Summary
Denne protokol beskriver og sammenligner to repræsentative metoder til differentiering af hiPSC'er i mesenkymale stromale celler (MSC'er). Enkeltlagsmetoden er kendetegnet ved lavere omkostninger, enklere betjening og lettere osteogen differentiering. Embryoidlegememetoden (EB'er) er kendetegnet ved lavere tidsforbrug.
Abstract
Mesenkymale stromale celler (MSC'er) er voksne pluripotente stamceller, der har været meget udbredt i regenerativ medicin. Da somatisk vævsafledte MSC'er er begrænset af begrænset donation, kvalitetsvariationer og biosikkerhed, har de sidste 10 år oplevet en stor stigning i bestræbelserne på at generere MSC'er fra humane inducerede pluripotente stamceller (hiPSC'er). Tidligere og nylige bestræbelser på differentiering af hiPSC'er i MSC'er har været centreret omkring to dyrkningsmetoder: (1) dannelsen af embryoidlegemer (EB'er) og (2) brugen af enkeltlagskultur. Denne protokol beskriver disse to repræsentative metoder til at udlede MSC fra hiPSC'er. Hver metode præsenterer sine fordele og ulemper, herunder tid, omkostninger, cellespredningsevne, ekspression af MSC-markører og deres evne til differentiering in vitro. Denne protokol viser, at begge metoder kan udlede modne og funktionelle MSC'er fra hiPSC'er. Enkeltlagsmetoden er kendetegnet ved lavere omkostninger, enklere betjening og lettere osteogen differentiering, mens EB-metoden er kendetegnet ved lavere tidsforbrug.
Introduction
Mesenkymale stromale celler (MSC'er) er mesodermafledte voksne pluripotente stamceller1. MSC'er er til stede i næsten alle bindevæv2. Siden MSC'er først blev opdaget i 1970'erne og med succes isoleret fra knoglemarv i 1987 af Friedenstein et al.3,4,5, er en række humane somatiske (herunder føtale og voksne) væv blevet brugt til isolering af MSC'er såsom knogle, brusk, sener, muskler, fedtvæv og hæmatopoietisk understøttende stroma 1,2,6,7 . MSC'er demonstrerer høje proliferative evner og plasticitet til at differentiere sig til mange somatiske cellelinjer og kunne migrere til skadet og betændt væv 2,8,9. Disse egenskaber gør MSC'er til en potentiel kandidat til regenerativ medicin10. Imidlertid er somatiske vævsafledte MSC'er (st-MSC'er) begrænset af begrænset donation, begrænset celleproliferativ kapacitet, kvalitetsvariationer og biosikkerhedsproblemer for mulig overførsel af patogener, hvis nogen, fra donorerne11,12.
Human induceret pluripotent stamceller (hiPSC'er) stammer fra voksne celler, der omprogrammeres med transkriptionsfaktorer (Oct4, Sox2, Klf4 og c-Myc), som har lignende funktioner som embryonale stamceller13,14. De kan forny sig selv og have potentialet til at differentiere sig til enhver type somatiske celler, herunder MSC'er. Sammenlignet med st-MSC'er har iPSC-MSC'er fordelen ved ubegrænset forsyning, lavere omkostninger, højere renhed, bekvemmelighed i kvalitetskontrol, let at skalere produktion og genmodifikation 15,16,17.
På grund af disse fordele ved iPSC-MSC'er er der rapporteret om en række forskellige metoder, der driver MSC fra iPSC. Disse differentieringsmetoder har været centreret omkring to dyrkningsmetoder: (1) dannelsen af embryoidlegemer (EB'er) og (2) brugen af enkeltlagskulturer 11,18,19,20. Heri blev en repræsentativ tilgang til hver af de to metoder karakteriseret. Desuden blev der også adgang til sammenligninger mellem to repræsentative tilgange baseret på tid, omkostninger, proliferativ evne, ekspression af MSC-biomarkører og differentieringsevne in vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. vedligeholdelse af hiPSC'er
- Optøning af hiPSC
- Tag cellerne ud af det flydende kvælstof og tø hurtigt cellerne op i et 37 °C vandbad. Optøningscellerne overføres til et 15 ml rør fremstillet med 3 ml iPSC-vedligeholdelsesmedium (materialetabel). Bland forsigtigt mediet.
- Centrifuger ved 300 x g i 5 min. Supernatanten fjernes, og cellerne resuspenderes forsigtigt i 1 ml iPSC-vedligeholdelsessubstrat med 10 μM Y-27632 (cellerne pipetteres op og ned 2-3 gange).
- Cellesuspensionen overføres til en 6-brønds vævskulturplade belagt med vækstfaktorreduceret (GFR)-ekstracellulær matrixgel (1:100) og 2 ml iPSC-vedligeholdelsesmedium tilsat 10 μM Y-27632 på forhånd (ca. 4 x 104 celler/cm2).
- Dyrk cellerne i 5-6 dage (80% -90% sammenløb) ved 37 °C, 5% CO2 med iPSC vedligeholdelsesmedier skift hver dag.
- Passage af hiPSC
- Fjern iPSC-vedligeholdelsesmediet fra 6-brøndspladen. Vask hiPSC'erne én gang med DPBS.
- Tilsæt 700-800 μL 0,48 mM EDTA-opløsning og inkuber i 1 min ved stuetemperatur (RT), og fjern derefter fordøjelsesopløsningen. Inkuberes fortsat ved 37 °C temperatur i 3-5 min.
- Når celler fordøjes i ark (fordøjes ikke celler i enkeltceller), tilsættes 1 ml iPSC-vedligeholdelsesmedium med 10 μM Y-27632 for at afslutte fordøjelsen. Rør forsigtigt cellerne op og ned 2-3 gange.
- Overfør cellesuspensionen til en 6-brønds vævskulturplade belagt med vækstfaktorreduceret (GFR)-ekstracellulær matrixgel (1:100) og 2 ml iPSC-vedligeholdelsesmedium tilsat 10 μM Y-27632 på forhånd.
BEMÆRK: Passaging-forholdet varierer fra 1:6 til 1:20 (ca. 4 x 104 celler/cm2), og den gennemsnitlige aggregeringsstørrelse er ca. 50-200 μm. - Dyrk cellerne indtil 80% -90% sammenløb (5-6 dage) ved 37 °C, 5% CO2 med iPSC vedligeholdelsesmedier skift hver dag.
2. MSC'ers differentiering fra hiPSC'er via EB-dannelse
BEMÆRK: Metoden er afledt af tidligere litteratur 21,22,23,24. En oversigt over metoden er illustreret i figur 1. Metodens karakteristika er opsummeret i tabel 1.
- Fremstilling af mediet
- Forbered MSC-differentieringsmedium ved at supplere α-MEM med 1% (v/v) GlutaMAX, 10% (v/v) FBS, 10 ng/ml FGF2 og 5 ng/ml TGFβ.
- Forbered MSC-vedligeholdelsesmediet ved at supplere α-MEM med 1 % (v/v) GlutMAX, 10 % (v/v) FBS og 1 ng/ml FGF2.
- Fremstilling af hiPSC'er
- KulturhiPSC-linjer (passage mindst 2-3 gange efter optøning) i iPSC-vedligeholdelsesmedium på en 6-brønds vævskulturplade belagt med vækstfaktorreduceret (GFR)-ekstracellulær matrixgel (1:100) ved 37 °C, 5% CO2 indtil 80 % -90 % sammenløb.
- Dag 0: EB-dannelse
- Fjern iPSC-vedligeholdelsesmediet fra 6-brøndspladen. Vask hiPSC'erne én gang med DPBS.
- Tilsæt 700-800 μL 0,48 mM EDTA-opløsning og inkuber i 1 min ved RT, fjern derefter fordøjelsesopløsningen. Inkuberes fortsat ved 37 °C temperatur i 3-5 min.
- Når celler fordøjes i ark (fordøjes ikke celler i enkeltceller), tilsættes 2 ml iPSCs vedligeholdelsesmedium (indeholdende 10 μM Rock-hæmmer og 1:100 GFR- ekstracellulær matrixgel) for at afslutte fordøjelsen.
- Overfør cellerne til en 6-brønds lav fastgørelsesplade. Frø cellerne i et forhold på 2 brønde vævskulturplade til 1 brønd med lav fastgørelsesplade. Cellerne inkuberes i en ryster (60 omdr./min.) ved 37 °C, 5% CO2 i 24 timer for at danne sfæriske EB'er.
- Dag 1-Dag 7: EB-differentiering
- Overfør EB'erne til centrifugerøret med en Pasteur-pipette (uden at ødelægge EB'er), og lad EB'erne naturligt sedimentere i 5-10 minutter ved RT. Derefter fjernes supernatanten.
- Overfør EB'erne til en 6-brønds lav fastgørelsesplade med 2 ml MSC-differentieringsmedium. Dyrk EB'erne på rysteren ved 37 °C, 5% CO2 i 7 dage med medium skift én gang.
- Dag 8-Dag 17: EB-podning
- Overfør EB'erne til centrifugerøret med en Pasteur-pipette (uden at ødelægge EB'er), og lad EB'erne naturligt sedimentere i 5-10 minutter. Derefter fjernes supernatanten.
- Overfør EB'erne til en GFR-ekstracellulær matrix gelbelagt 6-brønds plade med 2 ml MSC-vedligeholdelsesmedium. Kultur indtil 90% sammenløb (~ 10 dage) med regelmæssig medieændring efter celleadhæsion.
- Dag 18-Dag 27: MSC'er modning og udvidelse
- Den EB-afledte kultur behandles med en dissociationsopløsning ved 37 °C i 5-10 minutter (fordøjelsestiden varierer på grund af tilstedeværelsen af forskellige celletyper).
- Når en del af cellerne fordøjes til enkelte celler, tilsættes 2 ml MSC-vedligeholdelsesmediet for at afslutte fordøjelsen og overføre cellesuspensionen til et centrifugeglas. Vask de resterende ufordøjede celler en gang med DPBS og fordøje igen. Gentag flere gange, indtil alle celler fordøjes i enkeltceller. Celleopslæmningen centrifugeres ved 250 x g i 5 min, hvorefter supernatanten fjernes.
- Frø cellerne på en gelatinebelagt kulturplade (ca. 2 x 105 celler / cm2). Kultur indtil 90% sammenløb i MSC-vedligeholdelsesmedie med middelskift regelmæssigt. Angiv denne generation af celler som passage 0 (P0) på dette tidspunkt.
- For at gøre MSC ren og moden skal du fortsætte med at passere cellerne to gange i forholdet 1:3 på ca. 6 dage. De fleste af cellerne præsenterer fibroblastlignende morfologi (spindelformet).
3. MSC'ers differentiering fra hiPSC'er via enkeltlagskultur
BEMÆRK: Metoden er afledt af tidligere litteratur 25,26,27,28. En oversigt over denne metode er illustreret i figur 1. Metodens karakteristika er opsummeret i tabel 1.
- Fremstilling af mediet
- Forbered MSC-vedligeholdelsesmediet ved at supplere α-MEM med 1 % (v/v) GlutMAX, 10 % (v/v) FBS og 1 ng/ml FGF2.
- Fremstilling af hiPSC'er
- KulturhiPSC-linjer (passage mindst 2-3 gange efter optøning) i iPSC-vedligeholdelsesmediet på en 6-brønds vævskulturplade belagt med vækstfaktorreduceret (GFR)-ekstracellulær matrixgel (1:100) ved 37 °C, 5% CO2 indtil 50 %-60 % sammenløb.
- Dag 0-Dag 13: Differentiering ved direkte enkeltlagskulturer
- Fjern iPSC-vedligeholdelsesmediet fra 6-brøndspladen.
- Tilsæt direkte 2 ml MSC-vedligeholdelsesmediet og kultur i 14 dage ved 37 °C, 5 % CO2, og mediet skiftes hver dag.
- Dag 14-dag 35: MSC'er modning ved gentagen passage
- Enkeltlagskulturerne behandles med en dissociationsopløsning ved 37 °C i 5-10 minutter (fordøjelsestiden varierer på grund af tilstedeværelsen af forskellige celletyper).
- Når cellerne fordøjes til enkelte celler, tilsættes 2 ml MSC-vedligeholdelsesmedium for at afslutte fordøjelsen og overføre cellesuspensionen til centrifugerøret. Vask de resterende ufordøjede celler en gang med DPBS og fordøje igen. Gentag flere gange, indtil alle celler fordøjes i enkeltceller. Celleopslæmningen centrifugeres ved 250 x g i 5 min, hvorefter supernatanten fjernes.
- Frø cellerne på en gelatinebelagt kulturskål (ca. 2 x 105 celler / cm2). Kultur indtil 90% sammenløb i MSC-vedligeholdelsesmediet med medieskift regelmæssigt. Angiv denne generation af celler som passage 0 (P0) på dette tidspunkt.
- For at gøre MSC ren og moden skal du fortsætte med at passere cellerne 6 gange i forholdet 1:3 på ca. 18 dage. De fleste af cellerne præsenterer fibroblastlignende morfologi (spindelformet).
4. Overfladeantigenanalyse af hiPSC-drivende MSC'er ved flowcytometri
BEMÆRK: I lighed med overfladeantigenerne i knoglemarvsafledte MSC'er udtrykker hiPSC'er MSC express CD105, CD73 og CD90, men udtrykker ikke CD45, CD3429. Derudover kan hiPSC'er anvendes som negative kontrolceller. Overfladeantigenanalyse af hiPSC-drivende MSC'er og hiPSC'er ved flowcytometri er vist i figur 2.
- De højtydende MSC'er behandles med en dissociationsopløsning ved 37 °C i 2-3 minutter. HiPSC'erne behandles med 0,48 mM EDTA-dissociationsreagens, og inkuberes i 1 min ved RT, hvorefter dissociationsreagenset fjernes. Inkuberes fortsat ved 37 °C temperatur i 3-5 min.
- Når cellerne fordøjes i enkeltceller, tilsættes medium (MSC-vedligeholdelsesmedium til MSC'er og iPSC-vedligeholdelsesmedium til iPSC'er) for at afslutte fordøjelsen.
- Celleopslæmningen centrifugeres ved 350 x g i 5 min, hvorefter supernatanten fjernes.
- Cellerne vaskes én gang med kold DPBS, centrifugeres ved 350 x g i 5 min, og derefter fjernes supernatanten.
- Tæl og resuspender cellerne i kold 10% FBS-DPBS (v/v) opløsning ved 10 x 106 celler/ml og fordel 100 μL/tube cellesuspension (1 x 106 celler/rør) i 1,5 ml centrifugeglas.
- Der tilsættes 5 μL human Fc-receptorblokerende opløsning til 100 μL cellesuspension. Inkuber i 5-10 minutter ved RT for at udføre uspecifik blokering.
- Der centrifugeres ved 350 x g i 5 min. og supernatanten fjernes. Vask cellerne to gange med en kold 2% FBS-DPBS (v / v) opløsning.
- Resuspender cellerne i kold 100 μL 2% FBS-DPBS (v / v) opløsning.
- Der tilsættes 5 μL (1 test) anti-CD34-FITC og 5 μL (1 test) anti-CD45-APC til 100 μL-cellen
Ophængning. Der tilsættes 5 μL (1 test) anti-CD73-APC, 5 μL (1 test) anti-CD90-FITC og 5 μL (1 test) anti-CD105-PE til et andet 100 μL cellesuspensionsrør. Der tilsættes 5 μL human IgG1 isotype kontrol FITC, human IgG1 isotype kontrol PE og human IgG1 isotype kontrol APC til det tredje 100 μL cellesuspensionsrør. Inkuber i 15-20 min på is i mørke. I mellemtiden skal du forberede enkeltfarvningsperler. - Vask cellerne to gange med en kold 2% FBS-DPBS (v / v) opløsning.
- Tilsæt 300 μL kold 2% FBS-DPBS (v / v) opløsning for at resuspendere cellerne, og filtrer via 200 mesh skærmfilter.
- Analyser prøverne ved hjælp af flowcytometri. Analyser cellesuspensionen farvet med isotypekontrolantistoffer og indstil porten. Derefter analyseres cellesuspension farvet med målantistoffer.
5. Osteogen differentiering af højtydende MSC'er til kørsel
BEMÆRK: De hiPSC-drivende MSC'er har osteogent differentieringspotentiale (figur 3A, B). Protokollen for osteogen differentiering er angivet nedenfor.
- Forbered osteogent induktionsmedium ved at supplere α-MEM med 10% FBS, 100 nM dexamethason, 10 mM beta-glycerophosphat og 100 μM ascorbinsyre.
- Frø 1 x 105 MSC'er i en gelatinebelagt 48-brønds plade og kultur, indtil den er 60% -70% sammenflydende.
- Fjern mediet og tilsæt 0,3 ml osteogent induktionsmedium. Cellerne dyrkes i et osteogent induktionsmedium i 14 dage ved 37 °C, 5% CO2, med medieskift hver 3. dag.
- Fjern mediet og vask med DPBS en gang.
- Der tilsættes 0,3 ml 4% PFA og inkuberes ved RT i 30 min.
- Fjern PFA. Skyl cellerne med 0,3 ml DPBS i 10 minutter ved RT og gentag 3 gange.
- Fjern DPBS, tilsæt 0,2 ml Alizarin rød farvningsopløsning, og inkuber i 30 minutter ved RT.
- Fjern farvningsopløsningen, skyl cellerne med 0,3 ml DPBS i 10 minutter ved RT, og gentag 3 gange.
- Overhold farvningen af calciumaflejring under et lysmikroskop.
6. Adipogen differentiering af højtydende MSC'er til kørsel
BEMÆRK: De højtydende MSC'er, der kører hi, har adipogent differentieringspotentiale (figur 3C, D). Protokollen for adipogen differentiering er angivet nedenfor.
- Forbered adipogent induktionsmedium ved at supplere α-MEM med 10% FBS, 1 μM dexamethason, 1 μM IBMX, 10 μg/ml insulin og 100 μM indomethacin. Forbered adipogent vedligeholdelsesmedium ved at supplere α-MEM med 10% FBS og 10 μg/ml insulin.
- Frø 1 x 105 MSC'er i en gelatinebelagt 48-brønds plade og kultur, indtil celletætheden når 90%.
- Fjern mediet og tilsæt 0,3 ml adipogent induktionsmedium. Fortsæt med at dyrke cellerne i det adipogene induktionsmedium i 4 dage ved 37 °C, 5% CO2.
- Fjern mediet og tilsæt 0,3 ml adipogent vedligeholdelsesmedium. Fortsæt med at dyrke cellerne i det adipogene vedligeholdelsesmedium i 3 dage ved 37 °C, 5% CO2.
- Gentag trin 6.3 og 6.4 2-3 gange indtil adipocytdifferentiering og modning.
- Fjern mediet og vask med DPBS en gang.
- Tilsæt 0,3 ml 4% PFA og inkuber ved RT i 10 minutter. Fjern PFA'en og skyl 2 gange med DPBS.
- Påfør Oli Red O-plet i henhold til producentens anvisninger og observer lipiddråberne under et lysmikroskop.
7. ChondRogen differentiering af højtydende MSC'er til kørsel
BEMÆRK: De højtydende MSC'er, der kører hi, har kondrogen differentieringspotentiale (figur 3E, F). Protokollen for kondrogen differentiering er angivet nedenfor.
- Forbered chondroblast induktionsmedium ved at supplere α-MEM med 10% FBS, 100 nM dexamethason, 1% insulin-transferrin-selen (ITS), 10 μM ascorbinsyre, 1 mM natriumpyruvat, 50 μg / ml prolin, 0,02 nM transformerende vækstfaktor β3 (TGFβ3) og 0,5 μg / ml knoglemorfogenetisk protein 6 (BMP-6).
- Der opsamles 2,5 x 105 højtydende MSC'er, som driver mikronat, og cellerne centrifugeres ved 150 x g i 5 minutter, hvorefter supernatanten fjernes. Suspender cellerne i 1 ml α-MEM og centrifuger derefter ved 150 x g i 5 minutter.
- Supernatanten fjernes og opslæmmes i 0,5 ml kondrogent induktionsmedium. Centrifuger cellerne ved 150 x g i 5 min.
- Skru låget og kulturen direkte af i 21 dage med kondrogen induktionsmedieskift hver 3. dag ved 37 °C, 5% CO2. Svip centrifugeslangen forsigtigt for at suspendere de kondrogene pellets (uden at ødelægge chondrogene pellets) hver dag under kondrogen differentiering.
- Supernatanten fjernes og vaskes to gange med 0,5 ml PBS.
- Der tilsættes 0,3 ml 4% PFA og fikseres i 24 timer.
- Paraffin indlejrer de kondrogene pellets og sektionerer dem derefter (3 μm). Plet sektionerne i toluidinblå (1%) i 30 min.
- Overhold den ekstracellulære chondrocytmatrix under et lysmikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter protokollen (figur 1A) blev hiPSC'er differentieret til MSC'er via EB-dannelses- og enkeltlagskulturmetoderne. Under differentieringen viste cellerne forskellige repræsentative morfologier (figur 1B, C).
Som vist i figur 1B viser hiPSC-kolonierne typisk kompakt morfologi før differentiering med en klar kant sammensat af tæt pakkede celler. Ensartede sfæriske EB'er dannet efter hiPSC'er, der dissocieres og dyrkes i 24 timer på rysteren. I løbet af dag 1 til dag 7 af kulturen i MSCs differentieringsmedium blev den glatte kant af EB ru, og mængden af EB voksede sig stor. Fra dag 8 til dag 17, efter overførsel af EB'erne til en GFR-ekstracellulær matrix gelbelagt 6-brønds plade, klæbede EB'er gradvist til pladen, og mange klæbende enkeltlagsceller spredte sig omkring EB'erne. Når cellerne nåede 90% sammenløb på dag 18, blev cellerne fordøjet og podet på en gelatinebelagt kulturplade. På dag 19 klæbede cellen og viste en polygonal form. Fortløbende blev cellerne passeret to gange, da de var 90% sammenflydende. De afledte MSC'er modnedes gradvist og viste en typisk spindelform, og kolonien voksede i en hvirvel.
Som vist i figur 1C steg cellernes volumen og spredte sig rundt i kolonien efter udskiftning af iPSC-vedligeholdelsesmediet med MSC-vedligeholdelsesmediet i 24 timer. Mens de blev dyrket i et MSC-vedligeholdelsesmedium, spredte cellerne sig gradvist og dannede flerlags klæbende celler. På dag 14 blev cellerne fordøjet og podet på en gelatinebelagt kulturplade. På dag 15 klæbede cellen og viste en polygonal form. Fortløbende blev cellerne passeret 6 gange, da de var 90% sammenflydende. De afledte MSC'er modnedes gradvist og viste en typisk spindelform, og kolonien voksede i en hvirvel.
Overfladeantigenerne af hiPSC'er og hiPSC-drivende MSC'er blev analyseret ved flowcytometri (figur 2). Som vist i figur 2C var hiPSC'er positive for CD90 og negative for CD34, CD45, CD73 og CD105. Efter differentiering af hiPSC'er i MSC'er via begge metoder var drivende MSC'er positive for CD90, CD73 og CD105 og negative for CD34 og CD45 (figur 2A, B).
Differentieringsevnen hos hiPSC-drivende MSC'er blev undersøgt ved osteogen, adipogen og kondrogen differentiering. Som vist i figur 3 differentierede begge hiPSC-drivende MSC'er af de to metoder sig i osteoblast, adipocyt og chondrocyt. De hiPSC-drivende MSC'er i enkeltlagsmetoden dannede flere calciumaflejringer end EB-metoden (figur 3B). De to metoder havde ingen signifikant forskel i adipogen differentiering og kondrogen differentieringsevne (figur 3D, F).
Spredningsevnen hos hiPSC-kørende MSC'er blev undersøgt ved kontinuerlig passagekultur. Som vist i figur 3G kan de hiPSC-drivende MSC'er for begge metoder passeres i mere end 20 passager og stadig opretholde en hurtig spredningsevne.
Sammenligningen mellem de to metoder vist i tabel 1 er baseret på differentieringstid, omkostninger, cellespredningsevne, MSC-markørers ekspression og deres differentieringsevne in vitro.
Figur 1: Differentiering af hiPSC'er i MSC'er via EB-dannelsesmetode og enkeltlagskulturmetode. (A) Skematisk visning af differentieringen af hiPSC'er i MSC'er via EB-dannelse og enkeltlagskultur. Repræsentationsmorfologi af celler ved nøglefager under MSC-afledning fra hiPSC'er via (B) EB-dannelse og (C) enkeltlagskultur. Skalastænger: 300 μm og 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: hiPSC-drivende MSC'er overfladeantigenanalyse ved flowcytometri. Ekspressionsprocenter af MSC-overfladeantigener i iPSC-drivende MSC'er via (A) EB-dannelse og (B) monolagskultur. C) hiPSC'er blev anvendt som negative kontrolstoffer. MSC'er negative markører: CD34, CD45; MSC's positive markører: CD73, CD90 og CD105. hiPSC'er negative markører: CD34, CD45, CD73 og CD105; hiPSCs positive markører: CD90. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Tre-linjers differentiering og spredningsevne for hiPSC-kørende MSC'er. (A) Alizarinrød farvning af calciumaflejringer af hiPSC-drivende MSC'er i osteogent differentieringsmedium i 2 uger. Skalastænger: 300 μm. (B) Kvantificering af Alizarinrød S-farvning ved ImageJ-analyse. (C) Oli rød O-farvning af lipiddråber af hiPSC-drivende MSC'er i adipogent differentieringsmedium i 2 uger. Skalastænger: 300 μm. (D) Kvantificering af Oli Red O-farvning ved ImageJ-analyse. E) Toluidinblå farvning af ekstracellulær chondrocytmatrix. Skalastænger: 300 μm og 150 μm. (F) Kvantificering af toluidinblåfarvning ved ImageJ-analyse. G) beregning af populationsfordoblingen af den høje PSC-drevne MSC-population. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Sammenligning | EB dannelse metode | Metode til enkeltlagskulturer |
| Differentieringstid | 27 dage | 35 dage |
| Koste | Høj | Lav |
| Spredning hastighed | Hurtig | Hurtig |
| Spredning evne | ≥20 passage | ≥20 passage |
| Udtryk for MSC-markører | CD73/CD90/CD105 positiv, CD34/CD45 nagativ | CD73/CD90/CD105 positiv, CD34/CD45 nagativ |
| Evne til differentiering | Adipogen differentiering, kondrogen differentiering og osteogen differentieringsevne | Adipogen differentiering, kondrogen differentiering og stærkere osteogen differentieringsevne |
| Operation | Kompliceret | Simpel |
Tabel 1: Karakteristika for de to metoder til differentiering af hiPSC'er i MSC'er.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne protokol blev to repræsentative metoder til differentiering af hiPSC'er i MSC'er undersøgt 20,21,22,23,24,25,26,27,28,30. Begge metoder var i stand til at aflede MSC'er fra hiPSC'er. De hiPSC-afledte MSC'er blev bekræftet ved cellemorfologi (figur 1), overfladeantigener (figur 2) og deres evne til at differentiere (figur 3).
Begge metoder delte det samme MSC-vedligeholdelsesmedium, mens EB-metoden også havde brug for et MSC-differentieringsmedium med TGF-β og FGF2. Derudover krævede EB-metoden lav fastgørelse af 6 brøndplader og en speciel ryster, der kan placeres i en kuldioxidinkubator. Derfor var omkostningerne ved EB-metoden højere end omkostningerne ved enkeltlagsmetoden18,20. EB-metoden syntes at være mere kompliceret end enkeltlagsmetoden. EB-metodens differentieringstid var imidlertid kortere, hvilket undgik flere passager for at berige MSC'er.
Vi konstaterede, at EB-metodens tolerance over for omgivelsesforhold var stærkere end monolagsmetodens. Begge metoder blev påvirket af iPSC-status, menneskelig indblanding og kulturmiljø11,20. Vi konstaterede imidlertid, at EB-metodens succesrate var meget højere end enkeltlagsmetodens. Nøglefasen i EB-metoden var EB-differentieringsfasen fra dag 1 til dag 7. I løbet af dag 1-7, hvis EB'er gradvist bliver mindre eller brudt med mange flydende døde celler i dyrkningsmediet eller danner vakuolerede EB'er, har disse ukvalificerede EB'er svært ved at klæbe til gelatinepladen og små, hvis nogen, klæbende celler, der kravler ud af EB'erne. Fra dag 1 til dag 7 var kvalificerede EB'er ensartede og ville være let forstørrede, hvis glatte kanter gradvist bliver ru med celler, der stikker ud. Efter at være blevet overført til gelatinepladen klæbede EB'erne hurtigt til pladen, og mange klæbende enkeltlagsceller spredte sig omkring EB'erne. Hvis EB'er er kvalificerede i dag 1-7, er efterfølgende differentiering let at opnå. I modsætning hertil kan monolagsmetoden mislykkes på ethvert tidspunkt. Fra dag 1 til dag 14 kan klæbende celler falde af i patches, hvilket indikerer en manglende differentiering. Normalt formerer klæbende celler sig og danner flerlags klæbende celler. Efter dag 14 ville monolagsmetoden stadig mislykkes, fordi få celler er fastgjort til skålen. I løbet af dag 0-13 i enkeltlagsmetoden observerede vi forskellige cellemorfologier i skålen. Imidlertid var cellemorfologien af EB-metoden på dag 8-17 homogen. Sammenlignet med enkeltlagsmetoden formoder vi, at EB-metoden ligner den embryonale udviklingsproces mere og er en mere kontrollerbar programmeret differentieringsmetode.
Begge metoder kunne bruges i mere end 20 passager og stadig opretholde en hurtig spredningsevne11. Calciumaflejringerne ved osteogen differentiering i enkeltlagsmetoden var mere end EB-metodens. Stamcellespecifikt serum skal anvendes for at undgå effekten af cytokiner i serum på differentiering. Vi observerede, at cellerne ville stoppe med at proliferere, hvis celletætheden var for lav. Så efter at have nået sammenløb, skal cellerne passeres i et 1: 3 splitforhold. Der blev ikke anvendt antibiotika under differentieringen; derfor er streng overholdelse af god laboratoriepraksis (GLP) obligatorisk for denne eksperimentelle opsætning.
Afslutningsvis var der fordele og ulemper for hver metode, der blev testet i denne protokol. Begge metoder kan generere MSC fra hiPSC'er, valget er baseret på brugerens krav.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi er meget taknemmelige for alle medlemmer af Mao og Hu Lab, fortid og nutid, for de interessante diskussioner og store bidrag til projektet. Vi er taknemmelige for National Clinical Research Center for Child Health for den store støtte. Denne undersøgelse blev økonomisk støttet af National Natural Science Foundation of China (U20A20351 til Jianhua Mao, 82200784 til Lidan Hu), Natural Science Foundation of Zhejiang-provinsen i Kina (nr. LQ22C070004 til Lidan Hu).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alizarin red staining kit | Beyotime Biotechnology | C0148S | |
| Anti-human-CD105 (PE) | Biolegend | 323206 | |
| Anti-human-CD34 (FITC) | Biolegend | 343503 | |
| Anti-human-CD45 (APC) | Biolegend | 304011 | |
| Anti-human-CD73( APC) | Biolegend | 344006 | |
| Anti-human-CD90 (FITC) | Biolegend | 328108 | |
| Ascorbic acid | Solarbio | A8100 | |
| BMP-6 | Novoprotein | C012 | |
| Carbon dioxide level shaker | Crystal | CO-06UC6 | |
| Compensation Beads | BioLegend | 424601 | |
| CryoStor CS10 | STEMCELL Technology | 07959 | |
| Dexamethasone | Beyotime Biotechnology | ST1254 | |
| DMEM/F12 medium | Servicebio | G4610 | |
| Fetal bovine serum | HAKATA | HS-FBS-500 | |
| FGF2 | Stemcell | 78003.1 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G2500-100G | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | |
| human IgG1 isotype control APC | BioLegend | 403505 | |
| human IgG1 isotype control FITC | BioLegend | 403507 | |
| human IgG1 isotype control PE | BioLegend | 403503 | |
| Human TGF-β1 | Stemcell | 78067 | |
| Human TruStain FcX | BioLegend | 422301 | |
| IBMX | Beyotime Biotechnology | ST1398 | |
| Indomethacin | Solarbio | SI9020 | |
| Insulin | Beyotime Biotechnology | P3376 | |
| iPSC maintenance medium | STEMCELL Technology | 85850 | |
| ITS Media Supplement | Beyotime Biotechnology | C0341-10mL | |
| Matrigel, growth factor reduced | BD Corning | 354230 | |
| Oli Red O staining kit | Beyotime Biotechnology | C0158S | |
| Proline | Solarbio | P0011 | |
| Sodium pyruvate | ThermoFisher | 11360-070 | |
| TGFβ3 | Novoprotein | CJ44 | |
| Toluidine blue staining kit | Solarbio | G2543 | |
| TrypLE Express Enzyme(1x) | Gibco | 12604013 | |
| Ultra-Low Attachment 6 Well Plate | Costar | 3471 | |
| Versene | Gibco | 15040-66 | |
| Y-27632 | Stemcell | 72304 | |
| α-MEM | Hyclone | SH30265 | |
| β-glycerophosphate | Solarbio | G8100 |
References
- Weng, Z., et al. Mesenchymal stem/stromal cell senescence: Hallmarks, mechanisms, and combating strategies. Stem Cells Translational Medicine. 11 (4), 356-371 (2022).
- Soliman, H., et al. Multipotent stromal cells: One name, multiple identities. Cell Stem Cell. 28 (10), 1690-1707 (2021).
- Friedenstein, A. J., Chailakhyan, R. K., Gerasimov, U. V. Bone marrow osteogenic stem cells: in vitro cultivation and transplantation in diffusion chambers. Cell and Tissue Kinetics. 20 (3), 263-272 (1987).
- Friedenstein, A. J., et al. Precursors for fibroblasts in different populations of hematopoietic cells as detected by the in vitro colony assay method. Experimental Hematology. 2 (2), 83-92 (1974).
- Friedenstein, A. J., Gorskaja, J. F., Kulagina, N. N. Fibroblast precursors in normal and irradiated mouse hematopoietic organs. Experimental Hematology. 4 (5), 267-274 (1976).
- El Agha, E., et al. Mesenchymal stem cells in fibrotic disease. Cell Stem Cell. 21 (2), 166-177 (2017).
- Mushahary, D., Spittler, A., Kasper, C., Weber, V., Charwat, V. Isolation, cultivation, and characterization of human mesenchymal stem cells. Cytometry A. 93 (1), 19-31 (2018).
- Ullah, M., Liu, D. D., Thakor, A. S. Mesenchymal stromal cell homing: Mechanisms and strategies for improvement. iScience. 15, 421-438 (2019).
- Regmi, S., et al. Enhanced viability and function of mesenchymal stromal cell spheroids is mediated via autophagy induction. Autophagy. 17 (10), 2991-3010 (2021).
- Hoang, D. M., et al. Stem cell-based therapy for human diseases. Signal Transduction and Targeted Therapy. 7 (1), 272 (2022).
- Jiang, B., et al. Concise review: Mesenchymal stem cells derived from human pluripotent cells, an unlimited and quality-controllable source for therapeutic applications. Stem Cells. 37 (5), 572-581 (2019).
- Soontararak, S., et al. Mesenchymal stem cells (MSC) derived from induced pluripotent stem cells (iPSC) equivalent to adipose-derived MSC in promoting intestinal healing and microbiome normalization in mouse inflammatory bowel disease model. Stem Cells Translational Medicine. 7 (6), 456-467 (2018).
- Di Baldassarre, A., Cimetta, E., Bollini, S., Gaggi, G., Ghinassi, B. Human-induced pluripotent stem cell technology and cardiomyocyte generation: Progress and clinical applications. Cells. 7 (6), 48 (2018).
- Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress. Nature Reviews. Drug Discovery. 16 (2), 115-130 (2017).
- Levy, O., et al. Shattering barriers toward clinically meaningful MSC therapies. Science Advances. 6 (30), eaba6884 (2020).
- Zhao, C., Ikeya, M. Generation and applications of induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells International. 2018, 9601623 (2018).
- Path, G., Perakakis, N., Mantzoros, C. S., Seufert, J. Stem cells in the treatment of diabetes mellitus - Focus on mesenchymal stem cells. Metabolism. 90, 1-15 (2019).
- Zhou, Y., et al. One-step derivation of functional mesenchymal stem cells from human pluripotent stem cells. Bio-Protocol. 8 (22), e3080 (2018).
- Hua, Z., et al. Low-intensity pulsed ultrasound promotes osteogenic potential of iPSC-derived MSCs but fails to simplify the iPSC-EB-MSC differentiation process. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 841778 (2022).
- Dupuis, V., Oltra, E. Methods to produce induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells: Mesenchymal stem cells from induced pluripotent stem cells. World Journal of Stem Cells. 13 (8), 1094-1111 (2021).
- Zhang, W., et al. Aging stem cells. A Werner syndrome stem cell model unveils heterochromatin alterations as a driver of human aging. Science. 348 (6239), 1160-1163 (2015).
- Liu, G. H., et al. Modelling Fanconi anemia pathogenesis and therapeutics using integration-free patient-derived iPSCs. Nature Communications. 5, 4330 (2014).
- Kubben, N., et al. Repression of the antioxidant NRF2 pathway in premature aging. Cell. 165 (6), 1361-1374 (2016).
- Duan, S., et al. PTEN deficiency reprogrammes human neural stem cells towards a glioblastoma stem cell-like phenotype. Nature Communications. 6, 10068 (2015).
- Zhang, J., et al. Exosomes released from human induced pluripotent stem cells-derived MSCs facilitate cutaneous wound healing by promoting collagen synthesis and angiogenesis. Journal of Translational Medicine. 13, 49 (2015).
- Hu, G. W., et al. Exosomes secreted by human-induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells attenuate limb ischemia by promoting angiogenesis in mice. Stem Cell Research & Therapy. 6 (1), 10 (2015).
- Kang, R., et al. Mesenchymal stem cells derived from human induced pluripotent stem cells retain adequate osteogenicity and chondrogenicity but less adipogenicity. Stem Cell Research & Therapy. 6 (1), 144 (2015).
- Wang, L. T., et al. Differentiation of mesenchymal stem cells from human induced pluripotent stem cells results in downregulation of c-Myc and DNA replication pathways with immunomodulation toward CD4 and CD8 cells. Stem Cells. 36 (6), 903-914 (2018).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Kim, S., Kim, T. M. Generation of mesenchymal stem-like cells for producing extracellular vesicles. World Journal of Stem Cells. 11 (5), 270-280 (2019).
