Summary
Denne protokollen beskriver og sammenligner to representative metoder for å differensiere hiscc til mesenkymale stromale celler (MSC). Monolagsmetoden er preget av lavere kostnad, enklere drift og enklere osteogen differensiering. Embryoidlegememetoden (EB) er preget av lavere tidsforbruk.
Abstract
Mesenkymale stromale celler (MSC) er voksne pluripotente stamceller som har blitt mye brukt i regenerativ medisin. Ettersom somatiske vevsavledede MSC-er er begrenset av begrenset donasjon, kvalitetsvariasjoner og biosikkerhet, har de siste 10 årene sett en stor økning i innsatsen for å generere MSC fra humane induserte pluripotente stamceller (hiPSCs). Tidligere og nyere innsats i differensiering av hissc i MSC har vært sentrert rundt to kulturmetoder: (1) dannelsen av embryoidlegemer (EB) og (2) bruken av monolagskultur. Denne protokollen beskriver disse to representative metodene for å utlede MSC fra hiPSCer. Hver metode presenterer sine fordeler og ulemper, inkludert tid, kostnad, celleproliferasjonsevne, ekspresjon av MSC-markører og deres evne til differensiering in vitro. Denne protokollen viser at begge metodene kan utlede modne og funksjonelle MSC-er fra hiPSCer. Monolagsmetoden er preget av lavere kostnad, enklere drift og enklere osteogen differensiering, mens EB-metoden er preget av lavere tidsforbruk.
Introduction
Mesenkymale stromale celler (MSC) er mesodermavledede voksne pluripotente stamceller1. MSC finnes i nesten alle bindevev2. Siden MSC først ble oppdaget på 1970-tallet og vellykket isolert fra benmarg i 1987 av Friedenstein et al.3,4,5, har en rekke humane somatiske (inkludert foster og voksen) vev blitt brukt til å isolere MSC som bein, brusk, sener, muskel, fettvev og hematopoietisk støttende stroma 1,2,6,7. MSC demonstrerer høy proliferativ evne og plastisitet for å differensiere i mange somatiske cellelinjer og kan migrere til skadet og betent vev 2,8,9. Disse egenskapene gjør MSC til en potensiell kandidat for regenerativ medisin10. Imidlertid er somatiske vevsavledede MSCer (st-MSC) begrenset av begrenset donasjon, begrenset celleproliferativ kapasitet, kvalitetsvariasjoner og biosikkerhetsbekymring for mulig overføring av patogener, hvis noen, fra giverne11,12.
Humaninduserte pluripotente stamceller (hiPSCs) er avledet fra voksne celler som omprogrammerer med transkripsjonsfaktorer (Oct4, Sox2, Klf4 og c-Myc), som har lignende funksjoner som embryonale stamceller 13,14. De kan selvfornye seg og ha potensialet til å differensiere til alle typer somatiske celler, inkludert MSC. Sammenlignet med st-MSC har iPSC-MSC fordelen av ubegrenset forsyning, lavere kostnad, høyere renhet, bekvemmelighet i kvalitetskontroll, enkel for skalaproduksjon og genmodifisering 15,16,17.
På grunn av disse fordelene med iPSC-MSC, har en rekke metoder som driver MSC fra iPSC blitt rapportert. Disse differensieringsmetodene har vært sentrert rundt to kulturmetoder: (1) dannelsen av embryoidlegemer (EB) og (2) bruken av monolagskulturer 11,18,19,20. Her ble en representativ tilnærming for hver av de to metodene karakterisert. Videre ble sammenligninger mellom to representative tilnærminger basert på tid, kostnad, spredningsevne, uttrykk for MSC-biomarkører og differensieringsevne in vitro også tilgjengelig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Vedlikehold av hiPSCs
- Tining av hisc
- Ta ut cellene fra det flytende nitrogenet og tine cellene raskt i et vannbad på 37 °C. Overfør tinecellene til et 15 ml rør klargjort med 3 ml iPSC vedlikeholdsmedium (materialfortegnelse). Bland mediet forsiktig.
- Sentrifuge ved 300 x g i 5 min. Fjern supernatanten og resuspender cellene forsiktig i 1 ml iPSC vedlikeholdsmedium med 10 μM Y-27632 (pipett cellene opp og ned 2-3 ganger).
- Overfør cellesuspensjonen til en 6-brønns vevskulturplate belagt med vekstfaktorredusert (GFR)-ekstracellulær matriksgel (1:100) og 2 ml iPSC vedlikeholdsmedium med 10 μM Y-27632 tilsatt på forhånd (ca. 4 x 104 celler/cm2).
- Dyrk cellene i 5-6 dager (80%-90% sammenløp) ved 37 °C, 5% CO2 med iPSC vedlikeholdsmedier skiftes hver dag.
- Passasje av hiPSC
- Fjern iPSC vedlikeholdsmediet fra 6-brønnsplaten. Vask hiPSCene én gang med DPBS.
- Tilsett 700-800 μL 0,48 mM EDTA-oppløsning og inkuber i 1 min ved romtemperatur (RT), og fjern deretter fordøyelsessystemet. Fortsett å ruge ved 37 °C temperatur i 3-5 minutter.
- Når celler fordøyes i ark (ikke fordøy celler i enkeltceller), tilsett 1 ml iPSC vedlikeholdsmedium med 10 μM Y-27632 for å avslutte fordøyelsen. Pipetter cellene forsiktig opp og ned 2-3 ganger.
- Overfør cellesuspensjonen til en 6-brønns vevskulturplate belagt med vekstfaktorredusert (GFR)-ekstracellulær matriksgel (1:100) og 2 ml iPSC vedlikeholdsmedium med 10 μM Y-27632 tilsatt på forhånd.
MERK: Passasjeforholdet varierer fra 1:6 til 1:20 (ca. 4 x 104 celler/cm2), og gjennomsnittlig aggregeringsstørrelse er ca. 50-200 μm. - Dyrk cellene til 80%-90% konfluens (5-6 dager) ved 37 °C, 5% CO2 med iPSC vedlikeholdsmedier skiftes hver dag.
2. MSCs differensiering fra hiPSCs via EB-dannelse
MERK: Metoden er hentet fra tidligere litteratur 21,22,23,24. En oversikt over metoden er illustrert i figur 1. Egenskapene ved metoden er oppsummert i tabell 1.
- Fremstilling av mediet
- Forbered MSC-differensieringsmedium ved å supplere α-MEM med 1 % (v/v) GlutaMAX, 10 % (v/v) FBS, 10 ng/ml FGF2 og 5 ng/ml TGFβ.
- Forbered MSC-vedlikeholdsmedium ved å supplere α-MEM med 1 % (v/v) GlutMAX, 10 % (v/v) FBS og 1 ng/ml FGF2.
- Tilberedning av hiPSCer
- Dyrkningshiscs linjer (passasje minst 2-3 ganger etter tining) i iPSC vedlikeholdsmedium på en 6-brønns vevskulturplate belagt med vekstfaktorredusert (GFR)-ekstracellulær matriksgel (1:100) ved 37 °C, 5% CO2 til 80% -90% konfluens.
- Dag 0: EB-dannelse
- Fjern iPSC vedlikeholdsmediet fra 6-brønnsplaten. Vask hiPSCene én gang med DPBS.
- Tilsett 700-800 μL 0,48 mM EDTA-oppløsning og inkuber i 1 min ved RT, og fjern deretter fordøyelsessystemet. Fortsett å ruge ved 37 °C temperatur i 3-5 minutter.
- Når celler fordøyes i ark (ikke fordøy celler i enkeltceller), tilsett 2 ml iPSCs vedlikeholdsmedium (inneholdende 10 μM Rock-hemmer og 1:100 GFR- ekstracellulær matriksgel) for å avslutte fordøyelsen.
- Overfør cellene til en 6-brønns lav festeplate. Frø cellene i et forhold på 2 brønner av vevskulturplate til 1 brønn med lav festeplate. Inkuber cellene i en shaker (60 rpm/min) ved 37 °C, 5% CO2 i 24 timer for å danne sfæriske EBer.
- Dag 1-Dag 7: EB-differensiering
- Overfør EB-ene til sentrifugerøret med en Pasteur-pipette (uten å ødelegge EB) og la EB-ene naturlig sedimentere i 5-10 minutter ved RT. Fjern deretter supernatanten.
- Overfør EB-ene til en 6-brønns lav festeplate med 2 ml MSC-differensieringsmedium. Dyrk EB på shakeren ved 37 °C, 5 % CO2 i 7 dager med middels endring én gang.
- Dag 8-Dag 17: EB-inokulering
- Overfør EB-ene til sentrifugerøret med en Pasteur-pipette (uten å ødelegge EB-er) og la EB-ene sedimentere naturlig i 5-10 minutter. Fjern deretter supernatanten.
- Overfør EB-ene til en GFR-ekstracellulær matriksgelbelagt 6-brønnsplate med 2 ml MSC vedlikeholdsmedium. Kultur til 90% konfluens (~ 10 dager) med regelmessig medieendring etter celleadhesjon.
- Dag 18-Dag 27: MSCs modning og ekspansjon
- Behandle den EB-avledede kulturen med en dissosiasjonsløsning ved 37 °C i 5-10 minutter (fordøyelsestiden varierer på grunn av tilstedeværelsen av forskjellige celletyper).
- Når en del av cellene fordøyes i enkeltceller, tilsett 2 ml av MSCs vedlikeholdsmedium for å avslutte fordøyelsen og overføre cellesuspensjonen til et sentrifugerør. Vask de resterende ufordøyd cellene en gang med DPBS og fordøye igjen. Gjenta flere ganger til alle celler er fordøyd i enkeltceller. Sentrifuger cellesuspensjonen ved 250 x g i 5 minutter, og fjern deretter supernatanten.
- Frø cellene på en gelatinbelagt dyrkningsplate (ca. 2 x 105 celler/cm2). Kultur til 90% sammenløp i MSC vedlikeholdsmedium med middels endring regelmessig. Angi denne generasjonen av celler som passasje 0 (P0) på dette punktet.
- For å gjøre MSC ren og moden, fortsett å passere cellene to ganger i et 1: 3-delingsforhold på omtrent 6 dager. De fleste cellene presenterer fibroblastlignende morfologi (spindelformet).
3. MSCs differensiering fra hiPSCs via monolagskultur
MERK: Metoden er hentet fra tidligere litteratur 25,26,27,28. En oversikt over denne metoden er illustrert i figur 1. Egenskapene ved metoden er oppsummert i tabell 1.
- Fremstilling av mediet
- Forbered MSC-vedlikeholdsmediet ved å supplere α-MEM med 1 % (v/v) GlutMAX, 10 % (v/v) FBS og 1 ng/ml FGF2.
- Tilberedning av hiPSCer
- HiPSC-linjer for dyrkning (passasje minst 2-3 ganger etter tining) i iPSC vedlikeholdsmedium på en 6-brønns vevskulturplate belagt med vekstfaktorredusert (GFR)-ekstracellulær matriksgel (1:100) ved 37 °C, 5 % CO2 til 50 %-60 % konfluens.
- Dag 0-Dag 13: Differensiering ved direkte monolagskulturer
- Fjern iPSC vedlikeholdsmediet fra 6-brønnsplaten.
- Tilsett direkte 2 ml av MSCs vedlikeholdsmedium og kultur i 14 dager ved 37 °C, 5 % CO2, med medieskifte hver dag.
- Dag 14-Dag 35: MSCs modning ved gjentatt passasje
- Behandle monolagskulturer med en dissosiasjonsløsning ved 37 °C i 5-10 minutter (fordøyelsestiden varierer på grunn av tilstedeværelsen av forskjellige celletyper).
- Når cellene fordøyes i enkeltceller, tilsett 2 ml MSC vedlikeholdsmedium for å avslutte fordøyelsen og overføre cellesuspensjonen til sentrifugerøret. Vask de resterende ufordøyd cellene en gang med DPBS og fordøye igjen. Gjenta flere ganger til alle celler er fordøyd i enkeltceller. Sentrifuger cellesuspensjonen ved 250 x g i 5 minutter, og fjern deretter supernatanten.
- Frø cellene på en gelatinbelagt kulturskål (ca. 2 x 105 celler/cm2). Kultur til 90% sammenløp i MSC vedlikeholdsmedium med medieendring regelmessig. Angi denne generasjonen av celler som passasje 0 (P0) på dette punktet.
- For å gjøre MSC ren og moden, fortsett å passere cellene 6 ganger i et 1:3-delingsforhold på ca. 18 dager. De fleste cellene presenterer fibroblastlignende morfologi (spindelformet).
4. Overflateantigenanalyse av hiPSC-drivende MSCer ved flowcytometri
MERK: I likhet med overflateantigenene til benmargsavledede MSC-er, uttrykker hiPSC-drivende MSC CD105, CD73 og CD90, men uttrykker ikke CD45, CD3429. I tillegg kan hissc brukes som negative kontrollceller. Overflateantigenanalyse av hiPSC-drivende MSC og hiPSC ved flowcytometri er vist i figur 2.
- Behandle de hisc-drivende MSC-ene med en dissosiasjonsløsning ved 37 °C i 2-3 minutter. Behandle hiPSCene med 0,48 mM EDTA dissosiasjonsreagens og inkuber i 1 min ved RT, og fjern deretter dissosiasjonsreagenset. Fortsett å ruge ved 37 °C temperatur i 3-5 minutter.
- Når cellene fordøyes i enkeltceller, tilsett medium (MSC vedlikeholdsmedium til MSC og iPSC vedlikeholdsmedium til iPSCs) for å avslutte fordøyelsen.
- Sentrifuger cellesuspensjonen ved 350 x g i 5 minutter, og fjern deretter supernatanten.
- Vask cellene en gang med kald DPBS, sentrifuge ved 350 x g i 5 minutter, og fjern deretter supernatanten.
- Telle og resuspendere cellene i kald 10% FBS-DPBS (v / v) løsning ved 10 x 106 celler / ml og fordel 100 μL / rør av cellesuspensjon (1 x 106 celler / rør) i 1,5 ml sentrifugerør.
- Tilsett 5 μL human Fc-reseptorblokkerende oppløsning til 100 mikrol cellesuspensjon. Inkuber i 5-10 minutter ved RT for å utføre ikke-spesifikk blokkering.
- Sentrifuge ved 350 x g i 5 min og fjern supernatanten. Vask cellene to ganger med en kald 2% FBS-DPBS (v / v) løsning.
- Resuspender cellene i kald 100 μL 2% FBS-DPBS (v / v) løsning.
- Legg til 5 μL (1 test) anti-CD34-FITC og 5 μL (1 test) anti-CD45-APC til 100 μL-cellen
Fjæring. Tilsett 5 μL (1 test) anti-CD73-APC, 5 μL (1 test) anti-CD90-FITC og 5 μL (1 test) anti-CD105-PE til et annet 100 μL cellesuspensjonsrør. Legg til 5 μL human IgG1 isotypekontroll FITC, human IgG1 isotypekontroll PE og human IgG1 isotypekontroll APC til det tredje 100 μL cellesuspensjonsrøret. Rug i 15-20 min på is i mørket. I mellomtiden forbereder du enkeltfargede perler. - Vask cellene to ganger med en kald 2% FBS-DPBS (v / v) løsning.
- Tilsett 300 μL kald 2% FBS-DPBS (v / v) løsning for å resuspendere cellene, og filtrer via 200 mesh skjermfilter.
- Analyser prøvene ved hjelp av flowcytometri. Analyser cellesuspensjonen farget med isotypekontrollantistoffer og sett port. Analyser deretter cellesuspensjon farget med målantistoffer.
5. Osteogen differensiering av hiPSC-drivende MSC
MERK: De hiPSC-drivende MSC-ene har osteogent differensieringspotensial (figur 3A, B). Protokollen for osteogen differensiering er gitt nedenfor.
- Forbered osteogent induksjonsmedium ved å supplere α-MEM med 10% FBS, 100 nM deksametason, 10 mM beta-glycerofosfat og 100 μM askorbinsyre.
- Frø 1 x 105 MSC i en gelatinbelagt 48-brønns plate og kultur til den er 60% -70% sammenflytende.
- Fjern mediet og tilsett 0,3 ml osteogent induksjonsmedium. Dyrkning av cellene i et osteogent induksjonsmedium i 14 dager ved 37 °C, 5% CO2, med medieskifte hver 3.
- Fjern mediet og vask med DPBS en gang.
- Tilsett 0,3 ml 4% PFA og inkuber ved RT i 30 minutter.
- Fjern PFA. Skyll cellene med 0,3 ml DPBS i 10 minutter ved RT og gjenta 3 ganger.
- Fjern DPBS, tilsett 0,2 ml Alizarin rødfargeløsning, og inkuber i 30 minutter ved RT.
- Fjern fargeløsningen, skyll cellene med 0,3 ml DPBS i 10 minutter ved RT, og gjenta 3 ganger.
- Vær oppmerksom på farging av kalsiumavsetning under et lysmikroskop.
6. Adipogen differensiering av hiPSC-drivende MSC-er
MERK: De hiPSC-drivende MSC-ene har adipogent differensieringspotensial (figur 3C, D). Protokollen for adipogen differensiering er gitt nedenfor.
- Preparare adipogent induksjonsmedium ved å supplere α-MEM med 10 % FBS, 1 μM deksametason, 1 μM IBMX, 10 μg/ml insulin og 100 μM indometacin. Preparare adipogen vedlikeholdsmedium ved å supplere α-MEM med 10 % FBS og 10 μg/ml insulin.
- Frø 1 x 105 MSC til en gelatinbelagt 48-brønnsplate og kultur til celletettheten når 90%.
- Fjern mediet og tilsett 0,3 ml adipogent induksjonsmedium. Fortsett å dyrke cellene i det adipogene induksjonsmediet i 4 dager ved 37 °C, 5 % CO2.
- Fjern mediet og tilsett 0,3 ml adipogen vedlikeholdsmedium. Fortsett å dyrke cellene i det adipogene vedlikeholdsmediet i 3 dager ved 37 °C, 5% CO2.
- Gjenta trinn 6,3 og 6,4 2-3 ganger frem til adipocyttdifferensiering og modning.
- Fjern mediet og vask med DPBS en gang.
- Tilsett 0,3 ml 4% PFA og inkuber ved RT i 10 minutter. Fjern PFA og skyll 2 ganger med DPBS.
- Påfør Oli Red O-flekken i henhold til produsentens instruksjon og observer lipiddråpene under et lysmikroskop.
7. Kondrogen differensiering av hiPSC-drivende MSC-er
MERK: De hiPSC-drivende MSC-ene har kondrogent differensieringspotensial (figur 3E, F). Protokollen for kondrogen differensiering er gitt nedenfor.
- Forbered kondroblastinduksjonsmedium ved å supplere α-MEM med 10% FBS, 100 nM deksametason, 1% insulin-transferrin-selen (ITS), 10 μM askorbinsyre, 1 mM natriumpyruvat, 50 μg / ml prolin, 0,02 nM transformerende vekstfaktor β3 (TGFβ3) og 0,5 μg / ml benmorfogenetisk protein 6 (BMP-6).
- Samle 2,5 x 105 hiPSC-drivende MSC-er og sentrifuger cellene ved 150 x g i 5 minutter, og fjern deretter supernatanten. Suspender cellene i 1 ml α-MEM og sentrifuge deretter ved 150 x g i 5 minutter.
- Fjern supernatanten og suspender cellene i 0,5 ml kondrogent induksjonsmedium. Sentrifuger cellene ved 150 x g i 5 minutter.
- Skru av lokket og kulturen direkte i 21 dager med kondrogene induksjonsmedier, skift hver 3. dag ved 37 °C, 5 % CO2. Flikk sentrifugerøret forsiktig for å suspendere kondrogene pellets (uten å ødelegge kondrogene pellets) hver dag under kondrogen differensiering.
- Fjern supernatanten og vask med 0,5 ml PBS to ganger.
- Tilsett 0,3 ml 4% PFA og fiks i 24 timer.
- Parafin legger inn kondrogene pellets, og deretter seksjonerer dem (3 μm). Beis seksjonene i toluidinblått (1%) i 30 minutter.
- Observer den ekstracellulære kondrocytmatrisen under et lysmikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etter protokollen (figur 1A) ble hissc differensiert til MSC via EB-formasjons- og monolagskulturmetodene. Under differensiering viste cellene ulike representative morfologier (figur 1B,C).
Som vist i figur 1B viser hiPSC-koloniene typisk kompakt morfologi før differensiering med en klar kant sammensatt av tettpakkede celler. Ensartede sfæriske EBer dannet etter hiPSCs dissosiering og dyrking i 24 timer på shakeren. I løpet av dag 1 til dag 7 av kulturen i MSCs differensieringsmedium ble den glatte kanten av EB grov, og volumet av EB vokste stort. Fra dag 8 til dag 17, etter overføring av EBs til en GFR-ekstracellulær matriks gelbelagt 6-brønnsplate, festet EBs seg gradvis til platen, og mange adherente monolayer-celler spredte seg rundt EBene. Når cellene nådde 90% konfluens på dag 18, ble cellene fordøyd og sådd på en gelatinbelagt kulturplate. På dag 19 festet cellen seg og viste en polygonal form. Etter hverandre ble cellene passert to ganger da de var 90% sammenflytende. De avledede MSC-ene modnet gradvis og viste en typisk spindelform, og kolonien vokste i en virvel.
Som vist i figur 1C økte cellevolumet og spredte seg rundt kolonien etter å ha erstattet iPSC-vedlikeholdsmediet med MSC-vedlikeholdsmediet i 24 timer. Mens de ble dyrket i et MSC-vedlikeholdsmedium, prolifererte cellene gradvis og dannet flerlags adherente celler. På dag 14 ble cellene fordøyd og sådd på en gelatinbelagt dyrkningsplate. På dag 15 festet cellen seg og viste en polygonal form. Etter hverandre ble cellene passert 6 ganger da de var 90% sammenflytende. De avledede MSC-ene modnet gradvis og viste en typisk spindelform, og kolonien vokste i en virvel.
Overflateantigenene til hiPSC og hiPSC-drivende MSC ble analysert med flowcytometri (figur 2). Som vist i figur 2C var hissc positive for CD90 og negative for CD34, CD45, CD73 og CD105. Etter å ha differensiert hiPSC til MSC via begge metodene, var MSC-ene positive for CD90, CD73 og CD105, og negative for CD34 og CD45 (figur 2A,B).
Differensieringsevnen til hiPSC-drivende MSC ble undersøkt ved osteogen, adipogen og kondrogen differensiering. Som vist i figur 3 differensierte begge hiPSC-drivende MSC av de to metodene seg i osteoblast, adipocytt og kondrocytt. De hiPSC-drivende MSC-ene i monolagsmetoden dannet flere kalkavleiringer enn EB-metoden (figur 3B). De to metodene hadde ingen signifikant forskjell i adipogen differensiering og kondrogen differensieringsevne (figur 3D,F).
Spredningsevnen til hiPSC-drivende MSC-er ble undersøkt ved kontinuerlig passasjekultur. Som vist i figur 3G, kan de hiPSC-drivende MSC-ene for begge metodene passeres i mer enn 20 passasjer og fortsatt opprettholde en rask spredningsevne.
Sammenligningen mellom de to tilnærmingene vist i tabell 1 er basert på differensieringstid, kostnad, celleproliferasjonsevne, MSC-markørers uttrykk og deres differensieringsevne in vitro.
Figur 1: Differensiering av hiPSCs til MSC via EB-dannelsesmetode og monolagskulturmetode. (A) Skjematisk som viser differensiering av hiPSCer til MSC via EB-dannelse og monolagskultur. Representasjonsmorfologi av celler ved nøkkelfager under MSCs derivasjon fra hiPSCs via (B) EB-dannelse og (C) monolagskultur. Skalastenger: 300 μm og 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: HiPSC-drivende MSCs overflateantigenanalyse ved flowcytometri. Ekspresjonsprosenter av MSC-overflateantigener i iPSC-drivende MSC via (A) EB-dannelse og (B) monolagskultur. (C) hiPSCs ble brukt som negativ kontroll. MSCs negative markører: CD34, CD45; MSCs positive markører: CD73, CD90 og CD105. hiPSCs negative markører: CD34, CD45, CD73 og CD105; hiPSCs positive markører: CD90. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Trelinjers differensiering og spredningsevne for hiPSC-drivende MSC-er. (A) Alizarin rødfarging av kalkavleiringer av hisc-drivende MSC i osteogent differensieringsmedium i 2 uker. Skala barer: 300 μm. (B) Kvantifisering av Alizarin rød S-farging ved ImageJ-analyse. (C) Oli rød O-farging av lipiddråper av hiPSC-drivende MSC i adipogen differensieringsmedium i 2 uker. Skalastenger: 300 μm. (D) Kvantifisering av Oli Red O-farging ved ImageJ-analyse. (E) Toluidinblå farging av ekstracellulær kondrocytmatriks. Skalastenger: 300 μm og 150 μm. (F) Kvantifisering av toluidinblå farging ved ImageJ-analyse. (G) hiPSC-drivende MSC-er befolkningsdoblingstidsberegning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Sammenligning | EB-dannelsesmetode | Monolayer kulturer metode |
| Differensieringstid | 27 dager | 35 dager |
| Kostnad | Høy | Lav |
| Spredningshastighet | Hurtig | Hurtig |
| Spredningsevne | ≥20 Passasje | ≥20 Passasje |
| Uttrykk for MSC-markører | CD73/CD90/CD105 positiv, CD34/CD45 nagativ | CD73/CD90/CD105 positiv, CD34/CD45 nagativ |
| Evne til differensiering | Adipogen differensiering, kondrogen differensiering og osteogen differensieringsevne | Adipogen differensiering, kondrogen differensiering og sterkere osteogen differensieringsevne |
| Operasjon | Komplisert | Enkel |
Tabell 1: Karakteristika for de to metodene for å differensiere hiPSC til MSC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne protokollen ble to representative metoder for å differensiere hiPSCer til MSC undersøkt 20,21,22,23,24,25,26,27,28,30. Begge metodene var i stand til å utlede MSC fra hiPSCs. De hiPSC-deriverte MSC-ene ble bekreftet ved cellemorfologi (figur 1), overflateantigener (figur 2) og deres evne til å differensiere (figur 3).
Begge metodene delte samme MSC vedlikeholdsmedium, mens EB-metoden også trengte et MSC-differensieringsmedium med TGF-β og FGF2. I tillegg krevde EB-metoden lav montering av 6 brønnplater og en spesiell shaker som kan plasseres i en karbondioksidinkubator. Derfor var kostnaden for EB-metoden høyere enn for monolagsmetoden18,20. EB-metoden syntes å være mer komplisert enn monolagsmetoden. Imidlertid var differensieringstiden for EB-metoden kortere, noe som unngikk flere passasjer for å berike MSC.
Vi fant at toleransen for omgivelsesforhold i EB-metoden var sterkere enn monolagsmetoden. Begge metodene ble påvirket av iPSC-status, menneskelig innblanding og kulturmiljø11,20. Vi fant imidlertid at suksessforholdet for EB-metoden var mye høyere enn monolagsmetoden. Det viktigste trinnet i EB-metoden var EB-differensieringsstadiet fra dag 1 til dag 7. I løpet av dagene 1-7, hvis EB gradvis blir mindre eller ødelagt med mange flytende døde celler i kulturmediet eller danner vakuolformede EBer, har disse ukvalifiserte EBene problemer med å feste seg til gelatinplaten og små, om noen, adherente celler som kryper ut av EB-ene. Fra dag 1 til dag 7 var kvalifiserte EB-er ensartede og ville være litt forstørrede, glatte kanter som gradvis blir grove med celler som stikker ut. Etter å ha blitt overført til gelatinplaten, festet EB-ene seg raskt til platen, og mange adherente monolayer-celler spredte seg rundt EB-ene. Hvis EB er kvalifisert i løpet av dagene 1-7, er påfølgende differensiering lett å oppnå. I motsetning til dette kan monolagsmetoden mislykkes når som helst. Fra dag 1 til dag 14 kan adherente celler falle av i flekker, noe som indikerer en svikt i differensiering. Normalt prolifererer adherente celler og danner flerlags adherente celler. Etter dag 14 vil monolagsmetoden fortsatt mislykkes fordi få celler er festet til parabolen. I løpet av dagene 0-13 av monolagsmetoden observerte vi ulik cellemorfologi i retten. Imidlertid var cellemorfologien til EB-metoden på dag 8-17 homogen. Sammenlignet med monolagsmetoden mistenker vi at EB-metoden ligner mer på den embryonale utviklingsprosessen og er en mer kontrollerbar programmert differensieringsmetode.
Begge metodene kunne brukes i mer enn 20 passasjer og fortsatt opprettholde en rask spredningsevne11. Kalkavleiringene av osteogen differensiering i monolagsmetoden var mer enn i EB-metoden. Stamcellespesifikt serum må brukes for å unngå effekten av cytokiner i serum på differensiering. Vi observerte at cellene ville slutte å spre seg hvis celletettheten var for lav. Så, etter å ha nådd sammenløp, må cellene passeres i et 1: 3-delingsforhold. Ingen antibiotika ble brukt under differensieringen; Derfor er streng overholdelse av god laboratoriepraksis (GLP) obligatorisk for dette eksperimentelle oppsettet.
Avslutningsvis var det fordeler og ulemper for hver metode som ble testet i denne protokollen. Begge metodene kan generere MSC fra hiPSCs, valget er basert på brukerens krav.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi er svært takknemlige for alle medlemmer av Mao og Hu Lab, fortid og nåtid, for interessante diskusjoner og gode bidrag til prosjektet. Vi er takknemlige til National Clinical Research Center for Child Health for den store støtten. Denne studien ble støttet økonomisk av National Natural Science Foundation of China (U20A20351 til Jianhua Mao, 82200784 til Lidan Hu), Natural Science Foundation of Zhejiang Province of China (nr. LQ22C070004 til Lidan Hu).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alizarin red staining kit | Beyotime Biotechnology | C0148S | |
| Anti-human-CD105 (PE) | Biolegend | 323206 | |
| Anti-human-CD34 (FITC) | Biolegend | 343503 | |
| Anti-human-CD45 (APC) | Biolegend | 304011 | |
| Anti-human-CD73( APC) | Biolegend | 344006 | |
| Anti-human-CD90 (FITC) | Biolegend | 328108 | |
| Ascorbic acid | Solarbio | A8100 | |
| BMP-6 | Novoprotein | C012 | |
| Carbon dioxide level shaker | Crystal | CO-06UC6 | |
| Compensation Beads | BioLegend | 424601 | |
| CryoStor CS10 | STEMCELL Technology | 07959 | |
| Dexamethasone | Beyotime Biotechnology | ST1254 | |
| DMEM/F12 medium | Servicebio | G4610 | |
| Fetal bovine serum | HAKATA | HS-FBS-500 | |
| FGF2 | Stemcell | 78003.1 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G2500-100G | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | |
| human IgG1 isotype control APC | BioLegend | 403505 | |
| human IgG1 isotype control FITC | BioLegend | 403507 | |
| human IgG1 isotype control PE | BioLegend | 403503 | |
| Human TGF-β1 | Stemcell | 78067 | |
| Human TruStain FcX | BioLegend | 422301 | |
| IBMX | Beyotime Biotechnology | ST1398 | |
| Indomethacin | Solarbio | SI9020 | |
| Insulin | Beyotime Biotechnology | P3376 | |
| iPSC maintenance medium | STEMCELL Technology | 85850 | |
| ITS Media Supplement | Beyotime Biotechnology | C0341-10mL | |
| Matrigel, growth factor reduced | BD Corning | 354230 | |
| Oli Red O staining kit | Beyotime Biotechnology | C0158S | |
| Proline | Solarbio | P0011 | |
| Sodium pyruvate | ThermoFisher | 11360-070 | |
| TGFβ3 | Novoprotein | CJ44 | |
| Toluidine blue staining kit | Solarbio | G2543 | |
| TrypLE Express Enzyme(1x) | Gibco | 12604013 | |
| Ultra-Low Attachment 6 Well Plate | Costar | 3471 | |
| Versene | Gibco | 15040-66 | |
| Y-27632 | Stemcell | 72304 | |
| α-MEM | Hyclone | SH30265 | |
| β-glycerophosphate | Solarbio | G8100 |
References
- Weng, Z., et al. Mesenchymal stem/stromal cell senescence: Hallmarks, mechanisms, and combating strategies. Stem Cells Translational Medicine. 11 (4), 356-371 (2022).
- Soliman, H., et al. Multipotent stromal cells: One name, multiple identities. Cell Stem Cell. 28 (10), 1690-1707 (2021).
- Friedenstein, A. J., Chailakhyan, R. K., Gerasimov, U. V. Bone marrow osteogenic stem cells: in vitro cultivation and transplantation in diffusion chambers. Cell and Tissue Kinetics. 20 (3), 263-272 (1987).
- Friedenstein, A. J., et al. Precursors for fibroblasts in different populations of hematopoietic cells as detected by the in vitro colony assay method. Experimental Hematology. 2 (2), 83-92 (1974).
- Friedenstein, A. J., Gorskaja, J. F., Kulagina, N. N. Fibroblast precursors in normal and irradiated mouse hematopoietic organs. Experimental Hematology. 4 (5), 267-274 (1976).
- El Agha, E., et al. Mesenchymal stem cells in fibrotic disease. Cell Stem Cell. 21 (2), 166-177 (2017).
- Mushahary, D., Spittler, A., Kasper, C., Weber, V., Charwat, V. Isolation, cultivation, and characterization of human mesenchymal stem cells. Cytometry A. 93 (1), 19-31 (2018).
- Ullah, M., Liu, D. D., Thakor, A. S. Mesenchymal stromal cell homing: Mechanisms and strategies for improvement. iScience. 15, 421-438 (2019).
- Regmi, S., et al. Enhanced viability and function of mesenchymal stromal cell spheroids is mediated via autophagy induction. Autophagy. 17 (10), 2991-3010 (2021).
- Hoang, D. M., et al. Stem cell-based therapy for human diseases. Signal Transduction and Targeted Therapy. 7 (1), 272 (2022).
- Jiang, B., et al. Concise review: Mesenchymal stem cells derived from human pluripotent cells, an unlimited and quality-controllable source for therapeutic applications. Stem Cells. 37 (5), 572-581 (2019).
- Soontararak, S., et al. Mesenchymal stem cells (MSC) derived from induced pluripotent stem cells (iPSC) equivalent to adipose-derived MSC in promoting intestinal healing and microbiome normalization in mouse inflammatory bowel disease model. Stem Cells Translational Medicine. 7 (6), 456-467 (2018).
- Di Baldassarre, A., Cimetta, E., Bollini, S., Gaggi, G., Ghinassi, B. Human-induced pluripotent stem cell technology and cardiomyocyte generation: Progress and clinical applications. Cells. 7 (6), 48 (2018).
- Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress. Nature Reviews. Drug Discovery. 16 (2), 115-130 (2017).
- Levy, O., et al. Shattering barriers toward clinically meaningful MSC therapies. Science Advances. 6 (30), eaba6884 (2020).
- Zhao, C., Ikeya, M. Generation and applications of induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells International. 2018, 9601623 (2018).
- Path, G., Perakakis, N., Mantzoros, C. S., Seufert, J. Stem cells in the treatment of diabetes mellitus - Focus on mesenchymal stem cells. Metabolism. 90, 1-15 (2019).
- Zhou, Y., et al. One-step derivation of functional mesenchymal stem cells from human pluripotent stem cells. Bio-Protocol. 8 (22), e3080 (2018).
- Hua, Z., et al. Low-intensity pulsed ultrasound promotes osteogenic potential of iPSC-derived MSCs but fails to simplify the iPSC-EB-MSC differentiation process. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 841778 (2022).
- Dupuis, V., Oltra, E. Methods to produce induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells: Mesenchymal stem cells from induced pluripotent stem cells. World Journal of Stem Cells. 13 (8), 1094-1111 (2021).
- Zhang, W., et al. Aging stem cells. A Werner syndrome stem cell model unveils heterochromatin alterations as a driver of human aging. Science. 348 (6239), 1160-1163 (2015).
- Liu, G. H., et al. Modelling Fanconi anemia pathogenesis and therapeutics using integration-free patient-derived iPSCs. Nature Communications. 5, 4330 (2014).
- Kubben, N., et al. Repression of the antioxidant NRF2 pathway in premature aging. Cell. 165 (6), 1361-1374 (2016).
- Duan, S., et al. PTEN deficiency reprogrammes human neural stem cells towards a glioblastoma stem cell-like phenotype. Nature Communications. 6, 10068 (2015).
- Zhang, J., et al. Exosomes released from human induced pluripotent stem cells-derived MSCs facilitate cutaneous wound healing by promoting collagen synthesis and angiogenesis. Journal of Translational Medicine. 13, 49 (2015).
- Hu, G. W., et al. Exosomes secreted by human-induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells attenuate limb ischemia by promoting angiogenesis in mice. Stem Cell Research & Therapy. 6 (1), 10 (2015).
- Kang, R., et al. Mesenchymal stem cells derived from human induced pluripotent stem cells retain adequate osteogenicity and chondrogenicity but less adipogenicity. Stem Cell Research & Therapy. 6 (1), 144 (2015).
- Wang, L. T., et al. Differentiation of mesenchymal stem cells from human induced pluripotent stem cells results in downregulation of c-Myc and DNA replication pathways with immunomodulation toward CD4 and CD8 cells. Stem Cells. 36 (6), 903-914 (2018).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Kim, S., Kim, T. M. Generation of mesenchymal stem-like cells for producing extracellular vesicles. World Journal of Stem Cells. 11 (5), 270-280 (2019).
