Summary
Este protocolo describe y compara dos métodos representativos para diferenciar las hiPSC en células estromales mesenquimales (MSC). El método monocapa se caracteriza por un menor costo, una operación más simple y una diferenciación osteogénica más fácil. El método de los cuerpos embrioides (EB) se caracteriza por un menor consumo de tiempo.
Abstract
Las células estromales mesenquimales (MSC) son células madre pluripotentes adultas que se han utilizado ampliamente en medicina regenerativa. Dado que las MSC derivadas de tejidos somáticos están restringidas por la donación limitada, las variaciones de calidad y la bioseguridad, en los últimos 10 años se ha visto un gran aumento en los esfuerzos para generar MSC a partir de células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC). Los esfuerzos pasados y recientes en la diferenciación de las hiPSC en MSC se han centrado en dos metodologías de cultivo: (1) la formación de cuerpos embrioides (EB) y (2) el uso del cultivo monocapa. Este protocolo describe estos dos métodos representativos para derivar MSC a partir de hiPSC. Cada método presenta sus ventajas y desventajas, incluyendo el tiempo, el costo, la capacidad de proliferación celular, la expresión de marcadores MSC y su capacidad de diferenciación in vitro. Este protocolo demuestra que ambos métodos pueden derivar MSC maduras y funcionales a partir de hiPSC. El método monocapa se caracteriza por un menor costo, una operación más simple y una diferenciación osteogénica más fácil, mientras que el método EB se caracteriza por un menor consumo de tiempo.
Introduction
Las células estromales mesenquimales (MSC) son células madre pluripotentes adultas derivadas delmesodermo 1. Las MSC están presentes en casi todos los tejidos conectivos2. Desde que las MSC fueron descubiertas por primera vez en la década de 1970 y aisladas con éxito de la médula ósea en 1987 por Friedenstein et al.3,4,5, se ha utilizado una variedad de tejidos somáticos humanos (incluidos fetales y adultos) para aislar MSC como hueso, cartílago, tendón, músculo, tejido adiposo y estroma de soporte hematopoyético 1,2,6,7. Las MSC demuestran una alta capacidad proliferativa y plasticidad para diferenciarse en muchos linajes de células somáticas y podrían migrar a tejidos lesionados e inflamados 2,8,9. Estas propiedades hacen de las MSC un candidato potencial para la medicina regenerativa10. Sin embargo, las MSC derivadas de tejido somático (st-MSC) están restringidas por la donación limitada, la capacidad proliferativa celular limitada, las variaciones de calidad y la preocupación por la bioseguridad para la posible transmisión de patógenos, si los hubiera, de los donantes11,12.
Las células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC) se derivan de la reprogramación de células adultas con factores de transcripción (Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc), que tienen funciones similares a las de las células madre embrionarias13,14. Pueden autorrenovarse y poseer el potencial de diferenciarse en cualquier tipo de células somáticas, incluidas las MSC. En comparación con las st-MSC, las iPSC-MSC tienen la ventaja de un suministro ilimitado, menor costo, mayor pureza, conveniencia en el control de calidad, fácil producción a escala y modificación genética 15,16,17.
Debido a estas ventajas de las iPSC-MSC, se han reportado una variedad de métodos que impulsan las MSC a partir de iPSC. Estos métodos de diferenciación se han centrado en dos metodologías de cultivo: (1) la formación de cuerpos embrioides (EBs) y (2) el uso de cultivos monocapa 11,18,19,20. En este trabajo se caracterizó un enfoque representativo para cada una de las dos metodologías. Además, se accedió a comparaciones entre dos enfoques representativos basados en el tiempo, el costo, la capacidad proliferativa, la expresión de biomarcadores de MSC y la capacidad de diferenciación in vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Mantenimiento de hiPSCs
- Descongelación de hiPSC
- Saque las células del nitrógeno líquido y descongele rápidamente las células en un baño de agua a 37 °C. Transfiera las células de descongelación a un tubo de 15 mL preparado con 3 mL de medio de mantenimiento iPSC (Tabla de Materiales). Mezcle suavemente el medio.
- Centrifugar a 300 x g durante 5 min. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender suavemente las células en 1 ml de medio de mantenimiento iPSC con 10 μM Y-27632 (pipetear las células hacia arriba y hacia abajo 2-3 veces).
- Transfiera la suspensión celular a una placa de cultivo de tejidos de 6 pocillos recubierta con gel de matriz extracelular reducida en factor de crecimiento (TFG) (1:100) y 2 ml de medio de mantenimiento iPSC con 10 μM Y-27632 agregados de antemano (aproximadamente 4 x 104 células/cm2).
- Cultivar las células durante 5-6 días (80%-90% de confluencia) a 37 °C, 5% de CO2 con cambio de medios de mantenimiento iPSC todos los días.
- Paso de hiPSC
- Retire el medio de mantenimiento iPSC de la placa de 6 pocillos. Lave los hiPSC una vez con DPBS.
- Añadir 700-800 μL de solución de EDTA 0,48 mM e incubar durante 1 min a temperatura ambiente (RT), luego retirar la solución de digestión. Continuar incubando a 37 °C de temperatura durante 3-5 min.
- Cuando las células se digieren en láminas (no digiera las células en células individuales), agregue 1 ml de medio de mantenimiento iPSC con 10 μM Y-27632 para finalizar la digestión. Pipetea con cuidado las células hacia arriba y hacia abajo 2-3 veces.
- Transfiera la suspensión celular a una placa de cultivo de tejidos de 6 pocillos recubierta con gel de matriz extracelular reducida en factor de crecimiento (TFG) (1:100) y 2 ml de medio de mantenimiento iPSC con 10 μM Y-27632 agregados de antemano.
NOTA: La relación de paso oscila entre 1:6 y 1:20 (aproximadamente 4 x 104 células/cm2), y el tamaño medio de agregación es de aproximadamente 50-200 μm. - Cultivar las células hasta una confluencia del 80%-90% (5-6 días) a 37 °C, 5% de CO2 con cambio de medios de mantenimiento iPSC todos los días.
2. Diferenciación de las MSC de las hiPSC a través de la formación de EB
NOTA: El método se deriva de la literatura previa 21,22,23,24. En la Figura 1 se ilustra una descripción general del método. Las características del método se resumen en la Tabla 1.
- Preparación del medio
- Prepare el medio de diferenciación de MSC suplementando α-MEM con 1% (v/v) de GlutaMAX, 10% (v/v) de FBS, 10 ng/mL de FGF2 y 5 ng/mL de TGFβ.
- Prepare el medio de mantenimiento MSC complementando α-MEM con 1% (v/v) de GlutMAX, 10% (v/v) de FBS y 1 ng/mL de FGF2.
- Preparación de hiPSCs
- Cultivo de líneas de hiPSCs (paso al menos 2-3 veces después de la descongelación) en medio de mantenimiento iPSC en una placa de cultivo de tejidos de 6 pocillos recubierta con gel de matriz extracelular reducida en factor de crecimiento (TFG) (1:100) a 37 °C, 5% de CO2 hasta 80%-90% de confluencia.
- Día 0: Formación EB
- Retire el medio de mantenimiento iPSC de la placa de 6 pocillos. Lave los hiPSC una vez con DPBS.
- Añadir 700-800 μL de solución de EDTA 0,48 mM e incubar durante 1 min a RT, luego retirar la solución de digestión. Continuar incubando a 37 °C de temperatura durante 3-5 min.
- Cuando las células se digieren en láminas (no digiera las células en células individuales), agregue 2 ml de medio de mantenimiento de iPSC (que contiene 10 μM de inhibidor de roca y gel de matriz extracelular 1:100 GFR) para finalizar la digestión.
- Transfiera las celdas a una placa de fijación baja de 6 pocillos. Siembre las células en una proporción de 2 pocillos de placa de cultivo de tejidos por 1 pocillo de placa de fijación baja. Incubar las células en un agitador (60 rpm/min) a 37 °C, 5% CO2 durante 24 h para formar EBs esféricas.
- Día 1-Día 7: Diferenciación EB
- Transfiera los EB al tubo de centrífuga con una pipeta Pasteur (sin destruir los EB) y deje que los EB se sedimenten naturalmente durante 5-10 minutos en RT. A continuación, retira el sobrenadante.
- Transfiera los EB a una placa de fijación baja de 6 pocillos con 2 ml de medio de diferenciación MSC. Cultivar los EB en el agitador a 37 °C, 5% CO2 durante 7 días con cambio medio una vez.
- Día 8-Día 17: Inoculación de EB
- Transfiera los EB al tubo de centrífuga con una pipeta Pasteur (sin destruir los EB) y deje que los EB se sedimenten naturalmente durante 5-10 min. A continuación, retira el sobrenadante.
- Transfiera los EB a una placa de 6 pocillos recubierta de gel de matriz extracelular GFR con 2 mL de medio de mantenimiento MSC. Cultivo hasta un 90% de confluencia (~10 días) con cambio regular de medio después de la adhesión celular.
- Día 18-Día 27: Maduración y expansión de las MSC
- Tratar el cultivo derivado de EB con una solución de disociación a 37 °C durante 5-10 min (el tiempo de digestión varía debido a la presencia de diferentes tipos de células).
- Cuando parte de las células se digieren en células individuales, agregue 2 ml del medio de mantenimiento MSC para terminar la digestión y transfiera la suspensión celular a un tubo de centrífuga. Lave las células restantes no digeridas una vez con DPBS y digiera nuevamente. Repita varias veces hasta que todas las células se digieran en células individuales. Centrifugar la suspensión celular a 250 x g durante 5 min, luego retire el sobrenadante.
- Siembre las células en una placa de cultivo recubierta de gelatina (aproximadamente 2 x 105 células/cm2). Cultivo hasta el 90% de confluencia en el medio de mantenimiento MSC con cambio regular del medio. Designe esta generación de celdas como pasaje 0 (P0) en este punto.
- Para que las MSC sean puras y maduras, continúe pasando las células dos veces en una proporción de división de 1:3 en aproximadamente 6 días. La mayoría de las células presentan una morfología similar a la de un fibroblasto (en forma de huso).
3. Diferenciación de las MSC de las hiPSC mediante cultivo monocapa
NOTA: El método se deriva de la literatura previa 25,26,27,28. En la Figura 1 se ilustra una descripción general de este método. Las características del método se resumen en la Tabla 1.
- Preparación del medio
- Prepare el medio de mantenimiento MSC suplementando α-MEM con 1% (v/v) de GlutMAX, 10% (v/v) de FBS y 1 ng/mL de FGF2.
- Preparación de hiPSCs
- Cultivo de líneas de hiPSCs (paso al menos 2-3 veces después de la descongelación) en el medio de mantenimiento iPSC en una placa de cultivo de tejidos de 6 pocillos recubierta con gel de matriz extracelular reducida en factor de crecimiento (TFG) (1:100) a 37 °C, 5% de CO2 hasta 50%-60% de confluencia.
- Día 0-Día 13: Diferenciación por cultivos monocapa directos
- Retire el medio de mantenimiento iPSC de la placa de 6 pocillos.
- Añadir directamente 2 mL del medio de mantenimiento MSC y cultivar durante 14 días a 37 °C, 5% de CO2, con el medio cambiando todos los días.
- Día 14-Día 35: Maduración de las MSCs por paso repetido
- Tratar los cultivos monocapa con una solución de disociación a 37 °C durante 5-10 min (el tiempo de digestión varía debido a la presencia de diferentes tipos de células).
- Cuando las células se digieren en células individuales, agregue 2 ml de medio de mantenimiento MSC para terminar la digestión y transfiera la suspensión celular al tubo de centrífuga. Lave las células restantes no digeridas una vez con DPBS y digiera nuevamente. Repita varias veces hasta que todas las células se digieran en células individuales. Centrifugar la suspensión celular a 250 x g durante 5 min, luego retire el sobrenadante.
- Siembre las células en una placa de cultivo recubierta de gelatina (aproximadamente 2 x 105 células/cm2). Cultivo hasta el 90% de confluencia en el medio de mantenimiento MSC con el medio cambia regularmente. Designe esta generación de celdas como pasaje 0 (P0) en este punto.
- Para que las MSC sean puras y maduras, continúe pasando las células 6 veces en una proporción de división de 1:3 en aproximadamente 18 días. La mayoría de las células presentan una morfología similar a la de un fibroblasto (en forma de huso).
4. Análisis de antígenos de superficie de MSC impulsoras de hiPSC mediante citometría de flujo
NOTA: Al igual que los antígenos de superficie de las MSC derivadas de la médula ósea, las MSC que impulsan las hiPSC expresan CD105, CD73 y CD90, pero no expresan CD45, CD3429. Además, las hiPSC se pueden utilizar como células de control negativo. En la Figura 2 se muestra el análisis de antígenos de superficie de las MSC y las hiPSC impulsoras de hiPSC mediante citometría de flujo.
- Tratar las MSC que impulsan hiPSC con una solución de disociación a 37 °C durante 2-3 min. Tratar las hiPSC con un reactivo de disociación EDTA de 0,48 mM e incubar durante 1 min a RT, luego retirar el reactivo de disociación. Continuar incubando a 37 °C de temperatura durante 3-5 min.
- Cuando las células se digieren en células individuales, agregue medio (medio de mantenimiento MSC a las MSC y medio de mantenimiento iPSC a las iPSC) para finalizar la digestión.
- Centrifugar la suspensión celular a 350 x g durante 5 min, luego retire el sobrenadante.
- Lavar las celdas una vez con DPBS frío, centrifugar a 350 x g durante 5 min y luego retirar el sobrenadante.
- Cuente y vuelva a suspender las células en una solución fría de FBS-DPBS al 10% (v/v) a 10 x 106 células/ml y distribuya 100 μl/tubo de suspensión celular (1 x 106 células/tubo) en tubos de centrífuga de 1,5 ml.
- Añadir 5 μL de solución bloqueadora del receptor Fc humano a 100 μL de suspensión celular. Incubar durante 5-10 min en RT para realizar un bloqueo inespecífico.
- Centrifugar a 350 x g durante 5 min y retirar el sobrenadante. Lave las celdas dos veces con una solución fría de FBS-DPBS al 2% (v/v).
- Resuspender las células en 100 μL de solución fría de FBS-DPBS (v/v) al 2%.
- Agregue 5 μL (1 prueba) de anti-CD34-FITC y 5 μL (1 prueba) de anti-CD45-APC a la celda de 100 μL
Suspensión. Agregue 5 μL (1 prueba) de anti-CD73-APC, 5 μL (1 prueba) de anti-CD90-FITC y 5 μL (1 prueba) de anti-CD105-PE a otro tubo de suspensión celular de 100 μL. Añadir 5 μL de FITC de control de isotipo de IgG1 humana, PE de control de isotipo de IgG1 humana y APC de control de isotipo de IgG1 humana al tercer tubo de suspensión celular de 100 μL. Incubar durante 15-20 minutos en hielo en la oscuridad. Mientras tanto, prepare cuentas de una sola mancha. - Lave las celdas dos veces con una solución fría de FBS-DPBS al 2% (v/v).
- Añadir 300 μL de solución fría de FBS-DPBS (v/v) al 2% para resuspender las células, y filtrar a través de un filtro de malla de malla 200.
- Analice las muestras mediante citometría de flujo. Analizar la suspensión celular teñida con anticuerpos de control de isotipo y establecer la puerta. A continuación, analice la suspensión celular teñida con anticuerpos diana.
5. Diferenciación osteogénica de las MSC que impulsan hiPSC
NOTA: Las MSC que impulsan hiPSC poseen un potencial de diferenciación osteogénica (Figura 3A, B). A continuación se presenta el protocolo para la diferenciación osteogénica.
- Prepare el medio de inducción osteogénico suplementando α-MEM con 10% de FBS, 100 nM de dexametasona, 10 mM de beta-glicerofosfato y 100 μM de ácido ascórbico.
- Siembre 1 x 105 MSC en una placa de 48 pocillos recubierta de gelatina y cultive hasta que tenga una confluencia del 60%-70%.
- Retire el medio y agregue 0,3 ml de medio de inducción osteogénico. Cultivar las células en un medio de inducción osteogénico durante 14 días a 37 °C, 5% CO2, con cambio de medio cada 3 días.
- Retire el medio y lave con DPBS una vez.
- Añadir 0,3 mL de PFA al 4% e incubar a RT durante 30 min.
- Elimine el PFA. Enjuague las células con 0,3 ml de DPBS durante 10 min a RT y repita 3 veces.
- Retire el DPBS, agregue 0,2 ml de solución de tinción con rojo de alizarina e incube durante 30 minutos a RT.
- Retire la solución de tinción, enjuague las células con 0,3 ml de DPBS durante 10 min a RT y repita 3 veces.
- Observe la tinción de la deposición de calcio bajo un microscopio óptico.
6. Diferenciación adipogénica de las MSC que impulsan hiPSC
NOTA: Las MSC que impulsan hiPSC poseen un potencial de diferenciación adipogénico (Figura 3C, D). A continuación se indica el protocolo para la diferenciación adipogénica.
- Prepare un medio de inducción adipogénico suplementando α-MEM con 10% de FBS, 1 μM de dexametasona, 1 μM de IBMX, 10 μg/mL de insulina y 100 μM de indometacina. Prepare un medio de mantenimiento adipogénico suplementando α-MEM con 10% de FBS y 10 μg/mL de insulina.
- Siembre 1 x 105 MSC en una placa de 48 pocillos recubierta de gelatina y cultive hasta que la densidad celular alcance el 90%.
- Retire el medio y agregue 0,3 ml de medio de inducción adipogénico. Continuar cultivando las células en el medio de inducción adipogénico durante 4 días a 37 °C, 5% CO2.
- Retire el medio y agregue 0,3 ml de medio de mantenimiento adipogénico. Continuar cultivando las células en el medio de mantenimiento adipogénico durante 3 días a 37 °C, 5% de CO2.
- Repita los pasos 6.3 y 6.4 2-3 veces hasta la diferenciación y maduración de los adipocitos.
- Retire el medio y lave con DPBS una vez.
- Añadir 0,3 ml de PFA al 4% e incubar a RT durante 10 min. Retire el PFA y enjuague 2 veces con DPBS.
- Aplique la tinción Oli Red O según las instrucciones del fabricante y observe las gotas de lípidos bajo un microscopio óptico.
7. Diferenciación condrogénica de las MSC que impulsan hiPSC
NOTA: Las MSC que impulsan hiPSC poseen un potencial de diferenciación condrogénica (Figura 3E, F). A continuación se presenta el protocolo para la diferenciación condrogénica.
- Prepare el medio de inducción de condroblastos suplementando α-MEM con 10% de FBS, 100 nM de dexametasona, 1% de insulina-transferrina-selenio (ITS), 10 μM de ácido ascórbico, 1 mM de piruvato de sodio, 50 μg/mL de prolina, 0,02 nM de factor de crecimiento transformante β3 (TGFβ3) y 0,5 μg/mL de proteína morfogenética ósea 6 (BMP-6).
- Recoja 2,5 x 105 MSC impulsadoras de hiPSC y centrifugue las células a 150 x g durante 5 min, luego retire el sobrenadante. Suspender las células en 1 mL de α-MEM y luego centrifugar a 150 x g durante 5 min.
- Retirar el sobrenadante y suspender las células en 0,5 mL de medio de inducción condrogénico. Centrifugar las células a 150 x g durante 5 min.
- Desenroscar directamente la tapa y cultivar durante 21 días con inducción condrogénica, cambiar el medio cada 3 días a 37 °C, 5% CO2. Mueva suavemente el tubo de centrífuga para suspender los gránulos condrogénicos (sin destruir los gránulos condrogénicos) todos los días durante la diferenciación condrogénica.
- Retire el sobrenadante y lave con 0,5 ml de PBS dos veces.
- Añadir 0,3 mL de PFA al 4% y fijar durante 24 h.
- La parafina incrusta los gránulos condrogénicos y luego los secciona (3 μm). Tiñe las secciones con azul de toluidina (1%) durante 30 min.
- Observar la matriz de condrocitos extracelulares bajo un microscopio óptico.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Siguiendo el protocolo (Figura 1A), las hiPSC se diferenciaron en MSC mediante los métodos de formación de EB y cultivo monocapa. Durante la diferenciación, las células mostraron diferentes morfologías representativas (Figura 1B,C).
Como se muestra en la Figura 1B, las colonias de hiPSCs muestran una morfología compacta típica antes de la diferenciación con un borde claro compuesto por células muy compactas. EBs esféricas uniformes formadas después de que las hiPSCs se disociaran y cultivaran durante 24 h en el agitador. Durante el día 1 al día 7 de cultivo en el medio de diferenciación de MSC, el borde liso de EB se volvió áspero y el volumen de EB creció. Desde el día 8 hasta el día 17, después de transferir las EB a una placa de 6 pocillos recubierta de gel de matriz extracelular con TFG, las EB se adhirieron gradualmente a la placa y muchas células monocapa adherentes se extendieron alrededor de las EB. Cuando las células alcanzaron el 90% de confluencia el día 18, las células se digerieron y se sembraron en una placa de cultivo recubierta de gelatina. El día 19, la célula se adhirió y mostró una forma poligonal. Consecutivamente, las células fueron pasadas dos veces cuando estaban confluentes en un 90%. Las MSC derivadas maduraron gradualmente y mostraron una forma de huso típica, y la colonia creció en un remolino.
Como se muestra en la Figura 1C, el volumen de las células aumentó y se extendió por la colonia después de reemplazar el medio de mantenimiento iPSC con el medio de mantenimiento MSC durante 24 h. Mientras se cultivaban en un medio de mantenimiento MSC, las células proliferaron gradualmente y formaron células adherentes multicapa. El día 14, las células se digierieron y se sembraron en una placa de cultivo recubierta de gelatina. El día 15, la célula se adhirió y mostró una forma poligonal. Consecutivamente, las células fueron pasadas 6 veces cuando estaban confluentes en un 90%. Las MSC derivadas maduraron gradualmente y mostraron una forma de huso típica, y la colonia creció en un remolino.
Los antígenos de superficie de las hiPSCs y de las MSCs conductoras de hiPSC se analizaron mediante citometría de flujo (Figura 2). Como se muestra en la Figura 2C, las hiPSC fueron positivas para CD90 y negativas para CD34, CD45, CD73 y CD105. Después de diferenciar las hiPSC en MSC a través de ambos métodos, las MSC impulsoras fueron positivas para CD90, CD73 y CD105, y negativas para CD34 y CD45 (Figura 2A, B).
Se investigó la capacidad de diferenciación de las MSC que impulsan hiPSC mediante diferenciación osteogénica, adipogénica y condrogénica. Como se muestra en la Figura 3, las dos MSC impulsoras de hiPSC de los dos métodos se diferenciaron en osteoblastos, adipocitos y condrocitos. Las MSC impulsoras de hiPSC del método monocapa formaron más depósitos de calcio que el método EB (Figura 3B). Los dos métodos no tuvieron diferencias significativas en la diferenciación adipogénica y la capacidad de diferenciación condrogénica (Figura 3D, F).
Se examinó la capacidad de proliferación de las MSC que impulsan hiPSC mediante cultivo de paso continuo. Como se muestra en la Figura 3G, las MSC que impulsan hiPSC de ambos métodos pueden ser conducidas por más de 20 pasajes y aún así mantener una rápida capacidad de proliferación.
La comparación entre los dos enfoques mostrados en la Tabla 1 se basa en el tiempo de diferenciación, el costo, la capacidad de proliferación celular, la expresión de los marcadores MSC y su capacidad de diferenciación in vitro.
Figura 1: Diferenciación de hiPSCs en MSCs mediante el método de formación de EB y el método de cultivo monocapa. (A) Esquema que muestra la diferenciación de hiPSCs en MSCs a través de la formación de EB y el cultivo de monocapa. Morfología de representación de las células en fagos clave durante la derivación de MSCs a partir de hiPSCs a través de (B) formación de EB y (C) cultivo de monocapa. Barras de escala: 300 μm y 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Análisis de antígenos de superficie de MSCs impulsores de hiPSC mediante citometría de flujo. Porcentajes de expresión de antígenos de superficie de MSC en MSC impulsoras de iPSC a través de (A) formación de EB y (B) cultivo de monocapa. (C) se utilizaron hiPSC como control negativo. Marcadores negativos de MSCs: CD34, CD45; Marcadores positivos de MSCs: CD73, CD90 y CD105. marcadores negativos de las hiPSCs: CD34, CD45, CD73 y CD105; Marcadores positivos de hiPSCs: CD90. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Diferenciación de tres líneas y capacidad de proliferación de las MSC que impulsan hiPSC. (A) Tinción con rojo de alizarina de los depósitos de calcio de las MSC que impulsan hiPSC en medio de diferenciación osteogénica durante 2 semanas. Barras de escala: 300 μm. (B) Cuantificación de la tinción de rojo de alizarina S mediante análisis de ImageJ. (C) Tinción de Oli rojo O de gotas lipídicas de MSC impulsoras de hiPSC en medio de diferenciación adipogénica durante 2 semanas. Barras de escala: 300 μm. (D) Cuantificación de la tinción de Oli Red O mediante análisis ImageJ. (E) Tinción con azul de toluidina de la matriz de condrocitos extracelulares. Barras de escala: 300 μm y 150 μm. (F) Cuantificación de la tinción con azul de toluidina mediante análisis ImageJ. (G) cálculo del tiempo de duplicación de la población de MSC que impulsan hiPSC. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Comparación | Método de formación de EB | Método de cultivos monocapa |
| Tiempo de diferenciación | 27 días | 35 días |
| Costar | Alto | Bajo |
| Velocidad de proliferación | Rápido | Rápido |
| Capacidad de proliferación | Pasaje ≥20 | Pasaje ≥20 |
| Expresión de marcadores MSC | CD73/CD90/CD105 positivo, CD34/CD45 nagativo | CD73/CD90/CD105 positivo, CD34/CD45 nagativo |
| Capacidad de diferenciación | Diferenciación adipogénica, diferenciación condrogénica y capacidad de diferenciación osteogénica | Diferenciación adipogénica, diferenciación condrogénica y mayor capacidad de diferenciación osteogénica |
| Operación | Complicado | Sencillo |
Tabla 1: Características de los dos métodos para diferenciar las hiPSC en MSC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En este protocolo, se examinaron dos métodos representativos para diferenciar las hiPSC en MSC 20,21,22,23,24,25,26,27,28,30. Ambos métodos fueron capaces de derivar MSCs a partir de hiPSCs. Las MSC derivadas de hiPSC fueron confirmadas por la morfología celular (Figura 1), los antígenos de superficie (Figura 2) y su capacidad de diferenciación (Figura 3).
Ambos métodos compartían el mismo medio de mantenimiento MSC, mientras que el método EB también necesitaba un medio de diferenciación MSC con TGF-β y FGF2. Además, el método EB requirió una fijación baja de placas de 6 pocillos y un agitador especial que se puede colocar en una incubadora de dióxido de carbono. Por lo tanto, el costo del método EB fue mayor que el del método monocapa18,20. El método EB parecía ser más complicado que el método monocapa. Sin embargo, el tiempo de diferenciación del método EB fue más corto, lo que evitó múltiples pasajes para enriquecer las MSC.
Encontramos que la tolerancia a las condiciones ambientales del método EB fue mayor que la del método monocapa. Ambos métodos fueron influenciados por el estado de iPSC, la interferencia humana y el ambiente de cultivo11,20. Sin embargo, encontramos que la tasa de éxito del método EB fue mucho mayor que la del método monocapa. La etapa clave del método EB fue la etapa de diferenciación de EB desde el día 1 hasta el día 7. Durante los días 1 a 7, si las EB se vuelven gradualmente más pequeñas o se rompen con una gran cantidad de células muertas flotantes en el medio de cultivo o forman EB vacuoladas, estas EB no calificadas tienen dificultades para adherirse a la placa de gelatina y pocas células adherentes salen de las EB. Desde el día 1 hasta el día 7, las EB calificadas eran uniformes y estaban ligeramente agrandadas, cuyos bordes lisos se volvían gradualmente ásperos con células que sobresalían. Después de ser transferidas a la placa de gelatina, los EB se adhirieron rápidamente a la placa y muchas células monocapa adherentes se extendieron alrededor de los EB. Si los EB se califican durante los días 1 a 7, la diferenciación posterior es fácil de lograr. Por el contrario, el método monocapa podría fallar en cualquier etapa. Desde el día 1 hasta el día 14, las células adherentes pueden caerse en parches, lo que indica una falla en la diferenciación. Normalmente, las células adherentes proliferan y forman células adherentes multicapa. Después del día 14, el método de la monocapa seguiría fallando porque hay pocas células adheridas a la placa. Durante los días 0-13 del método monocapa, observamos diversas morfologías celulares en la placa. Sin embargo, la morfología celular del método EB en los días 8-17 fue homogénea. En comparación con el método monocapa, sospechamos que el método EB es más similar al proceso de desarrollo embrionario y es un método de diferenciación programada más controlable.
Ambos métodos podrían utilizarse para más de 20 pasajes y aún así mantener una rápida capacidad de proliferación11. Los depósitos de calcio de diferenciación osteogénica en el método monocapa fueron mayores que los del método EB. Se debe utilizar suero específico de células madre para evitar el efecto de las citocinas en el suero sobre la diferenciación. Observamos que las células dejaban de proliferar si la densidad celular era demasiado baja. Por lo tanto, después de alcanzar la confluencia, las celdas deben pasar en una relación de división de 1:3. No se utilizaron antibióticos durante la diferenciación; por lo tanto, la estricta observancia de las buenas prácticas de laboratorio (BPL) es obligatoria para esta configuración experimental.
En conclusión, hubo ventajas y desventajas para cada método probado en este protocolo. Ambos métodos pueden generar MSC a partir de hiPSC, la elección se basa en los requisitos del usuario.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Estamos muy agradecidos a todos los miembros del Laboratorio Mao y Hu, pasados y presentes, por las interesantes discusiones y las grandes contribuciones al proyecto. Agradecemos al Centro Nacional de Investigación Clínica para la Salud Infantil por el gran apoyo. Este estudio contó con el apoyo financiero de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (U20A20351 a Jianhua Mao, 82200784 a Lidan Hu), la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Zhejiang de China (No. LQ22C070004 a Lidan Hu).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alizarin red staining kit | Beyotime Biotechnology | C0148S | |
| Anti-human-CD105 (PE) | Biolegend | 323206 | |
| Anti-human-CD34 (FITC) | Biolegend | 343503 | |
| Anti-human-CD45 (APC) | Biolegend | 304011 | |
| Anti-human-CD73( APC) | Biolegend | 344006 | |
| Anti-human-CD90 (FITC) | Biolegend | 328108 | |
| Ascorbic acid | Solarbio | A8100 | |
| BMP-6 | Novoprotein | C012 | |
| Carbon dioxide level shaker | Crystal | CO-06UC6 | |
| Compensation Beads | BioLegend | 424601 | |
| CryoStor CS10 | STEMCELL Technology | 07959 | |
| Dexamethasone | Beyotime Biotechnology | ST1254 | |
| DMEM/F12 medium | Servicebio | G4610 | |
| Fetal bovine serum | HAKATA | HS-FBS-500 | |
| FGF2 | Stemcell | 78003.1 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G2500-100G | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | |
| human IgG1 isotype control APC | BioLegend | 403505 | |
| human IgG1 isotype control FITC | BioLegend | 403507 | |
| human IgG1 isotype control PE | BioLegend | 403503 | |
| Human TGF-β1 | Stemcell | 78067 | |
| Human TruStain FcX | BioLegend | 422301 | |
| IBMX | Beyotime Biotechnology | ST1398 | |
| Indomethacin | Solarbio | SI9020 | |
| Insulin | Beyotime Biotechnology | P3376 | |
| iPSC maintenance medium | STEMCELL Technology | 85850 | |
| ITS Media Supplement | Beyotime Biotechnology | C0341-10mL | |
| Matrigel, growth factor reduced | BD Corning | 354230 | |
| Oli Red O staining kit | Beyotime Biotechnology | C0158S | |
| Proline | Solarbio | P0011 | |
| Sodium pyruvate | ThermoFisher | 11360-070 | |
| TGFβ3 | Novoprotein | CJ44 | |
| Toluidine blue staining kit | Solarbio | G2543 | |
| TrypLE Express Enzyme(1x) | Gibco | 12604013 | |
| Ultra-Low Attachment 6 Well Plate | Costar | 3471 | |
| Versene | Gibco | 15040-66 | |
| Y-27632 | Stemcell | 72304 | |
| α-MEM | Hyclone | SH30265 | |
| β-glycerophosphate | Solarbio | G8100 |
References
- Weng, Z., et al. Mesenchymal stem/stromal cell senescence: Hallmarks, mechanisms, and combating strategies. Stem Cells Translational Medicine. 11 (4), 356-371 (2022).
- Soliman, H., et al. Multipotent stromal cells: One name, multiple identities. Cell Stem Cell. 28 (10), 1690-1707 (2021).
- Friedenstein, A. J., Chailakhyan, R. K., Gerasimov, U. V. Bone marrow osteogenic stem cells: in vitro cultivation and transplantation in diffusion chambers. Cell and Tissue Kinetics. 20 (3), 263-272 (1987).
- Friedenstein, A. J., et al. Precursors for fibroblasts in different populations of hematopoietic cells as detected by the in vitro colony assay method. Experimental Hematology. 2 (2), 83-92 (1974).
- Friedenstein, A. J., Gorskaja, J. F., Kulagina, N. N. Fibroblast precursors in normal and irradiated mouse hematopoietic organs. Experimental Hematology. 4 (5), 267-274 (1976).
- El Agha, E., et al. Mesenchymal stem cells in fibrotic disease. Cell Stem Cell. 21 (2), 166-177 (2017).
- Mushahary, D., Spittler, A., Kasper, C., Weber, V., Charwat, V. Isolation, cultivation, and characterization of human mesenchymal stem cells. Cytometry A. 93 (1), 19-31 (2018).
- Ullah, M., Liu, D. D., Thakor, A. S. Mesenchymal stromal cell homing: Mechanisms and strategies for improvement. iScience. 15, 421-438 (2019).
- Regmi, S., et al. Enhanced viability and function of mesenchymal stromal cell spheroids is mediated via autophagy induction. Autophagy. 17 (10), 2991-3010 (2021).
- Hoang, D. M., et al. Stem cell-based therapy for human diseases. Signal Transduction and Targeted Therapy. 7 (1), 272 (2022).
- Jiang, B., et al. Concise review: Mesenchymal stem cells derived from human pluripotent cells, an unlimited and quality-controllable source for therapeutic applications. Stem Cells. 37 (5), 572-581 (2019).
- Soontararak, S., et al. Mesenchymal stem cells (MSC) derived from induced pluripotent stem cells (iPSC) equivalent to adipose-derived MSC in promoting intestinal healing and microbiome normalization in mouse inflammatory bowel disease model. Stem Cells Translational Medicine. 7 (6), 456-467 (2018).
- Di Baldassarre, A., Cimetta, E., Bollini, S., Gaggi, G., Ghinassi, B. Human-induced pluripotent stem cell technology and cardiomyocyte generation: Progress and clinical applications. Cells. 7 (6), 48 (2018).
- Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress. Nature Reviews. Drug Discovery. 16 (2), 115-130 (2017).
- Levy, O., et al. Shattering barriers toward clinically meaningful MSC therapies. Science Advances. 6 (30), eaba6884 (2020).
- Zhao, C., Ikeya, M. Generation and applications of induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells International. 2018, 9601623 (2018).
- Path, G., Perakakis, N., Mantzoros, C. S., Seufert, J. Stem cells in the treatment of diabetes mellitus - Focus on mesenchymal stem cells. Metabolism. 90, 1-15 (2019).
- Zhou, Y., et al. One-step derivation of functional mesenchymal stem cells from human pluripotent stem cells. Bio-Protocol. 8 (22), e3080 (2018).
- Hua, Z., et al. Low-intensity pulsed ultrasound promotes osteogenic potential of iPSC-derived MSCs but fails to simplify the iPSC-EB-MSC differentiation process. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 841778 (2022).
- Dupuis, V., Oltra, E. Methods to produce induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells: Mesenchymal stem cells from induced pluripotent stem cells. World Journal of Stem Cells. 13 (8), 1094-1111 (2021).
- Zhang, W., et al. Aging stem cells. A Werner syndrome stem cell model unveils heterochromatin alterations as a driver of human aging. Science. 348 (6239), 1160-1163 (2015).
- Liu, G. H., et al. Modelling Fanconi anemia pathogenesis and therapeutics using integration-free patient-derived iPSCs. Nature Communications. 5, 4330 (2014).
- Kubben, N., et al. Repression of the antioxidant NRF2 pathway in premature aging. Cell. 165 (6), 1361-1374 (2016).
- Duan, S., et al. PTEN deficiency reprogrammes human neural stem cells towards a glioblastoma stem cell-like phenotype. Nature Communications. 6, 10068 (2015).
- Zhang, J., et al. Exosomes released from human induced pluripotent stem cells-derived MSCs facilitate cutaneous wound healing by promoting collagen synthesis and angiogenesis. Journal of Translational Medicine. 13, 49 (2015).
- Hu, G. W., et al. Exosomes secreted by human-induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells attenuate limb ischemia by promoting angiogenesis in mice. Stem Cell Research & Therapy. 6 (1), 10 (2015).
- Kang, R., et al. Mesenchymal stem cells derived from human induced pluripotent stem cells retain adequate osteogenicity and chondrogenicity but less adipogenicity. Stem Cell Research & Therapy. 6 (1), 144 (2015).
- Wang, L. T., et al. Differentiation of mesenchymal stem cells from human induced pluripotent stem cells results in downregulation of c-Myc and DNA replication pathways with immunomodulation toward CD4 and CD8 cells. Stem Cells. 36 (6), 903-914 (2018).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Kim, S., Kim, T. M. Generation of mesenchymal stem-like cells for producing extracellular vesicles. World Journal of Stem Cells. 11 (5), 270-280 (2019).
