de mitofagieflux in verschillende steekproefgroepen te beoordelen.
Het op kleurstoffen gebaseerde karakter van de huidige aanpak maakt het mogelijk om het te extrapoleren naar menselijke eilandjes en andere moeilijk te transfecten celtypen en omzeilt de noodzaak van gecompliceerde fokprogramma's voor dieren, in tegenstelling tot het mt-Keima-protocol. Het overkoepelende doel van dit protocol is om mitofagie in β-cellen op het niveau van één cel te kwantificeren via twee onafhankelijke op flowcytometrie gebaseerde methoden. Alles bij elkaar beschrijft dit protocol twee krachtige en complementaire methoden die zowel precisie als flexibiliteit mogelijk maken in de kwantitatieve studie van mitochondriale kwaliteitscontrole.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De dierstudies die in dit protocol worden gepresenteerd, zijn beoordeeld en goedgekeurd door de University of Michigan Institutional Animal Care and Use Committee. Voor deze studie werden mannelijke C57BL/6J-muizen van twintig weken oud, die ofwel een 15 weken durend normaal vetdieet (RFD) of een vetrijk dieet (HFD) volgden, gebruikt.
1. Beoordeling van mitofagie via de op kleurstof gebaseerde MtPhagy-benadering (methode 1)
- Bereiding en behandeling van muiseilandjes
- Voer eilandjeskweek en blootstelling aan valinomycine uit volgens de onderstaande stappen.
- Isoleer eilandjes van muizen met een normaal vetdieet (RFD) of een vetrijk dieet (HFD, 60 kcal% vet19), volgens de eerder beschreven methoden 2,10.
- Kweekeilandjesmonsters 's nachts bij 37 °C in RPMI-medium aangevuld met 100 eenheden/ml antimycoticum-antibioticum, 50 eenheden/ml penicilline-streptomycine, 1 mM natriumpyruvaat, 10 mM HEPES en 10% foetaal runderserum (FBS) (zie materiaaltabel). Dit medium wordt aangeduid als "eilandjesmedium".
- Pluk met een pipet 100 eilandjes per conditie in petrischaaltjes van 6 cm in 2 ml eilandjesmedium.
OPMERKING: Voorwaarden die voor dit protocol worden gebruikt: (1) Ongekleurde controle: ongekleurde RFD-eilandjes; (2) Alleen DAPI-controle: RFD-eilandjes gekleurd met DAPI; (3) Controle alleen op Fluozin-3-AM: RFD-eilandjes gekleurd met Fluozin-3-AM; (4) MtPhagy alleen controle: RFD-eilandjes gekleurd met MtPhagy; (5) Controle alleen TMRE: RFD-eilandjes gekleurd met TMRE; (6) RFD onbehandeld: RFD-eilandjes gekleurd met MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM en DAPI; (7) aan valinomycine blootgestelde RFD-eilandjes: RFD-eilandjes die zijn blootgesteld aan valinomycine en gekleurd zijn met MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM en DAPI; (8) HFD onbehandeld: HFD-eilandjes gekleurd met MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM en DAPI; (9) Aan valinomycine blootgestelde HFD-eilandjes: HFD-eilandjes die zijn blootgesteld aan valinomycine en gekleurd zijn met MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM en DAPI. - Voor de omstandigheden (7) en (9) (zie OPMERKING hierboven) die zijn blootgesteld aan valinomycine, voeg gedurende 3 uur 2 μl valinomycinebouillon van 250 nΜ (zie materiaaltabel) toe aan eilandjes in de petrischaal om mitofagie op te wekken.
- Voer dissociatie van één cel uit.
- Na 3 uur blootstelling aan valinomycine, kies 100 eilandjes van elke aandoening in afzonderlijke microcentrifugebuisjes met behulp van een pipet.
- Centrifugeer de eilandjes gedurende 1 minuut bij 10 °C op 350 x g en gooi het supernatans met een pipet weg.
- Was monsters 2x met 1 ml 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), met centrifugestappen (350 x g/1 min, 10 °C) tussen elke wasbeurt. Gooi het supernatans na elke wasbeurt weg met een pipet.
- Om eilandjes in afzonderlijke cellen te dissociëren, voegt u 500 μL 0,05% trypsine (voorverwarmd tot 37 °C) toe aan de microcentrifugebuis van één monster om oververtering van eilandjes te voorkomen. Pipetteer herhaaldelijk op en neer totdat de eilandjes zichtbaar verspreid zijn.
- Voeg onmiddellijk 1 ml voorverwarmd eilandje medium toe om trypsine te neutraliseren. Herhaal trypsinisatie en neutralisatie voor elk monster, één voor één.
- Centrifugeer de monsters gedurende 5 minuten bij 10 °C op 500 x g . Verwijder het supernatans met een pipet en zorg ervoor dat u de pellet niet verstoort.
OPMERKING: Pellet zal delicaat zijn voor monsters die zijn blootgesteld aan valinomycine. - Was monsters 2x met RPMI medium, geen fenolrood, aangevuld met 100 eenheden/ml antimycoticum-antibioticum, 50 eenheden/ml penicilline-streptomycine, 1 mM natriumpyruvaat, 10 mM HEPES en 10% runderserumalbumine (BSA). Dit medium wordt "eilandjesstroommedium" genoemd. Centrifugeer stappen (350 x g/1 min, 10 °C) tussen elke wasbeurt. Gooi het supernatans na elke wasbeurt weg met een pipet.
- Kleurcellen met MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM en DAPI ter voorbereiding op flowcytometrie.
- Resuspendeer eilandjesmonsters in 500 μL eilandjesstroommedium.
- Voeg 0,25 μl 100 μM MtPhagy-voorraad (zie materiaaltabel) toe aan buizen die MtPhagy-kleurstof ontvangen (voorwaarden 4, 6, 7, 8 en 9, OPMERKING bij stap 1.1.1).
- Voeg 0,25 μL 100 μM TMRE-materiaal (zie materiaaltabel) toe aan buizen die TMRE-kleurstof ontvangen (voorwaarden 5, 6, 7, 8 en 9).
- Voeg 0,25 μL van 1 mM Fluozin-3-AM voorraad (zie Materiaaltabel) toe aan tubes die Fluozin-3-AM kleurstof ontvangen (voorwaarden 3, 6, 7, 8 en 9).
- Vortex buizen op lage snelheid gedurende 5 s om te mengen.
- Wikkel microcentrifugebuisjes in aluminiumfolie ter bescherming tegen licht en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C. Halverwege de incubatie, vortex buizen op lage snelheid gedurende 5-10 s om te mengen.
- Centrifugeer de monsters na incubatie gedurende 1 minuut bij 10 °C bij 350 x g . Gooi het supernatans weg met een pipet.
- Resuspendeer monsters in een eilandjesstroommedium van 500 μl. Voeg 0,2 μg/ml DAPI (zie Materiaaltabel) toe aan de voorwaarden 2, 6, 7, 8 en 9.
- Centrifugeer de monsters op 350 x g gedurende 1 minuut bij 10 °C. Gooi het supernatans weg met behulp van een pipet en resuspendeer het in 500 μl eilandjesstroommedium.
- Leg de monsters op ijs.
- Voer eilandjeskweek en blootstelling aan valinomycine uit volgens de onderstaande stappen.
- Flowcytometrie
- Start het instrument in werking (zie Tabel met materialen).
OPMERKING: Elke flowcytometer met de juiste filters zal werken. In dit onderzoek werden de volgende filters gebruikt: (1) VL1 voor DAPI: Excitatie/Emissie - 405 nm/440 nm (50 nm); (2) BL1 voor Fluozin-3-AM: excitatie/emissie - 488 nm/530 nm (30 nm); (3) BL2 voor MtPhagy-kleurstof: excitatie/emissie - 488 nm/590 nm (40 nm); (4) YL1 voor TMRE: excitatie/emissie - 561 nm/585 nm (16 nm). - Pas de spanningen aan voor voorwaartse (FSC) en zijwaartse verstrooiing (SSC) om ervoor te zorgen dat celpopulaties zich in het midden van het spreidingsdiagram bevinden. Voor dit protocol werden spanningen gebruikt van 120 V voor FSC en 260 V voor SSC om ervoor te zorgen dat cellen gelijkmatig binnen de FSC-A vs. SSC-A-perceel (figuur 1A).
- Als u niet-afzonderlijke cellen wilt uitsluiten, voegt u een rechthoekige poort toe op FSC-H vs. FSC-W gevolgd door SSC-H vs. SSC-W (Figuur 1B,C).
- Pas de spanningen en compensatie voor DAPI aan om te filteren op levende β-cellen. Stel fluorescentiepoorten in voor elke gebruikte fluorofoor op basis van het ongekleurde RFD-monster (figuren 1D-F).
NOTITIE: Voltages gebruikt voor elk kanaal: (1) VL1: 320-360 V; (2) BL1: 300-340 V; (3) BL2: 260-300 V; (4) YL1: 300-340 V. - Zodra de poorten zijn vastgesteld, verzamelt u 10.000 gebeurtenissen per monster.
OPMERKING: Met behulp van deze poortbenadering werden mitofagieniveaus onder basale omstandigheden en bij inductie van valinomycine beoordeeld in zowel RFD- als HFD-eilandjes (Figuur 2). - Sla gegevens op als FCS-bestanden voor analyse.
- Start het instrument in werking (zie Tabel met materialen).
2. Beoordeling van mitofagie met behulp van de genetisch gecodeerde mt-Keima-reporter (methode 2)
- Bereiding van muiseilandjes en eencellige dissociatie
- Voer eilandjeskweek en blootstelling aan valinomycine uit volgens de onderstaande stappen.
- Isoleer pancreaseilandjes van wildtype (WT) en mt-Keima/+ (mt-Keima) muizen6. Bij deze methode werden 20 weken oude mannelijke WT- of mt-Keima/+ gevoede RFD-muizen gebruikt.
- Kweekeilandjesmonsters 's nachts bij 37 °C in eilandjesmedium.
- Pluk met een pipet 100 eilandjes per conditie in petrischaaltjes van 6 cm met 2 ml eilandjesmedium.
OPMERKING: Voorwaarden die voor dit protocol worden gebruikt: (1) Ongekleurde controle: Ongekleurde WT-eilandjes; (2) Alleen DAPI-controle: WT-eilandjes gekleurd met DAPI; (3) Fluozin-3-AM alleen controle: WT-eilandjes gekleurd met Fluozin-3-AM; (4) mt-Keima, uitsluitend controle: niet-bevlekte mt-Keima/+ eilandjes; (5) Onbehandeld: mt-Keima/+ eilandjes gekleurd met Fluozin-3-AM en DAPI; (6) Valinomycine: mt-Keima/+ eilandjes die zijn blootgesteld aan valinomycine en gekleurd zijn met Fluozin-3-AM en DAPI. - Voeg voor aandoening (6) bij blootstelling aan valinomycine gedurende 3 uur 2 μl valinomycinebouillon van 250 nM toe aan eilandjes in petrischaal om mitofagie op te wekken.
- Voer eencellige dissociatie uit.
- Voer de stappen voor het dissociëren van afzonderlijke cellen uit, zoals beschreven in stap 1.1.2.
- Cellen kleuren met Fluozin-3-AM en DAPI.
- Resuspendeer eilandjesmonsters in 500 μL eilandjesstroommedium.
- Voeg 0,25 μL van 1 mM Fluozin-3-AM bouillon toe aan tubes die Fluozin-3-AM kleurstof ontvangen (voorwaarden 3, 5 en 6).
- Incubeer cellen bij 37 °C en ga over tot DAPI-behandeling, zoals beschreven in de stappen 1.1.3.5-1.3.10.
- Voer eilandjeskweek en blootstelling aan valinomycine uit volgens de onderstaande stappen.
- Flowcytometrie
- Start het instrument op. Elke flowcytometer met de juiste filters zal werken.
OPMERKING: In dit onderzoek zijn de volgende filters gebruikt: (1) VL1 voor DAPI: Excitatie/Emissie - 405 nm/440 nm (50 nm); (2) BL1 voor Fluozin-3-AM: excitatie/emissie - 488 nm/530 nm (30 nm); (3) VL3 voor mt-Keima neutraal: excitatie/emissie - 405 nm/603 nm (48 nm); (4) YL2 voor mt-Keima-zuur: excitatie/emissie - 561 nm/620 nm (15 nm). - Pas FSC- en SSC-spanningen aan en sluit niet-afzonderlijke cellen uit, zoals beschreven in de stappen 1.2.2-1.2.3 (figuren 3A-C).
- Pas de spanningen en compensatie voor DAPI, Fluozin-3-AM en mt-Keima aan met behulp van ongekleurde en enkelvoudige positieve controles (voorwaarden 1-4) om ervoor te zorgen dat fluorescentiepositieve celpopulaties te onderscheiden zijn van ongekleurde cellen. Zodra de juiste compensatie op elk kanaal is toegepast, stelt u de DAPI-negatieve poort en de Fluozin-3-AM-positieve poort in om te filteren op levende β-cellen (figuren 3D-E).
- Stel een driehoeksschema op met behulp van het mt-Keima-positieve monster (voorwaarde 4) om zure en neutrale celpopulaties te identificeren (Figuur 3F).
NOTITIE: Voltages die doorgaans voor elk kanaal worden gebruikt: (1) VL1: 320-340 V; (2) BL2: 260-280 V; (3) VL3: 280-300 V; (4) YL2: 280-300 V. - Zodra de poorten zijn vastgesteld, verzamelt u 10.000 gebeurtenissen per monster. Poortschema's voor de voorwaarden 5 en 6 worden geïllustreerd in figuur 3A-G.
- Sla gegevens op als FCS-bestanden voor analyse.
- Start het instrument op. Elke flowcytometer met de juiste filters zal werken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Beoordeling van mitofagie via de op kleurstof gebaseerde MtPhagy-benadering
Deze op kleurstof gebaseerde benadering is geoptimaliseerd om mitofagieflux in primaire β-cellen van muizen te analyseren zonder dat er een genetische reporter nodig is, met behulp van Fluozin-3-AM, TMRE en MtPhagy en DAPI om dode cellen uit te sluiten. Door deze kleurstoffen te combineren met valinomycine om mitofagie te induceren, schetst dit protocol een op kleurstoffen gebaseerde methode om selectief de mitofagieflux te meten in primaire β-cellen van muizen18. Voor de gegevens die met behulp van deze MtPhagy-methode werden getoond, werden zowel basale als valinomycine-geïnduceerde mitofagie geanalyseerd in eilandjes die waren geïsoleerd uit muizen met een normaal vetdieet (RFD) of een vetrijk dieet (HFD, 60 kcal% vet) om het effect van metabole stress op mitofagieflux te beoordelen. Om de populatie van belang te identificeren, werden cellen omheind met behulp van onbehandelde RFD-eilandjes. FSC- en SSC-spanningen werden eerst aangepast om een gelijkmatige verdeling van cellen op een SSC-A vs. FSC-A-plot te bereiken (Figuur 1A). Om te selecteren voor enkele cellen, zowel FSC-H vs. FSC-W en SSC-H vs. Er werden SSC-W-plots gebruikt, waarbij multiplets werden uitgesloten vanwege hun hogere signaalwaarden in vergelijking met afzonderlijke cellen (Figuur 1B,C). Vervolgens werden DAPI-negatieve cellen geselecteerd om dode cellen uit te sluiten20 (Figuur 1D). Na het vaststellen van primaire poorten werden enkelvoudige gekleurde controles gebruikt om fluorescentiepoorten voor Fluozin-3-AM, MtPhagy en TMRE vast te stellen (Figuur 1E-G), evenals compensatiecontroles voor meerkleurige fluorescentieflowcytometrie.
Nadat deze primaire en fluorescentiepoorten waren vastgesteld, werden β-cellen met een hoog gebruik van mitofagie gedefinieerd als de FluozinhogeMtPhagyhogeTMRElage populatie in kwadrant 3 (Q3) met behulp van RFD zonder blootstelling aan valinomycine (Figuur 1H). Met behulp van deze poortstrategie werden basale en valinomycine-geïnduceerde mitofagieniveaus gekarakteriseerd in zowel RFD- als HFD-eilandjes (Figuur 2). Om mitofagieflux te kwantificeren, basaal vs. Valinomycine-geïnduceerde mitofagiespiegels werden vergeleken met behulp van de volgende verhouding:
Met behulp van deze verhouding werd de mitofagieflux gekwantificeerd en vergeleken in RFD vs. HFD β-cellen om verschillen in mitofagie te beoordelen na de inductie van obesitas en perifere insulineresistentie. Kwantificering van mitofagieflux in RFD vs. HFD-monsters zijn weergegeven in figuur 2E. Dit resultaat benadrukt de haalbaarheid van deze test om mitofagie in β-cellen te kwantificeren met behulp van een eenvoudige, op kleurstof gebaseerde benadering. Deze methode kan ook worden gebruikt in menselijke eilandjes, moeilijk te transfecteren cellen en eilandjes die zijn geïsoleerd uit complexe genetische modellen, waar kruising met het transgene mt-Keima-model omslachtig zou zijn.
Beoordeling van mitofagie met behulp van de genetisch gecodeerde mt-Keima-reporter
Mt-Keima is een fluorescerend eiwit met dubbele excitatie dat is gefuseerd met een Cox8-lokalisatiesequentie die het mogelijk maakt om zich op het binnenste mitochondriale membraan te richten. De bimodale fluorescerende eigenschap van mt-Keima maakt het mogelijk om zijn excitatiespectra om te schakelen van de neutrale (405 nm) naar zure (561 nm) golflengte, afhankelijk van de pH van het intracellulaire compartiment6. Dit maakt een robuuste ratiometrische fluorescentieanalyse van mitofagie mogelijk, waarbij een toename van de zuur-neutrale verhouding wijst op mitofagie-inductie. In dit protocol werd Fluozin-3-AM ook gebruikt om via flowcytometrie te selecteren op β-cellen. In deze representatieve studies werd mitofagieflux beoordeeld met behulp van eilandjes geïsoleerd uit muizen die een RFD-dieet kregen10,11. FSC- en SSC-spanningen werden eerst aangepast om een gelijkmatige verdeling van cellen op een SSC-A vs. FSC-A-waarnemingspunt (figuur 3A). Om te selecteren voor enkele cellen, zowel FSC-H vs. FSC-W en SSC-H vs. Er werden SSC-W-plots gebruikt, waarbij multiplets werden uitgesloten vanwege hun hogere signaalwaarden in vergelijking met afzonderlijke cellen (figuur 3B,C). De spannings- en gatingstrategie voor DAPI en Fluozin-3-AM werden bepaald met behulp van enkelvoudig gekleurde eilandjes (Figuur 3D,E). Driehoekige poorten voor de zure en neutrale populaties werden vervolgens geïdentificeerd met behulp van het mt-Keima-positieve monster zonder blootstelling aan valinomycine (Figuur 3F).
Nadat deze primaire en fluorescentiepoorten waren vastgesteld, werd de mitofagieflux beoordeeld met behulp van basale en valinomycine-geïnduceerde veranderingen in mt-Keima-fluorescentie (Figuur 3F,G). Om mitofagieflux te kwantificeren, basale mitofagie vs. Valinomycine-geïnduceerde niveaus werden vergeleken met behulp van de volgende verhouding:
Met behulp van deze verhouding werd mitofagieflux gekwantificeerd in RFD-cellen. De kwantificering van dit resultaat is weergegeven in figuur 3H. Belangrijk is dat deze resultaten vergelijkbaar zijn met de resultaten in RFD-eilandjes die zijn gegenereerd met behulp van de MtPhagy-benadering (Figuur 3H).
Figuur 1: Poortschema voor de MtPhagy-methode. (A) Stroomdiagram met poortschema om voor alle cellen te selecteren. (B) Gating om te selecteren op singlets op basis van FSC-H vs. FSC-W en (C) SSC-H vs. SSC-W. (D) Gating voor DAPI-negatieve cellen om dode cellen uit te sluiten. (E) Gating voor Fluozin-3-AMhoge cellen om te selecteren voor β-cellen. (F) Poortschema voor MtPhagy-kleurstof om MtPhagy-hoog- en MtPhagy-laagcelpopulaties te identificeren. (G) Poortschema voor TMRE om TMRE-populaties methoge enTMRE-lage cellen te identificeren. (H) Kwadrantschema opgesteld met onbehandelde RFD-eilandjes om FluozinhogeMtPhagyhogeTMRElage cellen in kwadrant 3 (Q3) te identificeren als β-cellen die mitofagie ondergaan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Beoordeling van mitofagiefluxverschillen in β-cellen van muizen na metabole stress met behulp van het MtPhagy-gatingschema. Representatieve flowcytometrieplots van (A) onbehandelde RFD-β-cellen, (B) onbehandelde HFD-β-cellen, (C) aan valinomycine blootgestelde RFD-β-cellen en (D) aan valinomycine blootgestelde HFD-β-cellen. (E) Kwantificering van mitofagieflux in β-cellen, berekend aan de hand van een verhouding tussen de MtPhagyhogeTMRElage cellen blootgesteld aan valinomycine en de MtPhagyhogeTMRElage cellen die niet zijn blootgesteld aan valinomycine, voor zowel RFD- als HFD-monsters. *p < 0,05 door de ongepaarde t-toets van de student. n = 3/groep. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Poortschema voor de mt-Keima-methode en vergelijking tussen beide methoden. (A) Stroomdiagram met poortschema om voor alle cellen te selecteren. (B) Gating om te selecteren op singlets op basis van FSC-H vs. FSC-W en (C) SSC-H vs. SSC-W. (D) Gating voor DAPI-negatieve cellen om dode cellen uit te sluiten. (E) Gating voor Fluozin-3-AMhoge cellen om te selecteren voor β-cellen. (F) Representatieve flowcytometriegrafieken van mt-Keima/+ onbehandelde cellen en (G) mt-Keima/+ valinomycine-blootgestelde cellen. (H) Kwantificering van de mitofagieflux in β-cellen van RFD-gevoede muizen, berekend aan de hand van een verhouding tussen de zure/neutrale cellen die zijn blootgesteld aan valinomycine en de verhouding tussen de zure/neutrale cellen die niet zijn blootgesteld aan valinomycine met behulp van de mt-Keima-methode en vergeleken met de MtPhagy-methode (gegevens voor het MtPhagy-protocol oorspronkelijk weergegeven in figuur 2E). n = 3/groep. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol beschreef twee complementaire methoden om mitofagieflux in gedissocieerde primaire muiseilandjes te kwantificeren. Met behulp van de mt-Keima-methode werd een toename van mitofagie gekwantificeerd als een verhoogde verhouding van zure (561 nm)/neutrale (405 nm) cellen, terwijl in de MtPhagy-methode een verhoogde mitofagieflux werd gekwantificeerd als een toename van de FluozinhogeMtPhagyhogeTMRElage celpopulatie. Deze methoden maken snelle, kwantitatieve en β-celspecifieke beoordelingen van mitofagieflux mogelijk.
Beide methoden zijn rechttoe rechtaan benaderingen. Bepaalde stappen binnen dit protocol zijn echter cruciaal voor het verkrijgen van kwalitatieve en reproduceerbare resultaten. Deze stappen omvatten: (1) juiste dissociatie van eilandjes om een suspensie van één cel te verkrijgen, maar mild genoeg om de levensvatbaarheid van eilandjes te garanderen, (2) zorgvuldige vaststelling van gating om interessante populaties correct te identificeren, en (3) de objectieve kwantificering van flowcytometriegegevens via softwaretools om een onbevooroordeelde beoordeling van mitofagieflux te garanderen.
Bij de keuze van de te gebruiken methode moet rekening worden gehouden met het celtype en de aard van de gebruikte genetische modellen. De mt-Keima-methode, die in vivo wordt gebruikt of in vitro wordt getransfecteerd, is een veel geciteerde en gewaardeerde methode voor mitofagiebeoordeling door middel van flowcytometrie of beeldvorming van levendecellen21. Hoewel de op kleurstof gebaseerde MtPhagy-methode een nieuwere benadering is in vergelijking met genetische verslaggevers, zijn er gevallen waarin het gebruik ervan de voorkeur kan hebben boven mt-Keima. Inderdaad, de MtPhagy-methode overwint de noodzaak van transfectie of complexe kweekschema's, en MtPhagy-kleuring duurt slechts 30 minuten en wordt onmiddellijk voorafgaand aan flowcytometrie uitgevoerd. De MtPhagy-benadering kan ook met succes worden toegepast in moeilijk te transfecteren primaire menselijke eilandjesmonsters. Dit protocol, dat afhankelijk is van pH-gevoelige mitochondriale kleurstoffen of sondes om mitofagie direct te meten, verschilt van een eerdere benadering van Mauro-Lizcano et. al die de membraanpotentiaalgevoelige MitoTracker Deep Red-kleurstof gebruikten en het gebruik van mitofagie en lysosomale remmers vereisten om mitofagieflux te kwantificeren door middel van flowcytometrie22. Zoals de Mauro-Lizcano et. Hoewel deze methode niet op eilandjes is getest, is het moeilijk om deze rechtstreeks te vergelijken met de werkzaamheid van de hier beschreven MtPhagy- of mt-Keima-methoden. Alles bij elkaar biedt de combinatie van deze methoden in totaliteit een toenemend aantal opties om mitofagieflux rigoureus te beoordelen in zeer kwantitatieve levende eencellige assays.
Een nadeel van beide methoden is hun onverenigbaarheid met celfixatie. Hoewel beide methoden compatibel zijn met beeldvormingsbenaderingen van levende cellen, interfereert celfixatie met de pH-gradiënt van zowel MtPhagy als mt-Keima over het lysosomale membraan 7,16. Als alternatief is eerder gebruik gemaakt van de mitoQC-mitofagiereporter in vaste monsters7. Bovendien is een beperking voor beide methoden de noodzaak om eilandjes te dissociëren voorafgaand aan flowcytometrie, wat de levensvatbaarheid van cellen kan beïnvloeden. Daarom is het van cruciaal belang om cellen te kleuren met DAPI om de levensvatbaarheid van cellen na dissociatie van eilandjes te controleren en ervoor te zorgen dat alle monsters consistent worden behandeld. Na DAPI-kleuring hadden monsters gemiddeld 12,7% ± 7,4 dode cellen (Figuur 1D), wat aangeeft dat >80% van de cellen in elk monster voor analyse kon worden gebruikt. Monitoring van de levensvatbaarheid van cellen in elk stadium (na isolatie van eilandjes, kweek en vervolgens dissociatie) kan bovendien nuttig zijn om kennis te verkrijgen over de overleving van cellen in elke stap van de procedure. Variabiliteit in timing tussen eilandjesisolatie en dissociatie van één cel kan ook van invloed zijn op de levensvatbaarheid en resultaten van cellen. Het wordt dus aanbevolen om consistent te blijven met de timing van alle experimenten.
Aangezien mitochondriale kwaliteitscontrole van cruciaal belang is voor de gezondheid en functie van β cellen, kunnen rigoureuze beoordelingen van mitofagie met behulp van traditionele biochemische of beeldvormingsbenaderingen (inclusief omzet van mitochondriale buitenmembraaneiwitten, mitochondriale lokalisatie naar autofagosomen of lysosomen, en elektronenmicroscopie) een uitdaging en tijdrovend zijn. De ontwikkeling van effectieve en robuuste mitofagie-rapportagesystemen is dus cruciaal. Zowel de mt-Keima- als de MtPhagy-benadering zijn efficiënt en maken kwantitatieve beoordelingen van mitofagieflux mogelijk. Deze twee technieken zorgen voor zowel flexibiliteit als precisie bij het aanpakken van β-cel mitochondriale kwaliteitscontrole en het onderzoeken van interacties tussen organellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
SAS heeft subsidie ontvangen van Ono Pharmaceutical Co., Ltd. en is consultant voor Novo Nordisk.
Acknowledgments
E.L-D. erkent de steun van de NIH (T32-AI007413 en T32-AG000114). SAS erkent steun van de JDRF (COE-2019-861), de NIH (R01 DK135268, R01 DK108921, R01 DK135032, R01 DK136547, U01 DK127747), het Department of Veterans Affairs (I01 BX004444), de familie Brehm en de familie Anthony.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibiotic-Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| Attune NxT Flow Cytometer | Thermofisher Scientific | A24858 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | 317275 | |
| Fatty Acid Free heat shock BSA powder | Equitech | BAH66 | |
| Fetal bovine serum | Gemini Bio | 900-108 | |
| Fluozin-3AM | Thermofisher Scientific | F24195 | 100 μg Fluozin-3AM powder reconstituted in 51 μL DMSO and 51 μL Pluronic F-127 to reach 1 mM stock. |
| Gibco RPMI 1640 Medium | Fisher Scientific | 11-875-093 | |
| HEPES (1M) | Life Technologies | 15630-080 | |
| MtPhagy dye | Dojindo | MT02-10 | 5 μg MtPhagy powder reconstituted with 50 μL DMSO to reach 100 μM stock. |
| MtPhagy dye | Dojindo | MT02-10 | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | Life Technologies | 15140-122 | 1x Solution used in procotol by diluting 1:10 in ddH2O |
| Phosphate buffered saline, 10x | Fisher Scientific | BP399-20 | 1x Solution used in procotol by diluting 1:10 in ddH2O |
| Sodium Pyruvate (100x) | Life Technologies | 11360-070 | 5 μg MtPhagy powder reconstituted with 50 μL DMSO to reach 100 μM stock. |
| TMRE [Tetramethylrhodamine, ethyl ester, perchlorate] | Anaspec | AS-88061 | TMRE powder reconstituted in DMSO to reach 100 μM stock. |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermofisher Scientific | 25300054 | |
| Valinomycin | Sigma | V0627 | Valinomycin powder reconsituted in DMSO to reach 250 nM stock. |
References
- Kaufman, B. A., Li, C., Soleimanpour, S. A. Mitochondrial regulation of β-cell function: maintaining the momentum for insulin release. Molecular Aspects of Medicine. 42, 91-104 (2015).
- Soleimanpour, S. A., et al. The diabetes susceptibility gene Clec16a regulates mitophagy. Cell. 157 (7), 1577-1590 (2014).
- Pearson, G., et al. Clec16a, Nrdp1, and USP8 form a ubiquitin-dependent tripartite complex that regulates β-cell mitophagy. Diabetes. 67 (2), 265-277 (2018).
- Hattori, N., Saiki, S., Imai, Y.
- Berezhnov, A. V., et al. Intracellular pH modulates autophagy and mitophagy. Journal of Biological Chemistry. 291 (16), 8701-8708 (2016).
- Sun, N., et al.
- McWilliams, T. G., et al. mito-QC illuminates mitophagy and mitochondrial architecture in vivo. Journal of Cell Biology. 214 (3), 333-345 (2016).
- Aoyagi, K., et al. A new beta cell-specific mitophagy reporter mouse shows that metabolic stress leads to accumulation of dysfunctional mitochondria despite increased mitophagy. Diabetologia. 66 (1), 147-162 (2023).
- Ma, X., Ding, W. X. A fluorescence imaging based-assay to monitor mitophagy in cultured hepatocytes and mouse liver. Liver Research. 5 (1), 16-20 (2021).
- Sidarala, V., et al. Mitophagy protects β cells from inflammatory damage in diabetes. JCI Insight. 5 (24), 141138 (2020).
- Gingerich, M. A., et al. An intrinsically disordered protein region encoded by the human disease gene CLEC16A regulates mitophagy. Autophagy. 19 (2), 525-543 (2023).
- Sun, N., Malide, D., Liu, J., Rovira, I. I., Combs, C. A., Finkel, T. A fluorescence-based imaging method to measure in vitro and in vivo mitophagy using mt-Keima. Nature Protocols. 12 (8), 1576-1587 (2017).
- Zhao, J., Bertoglio, B. A., Gee, K. R., Kay, A. R. The zinc indicator FluoZin-3 is not perturbed significantly by physiological levels of calcium or magnesium. Cell Calcium. 44 (4), 422-426 (2008).
- Da Silva Xavier, G.
- Thapa, B., et al. Imaging β-cell function using a zinc-responsive MRI contrast agent may identify first responder islets. Frontiers in Endocrinology. 12, 809867 (2022).
- Iwashita, H., et al. Live cell imaging of mitochondrial autophagy with a novel fluorescent small molecule. ACS Chemical Biology. 12 (10), 2546-2551 (2017).
- Crowley, L. C., Christensen, M. E., Waterhouse, N. J. Measuring mitochondrial transmembrane potential by TMRE staining. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (12), 087361 (2016).
- Klein, B., Wörndl, K., Lütz-Meindl, U., Kerschbaum, H. H. Perturbation of intracellular K(+) homeostasis with valinomycin promotes cell death by mitochondrial swelling and autophagic processes. Apoptosis. 16 (11), 1101-1117 (2011).
- Ji, Y., et al. Toll-like receptors TLR2 and TLR4 block the replication of pancreatic β cells in diet-induced obesity. Nature Immunology. 20 (6), 677-686 (2019).
- Sauvat, A., et al. Quantification of cellular viability by automated microscopy and flow cytometry. Oncotarget. 6 (11), 9467-9475 (2015).
- Liu, Y. T., et al. Mt-Keima detects PINK1-PRKN mitophagy in vivo with greater sensitivity than mito-QC. Autophagy. 17 (11), 3753-3762 (2021).
- Mauro-Lizcano, M., et al. New method to assess mitophagy flux by flow cytometry. Autophagy. 11 (5), 833-843 (2015).
