Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerin Mezenkimal Stromal Hücrelere Farklılaşması için İki Temsili Yöntemin Karşılaştırılması

Published: October 20, 2023 doi: 10.3791/65729
Automatic Translation
1, 2,3, 4, 2, 1,2, 2,3
1National Clinical Research Center for Child Health, The Children's Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 2Department of Nephrology, The Children's Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 3Zhejiang University School of Medicine, 4Liangzhu Laboratory, Zhejiang University

Summary

Bu protokol, hiPSC'leri mezenkimal stromal hücrelere (MSC'ler) farklılaştırmak için iki temsili yöntemi tanımlar ve karşılaştırır. Tek katmanlı yöntem, daha düşük maliyet, daha basit işlem ve daha kolay osteojenik farklılaşma ile karakterizedir. Embriyoid cisimler (EB'ler) yöntemi, daha düşük zaman tüketimi ile karakterizedir.

Abstract

Mezenkimal stromal hücreler (MSC'ler), rejeneratif tıpta yaygın olarak kullanılan yetişkin pluripotent kök hücrelerdir. Somatik doku kaynaklı MSC'ler sınırlı bağış, kalite varyasyonları ve biyogüvenlik ile kısıtlandığından, son 10 yılda insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden (hiPSC'ler) MSC'ler üretme çabalarında büyük bir artış görülmüştür. hiPSC'lerin MSC'lere farklılaşmasına yönelik geçmiş ve son çabalar iki kültür metodolojisi etrafında toplanmıştır: (1) embriyoid cisimciklerin (EB'ler) oluşumu ve (2) tek katmanlı kültürün kullanımı. Bu protokol, hiPSC'lerden MSC türetilmesinde bu iki temsili yöntemi açıklar. Her yöntem, zaman, maliyet, hücre proliferasyon yeteneği, MSC belirteçlerinin ekspresyonu ve in vitro farklılaşma yetenekleri dahil olmak üzere avantaj ve dezavantajlarını sunar. Bu protokol, her iki yöntemin de hiPSC'lerden olgun ve işlevsel MSC'ler türetebileceğini göstermektedir. Tek katmanlı yöntem, daha düşük maliyet, daha basit işlem ve daha kolay osteojenik farklılaşma ile karakterize edilirken, EB yöntemi daha düşük zaman tüketimi ile karakterize edilir.

Introduction

Mezenkimal stromal hücreler (MSC'ler) mezoderm kaynaklı yetişkin pluripotent kök hücrelerdir1. MSC'ler hemen hemen tüm bağ dokularında bulunur2. MSC'ler ilk olarak 1970'lerde keşfedildiğinden ve 1987'de Friedenstein ve ark.3,4,5 tarafından kemik iliğinden başarılı bir şekilde izole edildiğinden beri, kemik, kıkırdak, tendon, kas, yağ dokusu ve hematopoietik destekleyici stroma gibi MSC'leri izole etmek için çeşitli insan somatik (fetal ve yetişkin dahil) dokular kullanılmıştır 1,2,6,7. MSC'ler, birçok somatik hücre soyuna farklılaşmak için yüksek proliferatif yetenekler ve plastisite gösterir ve yaralı ve iltihaplı dokulara göç edebilir 2,8,9. Bu özellikler, MSC'leri rejeneratif tıp için potansiyel bir aday haline getirir10. Bununla birlikte, somatik doku kaynaklı MSC'ler (st-MSC'ler) sınırlı bağış, sınırlı hücre proliferatif kapasitesi, kalite varyasyonları ve varsa patojenlerin donörlerden olası bulaşması için biyogüvenlik endişesi ile kısıtlanmıştır11,12.

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücreler (hiPSC'ler), embriyonik kök hücrelerle benzer işlevlere sahip transkripsiyon faktörleri (Oct4, Sox2, Klf4 ve c-Myc) ile yeniden programlanan yetişkin hücrelerden türetilir13,14. Kendi kendini yenileyebilir ve MSC'ler de dahil olmak üzere her tür somatik hücreye farklılaşma potansiyeline sahip olabilirler. st-MSC'lerle karşılaştırıldığında, iPSC-MSC'ler sınırsız tedarik, daha düşük maliyet, daha yüksek saflık, kalite kontrolünde kolaylık, ölçekli üretim ve gen modifikasyonu için kolay avantaja sahiptir 15,16,17.

iPSC-MSC'lerin bu avantajları nedeniyle, MSC'yi iPSC'den yönlendiren çeşitli yöntemler rapor edilmiştir. Bu farklılaşma yöntemleri iki kültür metodolojisi etrafında toplanmıştır: (1) embriyoid cisimciklerinin (EB'ler) oluşumu ve (2) tek katmanlı kültürlerin kullanımı 11,18,19,20. Burada, iki metodolojinin her biri için temsili bir yaklaşım karakterize edilmiştir. Ayrıca, zaman, maliyet, proliferatif yetenek, MSC biyobelirteçlerinin ekspresyonu ve in vitro farklılaşma kabiliyetine dayalı iki temsili yaklaşım arasındaki karşılaştırmalara da erişildi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. hiPSC'lerin bakımı

  1. HiPSC'nin çözülmesi
    1. Hücreleri sıvı nitrojenden çıkarın ve hücreleri 37 ° C'lik bir su banyosunda hızla çözün. Çözdürme hücrelerini 3 mL iPSC bakım ortamı ile hazırlanmış 15 mL'lik bir tüpe aktarın (Malzeme Tablosu). Ortamı yavaşça karıştırın.
    2. 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve hücreleri 10 μM Y-27632 ile 1 mL iPSC bakım ortamında nazikçe yeniden süspanse edin (hücreleri 2-3 kez yukarı ve aşağı pipetleyin).
    3. Hücre süspansiyonunu, büyüme faktörü azaltılmış (GFR) -hücre dışı matris jeli (1:100) ve önceden 10 μM Y-27632 eklenmiş (yaklaşık 4 x 104 hücre /cm2) 2 mL iPSC bakım ortamı ile kaplanmış 6 oyuklu bir doku kültürü plakasına aktarın.
    4. Hücreleri 37 ° C'de,% 5 CO2 ile 5-6 gün boyunca (% 80 -% 90 birleşme) her gün iPSC bakım ortamı değişimi ile kültürleyin.
  2. hiPSC'nin geçişi
    1. iPSC bakım ortamını 6 oyuklu plakadan çıkarın. hiPSC'leri DPBS ile bir kez yıkayın.
    2. 700-800 μL 0.48 mM EDTA çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında (RT) 1 dakika inkübe edin, ardından sindirim çözeltisini çıkarın. 37 °C sıcaklıkta 3-5 dakika inkübe etmeye devam edin.
    3. Hücreler tabakalar halinde sindirildiğinde (hücreleri tek hücrelere sindirmeyin), sindirimi sonlandırmak için 10 μM Y-27632 ile 1 mL iPSC bakım ortamı ekleyin. Hücreleri dikkatlice 2-3 kez yukarı ve aşağı pipetleyin.
    4. Hücre süspansiyonunu, büyüme faktörü azaltılmış (GFR) -hücre dışı matris jeli (1:100) ve önceden eklenmiş 10 μM Y-27632 ile 2 mL iPSC bakım ortamı ile kaplanmış 6 oyuklu bir doku kültürü plakasına aktarın.
      NOT: Geçiş oranı 1:6 ila 1:20 (yaklaşık 4 x 104 hücre/cm2) arasında değişir ve ortalama toplama boyutu yaklaşık 50-200 μm'dir.
    5. Hücreleri 37 ° C'de% 80 -% 90 birleşmeye (5-6 gün) kadar,% 5 CO2 ile iPSC bakım ortamı her gün değiştirin.

2. EB oluşumu yoluyla MSC'lerin hiPSC'lerden farklılaşması

NOT: Yöntem önceki literatür 21,22,23,24'ten türetilmiştir. Yönteme genel bir bakış Şekil 1'de gösterilmektedir. Yöntemin özellikleri Tablo 1'de özetlenmiştir.

  1. Ortamın hazırlanması
    1. α-MEM'i %1 (h/h) GlutaMAX, %10 (h/h) FBS, 10 ng/mL FGF2 ve 5 ng/mL TGFβ ile destekleyerek MSC farklılaşma ortamını hazırlayın.
    2. α-MEM'i %1 (h/h) GlutMAX, %10 (h/h) FBS ve 1 ng/mL FGF2 ile destekleyerek MSC bakım ortamını hazırlayın.
  2. hiPSC'lerin hazırlanması
    1. 37 ° C'de,% 5 CO2 ila% 80 -% 90 birleşmede büyüme faktörü azaltılmış (GFR) -hücre dışı matris jeli (1:100) ile kaplanmış 6 oyuklu bir doku kültürü plakasında iPSC bakım ortamında kültür hiPSC çizgileri (çözülmeden sonra en az 2-3 kez geçiş).
  3. 0. Gün: EB oluşumu
    1. iPSC bakım ortamını 6 oyuklu plakadan çıkarın. hiPSC'leri DPBS ile bir kez yıkayın.
    2. 700-800 μL 0.48 mM EDTA çözeltisi ekleyin ve RT'de 1 dakika inkübe edin, ardından sindirim çözeltisini çıkarın. 37 °C sıcaklıkta 3-5 dakika inkübe etmeye devam edin.
    3. Hücreler tabakalar halinde sindirildiğinde (hücreleri tek hücrelere sindirmeyin), sindirimi sonlandırmak için 2 mL iPSC bakım ortamı (10 μM Kaya inhibitörü ve 1:100 GFR-hücre dışı matris jeli içerir) ekleyin.
    4. Hücreleri 6 oyuklu düşük bir bağlantı plakasına aktarın. Hücreleri, 2 kuyucuklu doku kültürü plakası ile 1 oyuklu düşük bağlantı plakası oranında tohumlayın. Hücreleri bir çalkalayıcıda (60 rpm/dak) 37 °C'de, %5CO2'de 24 saat boyunca küresel EB'ler oluşturmak için inkübe edin.
  4. 1. Gün-7. Gün: EB farklılaşması
    1. EB'leri bir Pasteur pipeti ile (EB'leri yok etmeden) santrifüj tüpüne aktarın ve EB'lerin RT'de 5-10 dakika doğal olarak çökelmesine izin verin. Ardından, süpernatanı çıkarın.
    2. EB'leri 2 mL MSC farklılaşma ortamına sahip 6 oyuklu düşük bağlantı plakasına aktarın. EB'leri çalkalayıcı üzerinde 37 °C'de, %5 CO'da2 7 gün boyunca orta düzeyde bir değişiklikle kültürleyin.
  5. 8. Gün-17. Gün: EB aşılaması
    1. EB'leri bir Pasteur pipeti ile (EB'leri tahrip etmeden) santrifüj tüpüne aktarın ve EB'lerin 5-10 dakika boyunca doğal olarak çökelmesine izin verin. Ardından, süpernatanı çıkarın.
    2. EB'leri, 2 mL MSC bakım ortamı içeren GFR-hücre dışı matris jel kaplı 6 oyuklu bir plakaya aktarın. Hücre yapışmasından sonra düzenli ortam değişikliği ile% 90 birleşmeye (~ 10 gün) kadar kültür.
  6. 18. Gün-27. Gün: MSC'lerin olgunlaşması ve genişlemesi
    1. EB'den türetilen kültürü 37 °C'de 5-10 dakika boyunca bir ayrışma solüsyonu ile muamele edin (sindirim süresi farklı hücre tiplerinin varlığına bağlı olarak değişir).
    2. Hücrelerin bir kısmı tek hücrelere sindirildiğinde, sindirimi sonlandırmak ve hücre süspansiyonunu bir santrifüj tüpüne aktarmak için 2 mL MSC bakım ortamı ekleyin. Kalan sindirilmemiş hücreleri DPBS ile bir kez yıkayın ve tekrar sindirin. Tüm hücreler tek hücrelere sindirilene kadar birkaç kez tekrarlayın. Hücre süspansiyonunu 5 dakika boyunca 250 x g'de santrifüjleyin, ardından süpernatanı çıkarın.
    3. Hücreleri Jelatin kaplı bir kültür plakasına tohumlayın (yaklaşık 2 x 105 hücre /cm2). MSC bakım ortamında% 90'a kadar birleşen kültür, orta düzenli olarak değişir. Bu noktada bu hücre neslini geçiş 0 (P0) olarak belirleyin.
    4. MSC'yi saf ve olgun hale getirmek için, hücreleri yaklaşık 6 gün içinde 1: 3 oranında iki kez geçmeye devam edin. Hücrelerin çoğu fibroblast benzeri morfoloji (iğ şeklinde) sunar.

3. MSC'lerin tek katmanlı kültür yoluyla hiPSC'lerden farklılaşması

NOT: Yöntem önceki literatürdentüretilmiştir 25,26,27,28. Bu yönteme genel bir bakış Şekil 1'de gösterilmiştir. Yöntemin özellikleri Tablo 1'de özetlenmiştir.

  1. Ortamın hazırlanması
    1. α-MEM'i %1 (h/h) GlutMAX, %10 (h/h) FBS ve 1 ng/mL FGF2 ile destekleyerek MSC bakım ortamını hazırlayın.
  2. hiPSC'lerin hazırlanması
    1. 37 ° C'de,% 5 CO2 ila% 50 -% 60 birleşme arasında büyüme faktörü azaltılmış (GFR) -hücre dışı matris jeli (1:100) ile kaplanmış 6 oyuklu bir doku kültürü plakası üzerinde iPSC bakım ortamında kültür hiPSC çizgileri (çözülmeden sonra en az 2-3 kez geçiş).
  3. Gün 0-Gün 13: Doğrudan tek tabakalı kültürlerle farklılaşma
    1. iPSC bakım ortamını 6 oyuklu plakadan çıkarın.
    2. 37 ° C'de,% 5 CO2'de 14 gün boyunca doğrudan 2 mL MSC bakım ortamı ve kültürü ekleyin, ortam her gün değişir.
  4. 14. Gün-35. Gün: MSC'lerin tekrarlanan geçişle olgunlaşması
    1. Tek katmanlı kültürleri 37 °C'de 5-10 dakika boyunca bir ayrışma solüsyonu ile muamele edin (sindirim süresi farklı hücre tiplerinin varlığına bağlı olarak değişir).
    2. Hücreler tek hücrelere sindirildiğinde, sindirimi sonlandırmak ve hücre süspansiyonunu santrifüj tüpüne aktarmak için 2 mL MSC bakım ortamı ekleyin. Kalan sindirilmemiş hücreleri DPBS ile bir kez yıkayın ve tekrar sindirin. Tüm hücreler tek hücrelere sindirilene kadar birkaç kez tekrarlayın. Hücre süspansiyonunu 5 dakika boyunca 250 x g'de santrifüjleyin, ardından süpernatanı çıkarın.
    3. Hücreleri jelatin kaplı bir kültür kabına tohumlayın (yaklaşık 2 x 105 hücre /cm2). MSC bakım ortamında ortam ile %90'a kadar birleşen kültür düzenli olarak değişir. Bu noktada bu hücre neslini geçiş 0 (P0) olarak belirleyin.
    4. MSC'yi saf ve olgun hale getirmek için, hücreleri yaklaşık 18 günde 1: 3 oranında 6 kez geçmeye devam edin. Hücrelerin çoğu fibroblast benzeri morfoloji (iğ şeklinde) sunar.

4. Akış sitometrisi ile hiPSC sürücülü MSC'lerin yüzey antijenleri analizi

NOT: Kemik iliği kaynaklı MSC'lerin yüzey antijenlerine benzer şekilde, hiPSC'leri kullanan MSC, CD105, CD73 ve CD90'ı eksprese eder, ancak CD45, CD3429'u eksprese etmez. Ek olarak, hiPSC'ler negatif kontrol hücreleri olarak kullanılabilir. Akış sitometrisi ile hiPSC kullanan MSC'lerin ve hiPSC'lerin yüzey antijen analizi Şekil 2'de gösterilmektedir.

  1. HiPSC kullanan MSC'lere 37 °C'de 2-3 dakika boyunca bir ayrışma solüsyonu uygulayın. HiPSC'leri 0.48 mM EDTA ayrışma reaktifi ile işlemden geçirin ve RT'de 1 dakika inkübe edin, ardından ayrışma reaktifini çıkarın. 37 °C sıcaklıkta 3-5 dakika inkübe etmeye devam edin.
  2. Hücreler tek hücrelere sindirildiğinde, sindirimi sonlandırmak için ortam (MSC'lere MSC bakım ortamı ve iPSC'lere iPSC bakım ortamı) ekleyin.
  3. Hücre süspansiyonunu 5 dakika boyunca 350 x g'de santrifüjleyin, ardından süpernatanı çıkarın.
  4. Hücreleri bir kez soğuk DPBS ile yıkayın, 350 x g'da 5 dakika santrifüjleyin ve ardından süpernatanı çıkarın.
  5. Hücreleri 10 x 106 hücre/mL'de soğuk% 10 FBS-DPBS (v / v) çözeltisinde sayın ve yeniden süspanse edin ve 100 μL / tüp hücre süspansiyonu (1 x 106 hücre / tüp) 1.5 mL santrifüj tüplerine dağıtın.
  6. 100 μL hücre süspansiyonuna 5 μL insan Fc reseptör bloke edici solüsyon ekleyin. Spesifik olmayan engelleme gerçekleştirmek için RT'de 5-10 dakika inkübe edin.
  7. 350 x g'da 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın. Hücreleri iki kez soğuk% 2 FBS-DPBS (v / v) çözeltisi ile yıkayın.
  8. Hücreleri soğuk 100 μL %2 FBS-DPBS (h/h) çözeltisinde yeniden süspanse edin.
  9. 100 μL hücreye 5 μL (1 test) anti-CD34-FITC ve 5 μL (1 test) anti-CD45-APC ekleyin
    Süspansiyon. Başka bir 100 μL hücre süspansiyon tüpüne 5 μL (1 test) anti-CD73-APC, 5 μL (1 test) anti-CD90-FITC ve 5 μL (1 test) anti-CD105-PE ekleyin. Üçüncü 100 μL hücre süspansiyon tüpüne 5 μL insan IgG1 izotip kontrolü FITC, insan IgG1 izotip kontrolü PE ve insan IgG1 izotip kontrolü APC ekleyin. Karanlıkta buz üzerinde 15-20 dakika inkübe edin. Bu arada, tek lekeli boncuklar hazırlayın.
  10. Hücreleri iki kez soğuk% 2 FBS-DPBS (v / v) çözeltisi ile yıkayın.
  11. Hücreleri yeniden süspanse etmek için 300 μL soğuk% 2 FBS-DPBS (v / v) çözeltisi ekleyin ve 200 gözenekli elek filtresi ile filtreleyin.
  12. Akış sitometrisi kullanarak örnekleri analiz edin. İzotip kontrol antikorları ile boyanmış hücre süspansiyonunu analiz edin ve kapıyı ayarlayın. Daha sonra hedef antikorlarla boyanmış hücre süspansiyonunu analiz edin.

5. HiPSC kullanan MSC'lerin osteojenik farklılaşması

NOT: HiPSC kullanan MSC'ler osteojenik farklılaşma potansiyeline sahiptir (Şekil 3A, B). Osteojenik farklılaşma protokolü aşağıda verilmiştir.

  1. α-MEM'i %10 FBS, 100 nM deksametazon, 10 mM beta-gliserofosfat ve 100 μM askorbik asit ile destekleyerek osteojenik indüksiyon ortamı hazırlayın.
  2. 1 x 105 MSC'yi jelatin kaplı 48 oyuklu bir plakaya tohumlayın ve %60-70 birleşene kadar kültürleyin.
  3. Ortamı çıkarın ve 0.3 mL osteojenik indüksiyon ortamı ekleyin. Hücreleri osteojenik bir indüksiyon ortamında 14 gün boyunca 37 °C'de,% 5 CO2'de kültürleyin ve her 3 günde bir ortam değiştirin.
  4. Ortamı çıkarın ve DPBS ile bir kez yıkayın.
  5. 0.3 mL% 4 PFA ekleyin ve RT'de 30 dakika inkübe edin.
  6. PFA'yı kaldırın. Hücreleri RT'de 10 dakika boyunca 0.3 mL DPBS ile durulayın ve 3 kez tekrarlayın.
  7. DPBS'yi çıkarın, 0.2 mL Alizarin kırmızı boyama solüsyonu ekleyin ve RT'de 30 dakika inkübe edin.
  8. Boyama solüsyonunu çıkarın, hücreleri RT'de 10 dakika boyunca 0.3 mL DPBS ile durulayın ve 3 kez tekrarlayın.
  9. Işık mikroskobu altında kalsiyum birikiminin boyanmasını gözlemleyin.

6. HiPSC kullanan MSC'lerin adipojenik farklılaşması

NOT: HiPSC kullanan MSC'ler adipojenik farklılaşma potansiyeline sahiptir (Şekil 3C, D). Adipojenik farklılaşma protokolü aşağıda verilmiştir.

  1. α-MEM'i %10 FBS, 1 μM deksametazon, 1 μM IBMX, 10 μg/mL insülin ve 100 μM indometazin ile destekleyerek adipojenik indüksiyon ortamı hazırlayın. α-MEM'i %10 FBS ve 10 μg/mL insülin ile destekleyerek adipojenik idame ortamı hazırlayın.
  2. 1 x 105 MSC'yi jelatin kaplı 48 oyuklu bir plakaya tohumlayın ve hücre yoğunluğu %90'a ulaşana kadar kültürleyin.
  3. Ortamı çıkarın ve 0.3 mL adipojenik indüksiyon ortamı ekleyin. Hücreleri adipojenik indüksiyon ortamında 4 gün boyunca 37 °C,% 5 CO2'de kültürlemeye devam edin.
  4. Ortamı çıkarın ve 0.3 mL adipojenik bakım ortamı ekleyin. Adipojenik bakım ortamındaki hücreleri 37 ° C,% 5 CO2'de 3 gün boyunca kültürlemeye devam edin.
  5. Adiposit farklılaşması ve olgunlaşması için 6.3 ve 6.4 adımlarını 2-3 kez tekrarlayın.
  6. Ortamı çıkarın ve DPBS ile bir kez yıkayın.
  7. 0.3 mL% 4 PFA ekleyin ve RT'de 10 dakika inkübe edin. PFA'yı çıkarın ve DPBS ile 2 kez durulayın.
  8. Üreticinin talimatına göre Oli Red O boyasını uygulayın ve lipit damlacıklarını ışık mikroskobu altında gözlemleyin.

7. HiPSC kullanan MSC'lerin kondrojenik farklılaşması

NOT: hiPSC kullanan MSC'ler kondrojenik farklılaşma potansiyeline sahiptir (Şekil 3E, F). Kondrojenik farklılaşma protokolü aşağıda verilmiştir.

  1. α-MEM'i %10 FBS, 100 nM deksametazon, %1 İnsülin-Transferrin-Selenyum (ITS), 10 μM askorbik asit, 1 mM sodyum piruvat, 50 μg/mL prolin, 0.02 nM dönüştürücü büyüme faktörü β3 (TGFβ3) ve 0.5 μg/mL kemik morfogenetik proteini 6 (BMP-6) ile destekleyerek kondroblast indüksiyon ortamı hazırlayın.
  2. 2,5 x 105 hiPSC tahrikli MSC'leri toplayın ve hücreleri 5 dakika boyunca 150 x g'da santrifüjleyin, ardından süpernatanı çıkarın. Hücreleri 1 mL α-MEM içinde süspanse edin ve ardından 5 dakika boyunca 150 x g'de santrifüjleyin.
  3. Süpernatanı çıkarın ve hücreleri 0.5 mL kondrojenik indüksiyon ortamında askıya alın. Hücreleri 5 dakika boyunca 150 x g'da santrifüjleyin.
  4. Kondrojenik indüksiyon ortamı değişimi ile 21 gün boyunca kapağı ve kültürü doğrudan sökün, her 3 günde bir 37 °C,% 5CO2'de değiştirin. Kondrojenik farklılaşma sırasında her gün kondrojenik peletleri (kondrojenik peletleri yok etmeden) askıya almak için santrifüj tüpünü hafifçe vurun.
  5. Süpernatanı çıkarın ve iki kez 0.5 mL PBS ile yıkayın.
  6. 0.3 mL% 4 PFA ekleyin ve 24 saat sabitleyin.
  7. Parafin, kondrojenik peletleri gömer ve daha sonra bunları bölümlere ayırır (3 μm). Bölümleri 30 dakika boyunca toluidin mavisi (% 1) ile boyayın.
  8. Hücre dışı kondrosit matrisini ışık mikroskobu altında gözlemleyin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Protokolü takiben (Şekil 1A), hiPSC'ler EB formasyonu ve tek katmanlı kültür yöntemleri ile MSC'lere farklılaştırıldı. Farklılaşma sırasında, hücreler farklı temsili morfolojiler gösterdi (Şekil 1B, C).

Şekil 1B'de gösterildiği gibi, hiPSC kolonileri, sıkıca paketlenmiş hücrelerden oluşan net bir sınırla farklılaşmadan önce tipik kompakt morfoloji sergiler. Çalkalayıcı üzerinde 24 saat boyunca ayrışan ve kültürlenen hiPSC'lerden sonra oluşan tek tip küresel EB'ler. MSC'lerin farklılaşma ortamındaki kültürün 1. gününden 7. gününe kadar, EB'nin pürüzsüz kenarı pürüzlü hale geldi ve EB'nin hacmi büyüdü. 8. günden 17. güne kadar, EB'leri GFR-hücre dışı matris jel kaplı 6 oyuklu bir plakaya aktardıktan sonra, EB'ler yavaş yavaş plakaya yapıştı ve birçok yapışkan tek tabakalı hücre EB'lerin etrafına yayıldı. Hücreler 18. günde% 90 birleşmeye ulaştığında, hücreler sindirildi ve jelatin kaplı bir kültür plakasına ekildi. 19. günde, hücre yapıştı ve çokgen bir şekil gösterdi. Ardışık olarak, hücreler% 90 birleştiğinde iki kez geçildi. Türetilmiş MSC'ler yavaş yavaş olgunlaştı ve tipik bir iğ şekli gösterdi ve koloni bir girdap içinde büyüdü.

Şekil 1C'de gösterildiği gibi, iPSC bakım ortamını 24 saat boyunca MSC bakım ortamı ile değiştirdikten sonra hücrelerin hacmi artmış ve koloninin etrafına yayılmıştır. Bir MSC bakım ortamında kültürlenirken, hücreler yavaş yavaş çoğaldı ve çok katmanlı yapışkan hücreler oluşturdu. 14. günde, hücreler sindirildi ve jelatin kaplı bir kültür plakasına ekildi. 15. günde, hücre yapıştı ve çokgen bir şekil gösterdi. Ardışık olarak, hücreler %90 birleştiğinde 6 kez pasajlandı. Türetilmiş MSC'ler yavaş yavaş olgunlaştı ve tipik bir iğ şekli gösterdi ve koloni bir girdap içinde büyüdü.

hiPSC'lerin ve hiPSC'yi yönlendiren MSC'lerin yüzey antijenleri akım sitometri ile analiz edildi (Şekil 2). Şekil 2C'de gösterildiği gibi, hiPSC'ler CD90 için pozitif, CD34, CD45, CD73 ve CD105 için negatifti. Her iki yöntemle hiPSC'leri MSC'lere ayırdıktan sonra, sürüş MSC'leri CD90, CD73 ve CD105 için pozitif, CD34 ve CD45 için negatifti (Şekil 2A,B).

HiPSC kullanan MSC'lerin farklılaşma kabiliyeti ostejenik, adipojenik ve kondrojenik farklılaşma ile araştırıldı. Şekil 3'te gösterildiği gibi, iki yöntemin her iki hiPSC sürücülü MSC'si osteoblast, adiposit ve kondrosit olarak farklılaşmıştır. Tek katmanlı yöntemin hiPSC'yi yönlendiren MSC'leri, EB yönteminden daha fazla kalsiyum birikintisi oluşturmuştur (Şekil 3B). İki yöntemde adipojenik farklılaşma ve kondrojenik farklılaşma yeteneği açısından anlamlı bir fark yoktu (Şekil 3D, F).

HiPSC kullanan MSC'lerin proliferasyon yeteneği sürekli geçiş kültürü ile incelendi. Şekil 3G'de gösterildiği gibi, her iki yöntemin hiPSC kullanan MSC'leri 20'den fazla geçiş için geçirilebilir ve yine de hızlı bir çoğalma kabiliyetini korur.

Tablo 1'de gösterilen iki yaklaşım arasındaki karşılaştırma, farklılaşma süresi, maliyet, hücre proliferasyon yeteneği, MSC belirteçlerinin ekspresyonu ve in vitro farklılaşma yeteneklerine dayanmaktadır.

Figure 1
Şekil 1: EB formasyon yöntemi ve tek tabakalı kültür yöntemi ile hiPSC'lerin MSC'lere ayırt edilmesi. (A) EB oluşumu ve tek tabaka kültürü yoluyla hiPSC'lerin MSC'lere farklılaşmasını gösteren şema. (B) EB oluşumu ve (C) tek tabakalı kültür yoluyla hiPSC'lerden türetilen MSC'ler sırasında anahtar fajlardaki hücrelerin morfolojisinin temsili. Ölçek çubukları: 300 μm ve 50 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: hiPSC'yi yönlendiren MSC'lerin yüzey antijenlerinin akış sitometrisi ile analizi. (A) EB oluşumu ve (B) tek tabakalı kültür yoluyla iPSC kullanan MSC'lerde MSC yüzey antijenlerinin ekspresyon yüzdeleri. (C) hiPSC'ler negatif kontrol olarak kullanıldı. MSC'lerin negatif belirteçleri: CD34, CD45; MSC'lerin pozitif belirteçleri: CD73, CD90 ve CD105. hiPSC'lerin negatif belirteçleri: CD34, CD45, CD73 ve CD105; hiPSC'lerin pozitif belirteçleri: CD90. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: HiPSC kullanan MSC'lerin üç hatlı farklılaşma ve çoğalma yeteneği. (A) 2 hafta boyunca osteojenik farklılaşma ortamında hiPSC kullanan MSC'lerin kalsiyum birikintilerinin alizarin kırmızı boyanması. Ölçek çubukları: 300 μm. (B) ImageJ analizi ile Alizarin kırmızısı S boyamasının miktarının belirlenmesi. (C) 2 hafta boyunca adipojenik farklılaşma ortamında hiPSC ile çalışan MSC'lerin lipid damlacıklarının Oli kırmızısı O boyaması. Ölçek çubukları: 300 μm. (D) ImageJ analizi ile Oli Red O boyamanın miktarının belirlenmesi. (E) Hücre dışı kondrosit matrisinin toluidin mavisi boyanması. Ölçek çubukları: 300 μm ve 150 μm. (F) ImageJ analizi ile toluidin mavisi boyamanın miktarının belirlenmesi. (G) hiPSC kullanan MSC'ler popülasyon iki katına çıkma süresi hesaplaması. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Karşılaştırma EB oluşum yöntemi Tek katmanlı kültürler yöntemi
Farklılaşma süresi 27 gün 35 gün
Masraf Yüksek Alçak
Çoğalma Hızı Hızlı Hızlı
Çoğalma yeteneği ≥20 pasajı ≥20 pasajı
MSC belirteçlerinin ifadesi CD73 / CD90 / CD105 pozitif, CD34 / CD45 nagatif CD73 / CD90 / CD105 pozitif, CD34 / CD45 nagatif
Farklılaşma yeteneği Adipojenik diferansiyasyon, kondrojenik diferansiyasyon ve osteojenik diferansiyasyon yeteneği Adipojenik farklılaşma, kondrojenik farklılaşma ve daha güçlü osteojenik farklılaşma yeteneği
İşlem Karmaşık Basit

Tablo 1: hiPSC'leri MSC'lere ayırmak için kullanılan iki yöntemin özellikleri.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu protokolde, hiPSC'leri MSC'lere ayırmanın iki temsili yöntemi incelenmiştir 20,21,22,23,24,25,26,27,28,30. Her iki yöntem de MSC'leri hiPSC'lerden türetme yeteneğine sahipti. HiPSC'den türetilen MSC'ler, hücre morfolojisi (Şekil 1), yüzey antijenleri (Şekil 2) ve farklılaşma yetenekleri (Şekil 3) ile doğrulandı.

Her iki yöntem de aynı MSC bakım ortamını paylaşırken, EB yöntemi ayrıca TGF-β ve FGF2 ile bir MSC farklılaşma ortamına ihtiyaç duyuyordu. Ek olarak, EB yöntemi, 6 oyuklu plakanın düşük bir şekilde bağlanmasını ve bir karbondioksit inkübatörüne yerleştirilebilen özel bir çalkalayıcıyı gerektiriyordu. Bu nedenle, EB yönteminin maliyeti tek katmanlı yöntemegöre daha yüksekti 18,20. EB yöntemi, tek katmanlı yöntemden daha karmaşık görünüyordu. Bununla birlikte, EB yönteminin farklılaşma süresi daha kısaydı ve bu da MSC'leri zenginleştirmek için birden fazla geçişten kaçındı.

EB yönteminin ortam koşullarına toleransının tek katmanlı yönteme göre daha güçlü olduğunu bulduk. Her iki yöntem de iPSC durumu, insan müdahalesi ve kültür ortamındanetkilenmiştir 11,20. Bununla birlikte, EB yönteminin başarı oranının tek katmanlı yönteme göre çok daha yüksek olduğunu bulduk. EB yönteminin anahtar aşaması, 1. günden 7. güne kadar EB farklılaşma aşamasıydı. 1-7. günlerde, EB'ler yavaş yavaş küçülürse veya kültür ortamında çok sayıda yüzen ölü hücre ile kırılırsa veya vakuolat EB'ler oluşturursa, bu niteliksiz EB'ler jelatin plakaya yapışmakta güçlük çeker ve eğer varsa, EB'lerden sürünen çok az yapışkan hücre bulunur. 1. günden 7. güne kadar, nitelikli EB'ler tekdüzeydi ve hafifçe büyüyecek, pürüzsüz kenarları yavaş yavaş çıkıntılı hücrelerle pürüzlü hale gelecekti. Jelatin plakaya aktarıldıktan sonra, EB'ler plakaya hızlı bir şekilde yapıştı ve birçok yapışkan tek tabakalı hücre EB'lerin etrafına yayıldı. EB'ler 1-7. günlerde nitelendirilirse, sonraki farklılaşmanın elde edilmesi kolaydır. Buna karşılık, tek katmanlı yöntem herhangi bir aşamada başarısız olabilir. 1. günden 14. güne kadar, yapışık hücreler yamalar halinde düşebilir ve bu da farklılaşma başarısızlığını gösterir. Normalde, yapışık hücreler çoğalır ve çok katmanlı yapışık hücreler oluşturur. 14. günden sonra, tek katmanlı yöntem yine de başarısız olacaktır çünkü yemeğe çok az hücre eklenmiştir. Tek tabaka yönteminin 0-13. günlerinde çanakta çeşitli hücre morfolojileri gözlemledik. Bununla birlikte, EB yönteminin 8-17. günlerdeki hücre morfolojisi homojendi. Tek tabaka yöntemi ile karşılaştırıldığında, EB yönteminin embriyonik gelişim sürecine daha çok benzediğini ve daha kontrol edilebilir programlı bir farklılaşma yöntemi olduğunu düşünüyoruz.

Her iki yöntem de 20'den fazla geçiş için kullanılabilir ve yine de hızlı bir proliferasyon kabiliyetini korur11. Tek tabakalı yöntemde osteojenik farklılaşmanın kalsiyum birikimleri EB yönteminden daha fazlaydı. Serumdaki sitokinlerin farklılaşma üzerine etkisinden kaçınmak için kök hücreye özgü serum kullanılmalıdır. Hücre yoğunluğu çok düşükse hücrelerin çoğalmasının duracağını gözlemledik. Bu nedenle, birleşmeye ulaştıktan sonra, hücreler 1:3 bölünme oranında geçilmelidir. Farklılaşma sırasında antibiyotik kullanılmadı; bu nedenle, bu deney düzeneği için iyi laboratuvar uygulamalarına (GLP) sıkı sıkıya uyulması zorunludur.

Sonuç olarak, bu protokolde test edilen her yöntem için avantajlar ve dezavantajlar vardı. Her iki yöntem de hiPSC'lerden MSC oluşturabilir, seçim kullanıcının gereksinimlerine bağlıdır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Acknowledgments

Mao ve Hu Lab'ın geçmişteki ve şimdiki tüm üyelerine, ilginç tartışmalar ve projeye büyük katkıları için son derece minnettarız. Büyük destek için Ulusal Çocuk Sağlığı Klinik Araştırma Merkezi'ne müteşekkiriz. Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (Jianhua Mao'ya U20A20351, Lidan Hu'ya 82200784), Çin'in Zhejiang Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (No. LQ22C070004 Lidan Hu'ya).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alizarin red staining kit Beyotime Biotechnology C0148S
Anti-human-CD105 (PE) Biolegend 323206
Anti-human-CD34 (FITC) Biolegend 343503
Anti-human-CD45 (APC) Biolegend 304011
Anti-human-CD73( APC) Biolegend 344006
Anti-human-CD90 (FITC) Biolegend 328108
Ascorbic acid Solarbio A8100
BMP-6 Novoprotein C012
Carbon dioxide level shaker Crystal CO-06UC6
Compensation Beads BioLegend 424601
CryoStor CS10 STEMCELL Technology 07959
Dexamethasone Beyotime Biotechnology ST1254
DMEM/F12  medium Servicebio G4610
Fetal bovine serum HAKATA HS-FBS-500
FGF2 Stemcell 78003.1
Gelatin Sigma-Aldrich G2500-100G
GlutaMAX Gibco 35050061
human IgG1 isotype control APC BioLegend 403505
human IgG1 isotype control FITC BioLegend 403507
human IgG1 isotype control PE BioLegend 403503
Human TGF-β1 Stemcell 78067
Human TruStain FcX  BioLegend 422301
IBMX Beyotime Biotechnology ST1398
Indomethacin Solarbio SI9020
Insulin Beyotime Biotechnology P3376
iPSC maintenance medium STEMCELL Technology 85850
ITS Media Supplement Beyotime Biotechnology C0341-10mL
Matrigel, growth factor reduced BD Corning 354230
Oli Red O staining kit Beyotime Biotechnology C0158S
Proline Solarbio P0011
Sodium pyruvate ThermoFisher 11360-070
TGFβ3 Novoprotein CJ44
Toluidine blue staining kit Solarbio G2543
TrypLE Express Enzyme(1x)  Gibco 12604013
Ultra-Low Attachment 6 Well Plate Costar 3471
Versene Gibco 15040-66
Y-27632 Stemcell 72304
α-MEM Hyclone SH30265
β-glycerophosphate Solarbio G8100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Weng, Z., et al. Mesenchymal stem/stromal cell senescence: Hallmarks, mechanisms, and combating strategies. Stem Cells Translational Medicine. 11 (4), 356-371 (2022).
  2. Soliman, H., et al. Multipotent stromal cells: One name, multiple identities. Cell Stem Cell. 28 (10), 1690-1707 (2021).
  3. Friedenstein, A. J., Chailakhyan, R. K., Gerasimov, U. V. Bone marrow osteogenic stem cells: in vitro cultivation and transplantation in diffusion chambers. Cell and Tissue Kinetics. 20 (3), 263-272 (1987).
  4. Friedenstein, A. J., et al. Precursors for fibroblasts in different populations of hematopoietic cells as detected by the in vitro colony assay method. Experimental Hematology. 2 (2), 83-92 (1974).
  5. Friedenstein, A. J., Gorskaja, J. F., Kulagina, N. N. Fibroblast precursors in normal and irradiated mouse hematopoietic organs. Experimental Hematology. 4 (5), 267-274 (1976).
  6. El Agha, E., et al. Mesenchymal stem cells in fibrotic disease. Cell Stem Cell. 21 (2), 166-177 (2017).
  7. Mushahary, D., Spittler, A., Kasper, C., Weber, V., Charwat, V. Isolation, cultivation, and characterization of human mesenchymal stem cells. Cytometry A. 93 (1), 19-31 (2018).
  8. Ullah, M., Liu, D. D., Thakor, A. S. Mesenchymal stromal cell homing: Mechanisms and strategies for improvement. iScience. 15, 421-438 (2019).
  9. Regmi, S., et al. Enhanced viability and function of mesenchymal stromal cell spheroids is mediated via autophagy induction. Autophagy. 17 (10), 2991-3010 (2021).
  10. Hoang, D. M., et al. Stem cell-based therapy for human diseases. Signal Transduction and Targeted Therapy. 7 (1), 272 (2022).
  11. Jiang, B., et al. Concise review: Mesenchymal stem cells derived from human pluripotent cells, an unlimited and quality-controllable source for therapeutic applications. Stem Cells. 37 (5), 572-581 (2019).
  12. Soontararak, S., et al. Mesenchymal stem cells (MSC) derived from induced pluripotent stem cells (iPSC) equivalent to adipose-derived MSC in promoting intestinal healing and microbiome normalization in mouse inflammatory bowel disease model. Stem Cells Translational Medicine. 7 (6), 456-467 (2018).
  13. Di Baldassarre, A., Cimetta, E., Bollini, S., Gaggi, G., Ghinassi, B. Human-induced pluripotent stem cell technology and cardiomyocyte generation: Progress and clinical applications. Cells. 7 (6), 48 (2018).
  14. Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress. Nature Reviews. Drug Discovery. 16 (2), 115-130 (2017).
  15. Levy, O., et al. Shattering barriers toward clinically meaningful MSC therapies. Science Advances. 6 (30), eaba6884 (2020).
  16. Zhao, C., Ikeya, M. Generation and applications of induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells International. 2018, 9601623 (2018).
  17. Path, G., Perakakis, N., Mantzoros, C. S., Seufert, J. Stem cells in the treatment of diabetes mellitus - Focus on mesenchymal stem cells. Metabolism. 90, 1-15 (2019).
  18. Zhou, Y., et al. One-step derivation of functional mesenchymal stem cells from human pluripotent stem cells. Bio-Protocol. 8 (22), e3080 (2018).
  19. Hua, Z., et al. Low-intensity pulsed ultrasound promotes osteogenic potential of iPSC-derived MSCs but fails to simplify the iPSC-EB-MSC differentiation process. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 841778 (2022).
  20. Dupuis, V., Oltra, E. Methods to produce induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells: Mesenchymal stem cells from induced pluripotent stem cells. World Journal of Stem Cells. 13 (8), 1094-1111 (2021).
  21. Zhang, W., et al. Aging stem cells. A Werner syndrome stem cell model unveils heterochromatin alterations as a driver of human aging. Science. 348 (6239), 1160-1163 (2015).
  22. Liu, G. H., et al. Modelling Fanconi anemia pathogenesis and therapeutics using integration-free patient-derived iPSCs. Nature Communications. 5, 4330 (2014).
  23. Kubben, N., et al. Repression of the antioxidant NRF2 pathway in premature aging. Cell. 165 (6), 1361-1374 (2016).
  24. Duan, S., et al. PTEN deficiency reprogrammes human neural stem cells towards a glioblastoma stem cell-like phenotype. Nature Communications. 6, 10068 (2015).
  25. Zhang, J., et al. Exosomes released from human induced pluripotent stem cells-derived MSCs facilitate cutaneous wound healing by promoting collagen synthesis and angiogenesis. Journal of Translational Medicine. 13, 49 (2015).
  26. Hu, G. W., et al. Exosomes secreted by human-induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells attenuate limb ischemia by promoting angiogenesis in mice. Stem Cell Research & Therapy. 6 (1), 10 (2015).
  27. Kang, R., et al. Mesenchymal stem cells derived from human induced pluripotent stem cells retain adequate osteogenicity and chondrogenicity but less adipogenicity. Stem Cell Research & Therapy. 6 (1), 144 (2015).
  28. Wang, L. T., et al. Differentiation of mesenchymal stem cells from human induced pluripotent stem cells results in downregulation of c-Myc and DNA replication pathways with immunomodulation toward CD4 and CD8 cells. Stem Cells. 36 (6), 903-914 (2018).
  29. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  30. Kim, S., Kim, T. M. Generation of mesenchymal stem-like cells for producing extracellular vesicles. World Journal of Stem Cells. 11 (5), 270-280 (2019).

Tags

Mezenkimal Stromal Hücreler MKH'ler Rejeneratif Tıp İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücreler HiPSC'ler Farklılaşma Kültür Metodolojileri Embriyoid Cisimler Tek Tabakalı Kültür Avantajları Dezavantajları Zaman Tüketimi Maliyet Hücre Proliferasyon Yeteneği MSC Belirteçleri İn Vitro Farklılaşma Yeteneği Matür MSC'ler
İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerin Mezenkimal Stromal Hücrelere Farklılaşması için İki Temsili Yöntemin Karşılaştırılması
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, F., Gao, L., Fu, X., Yan, Q.,… More

Wang, F., Gao, L., Fu, X., Yan, Q., Hu, L., Mao, J. Comparison of Two Representative Methods for Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells into Mesenchymal Stromal Cells. J. Vis. Exp. (200), e65729, doi:10.3791/65729 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter