Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

مقارنة بين طريقتين تمثيليتين لتمايز الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة بشريا إلى خلايا لحمية وسيطة

Published: October 20, 2023 doi: 10.3791/65729
Automatic Translation
1, 2,3, 4, 2, 1,2, 2,3
1National Clinical Research Center for Child Health, The Children's Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 2Department of Nephrology, The Children's Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 3Zhejiang University School of Medicine, 4Liangzhu Laboratory, Zhejiang University

Summary

يصف هذا البروتوكول ويقارن طريقتين تمثيليتين للتمييز بين hiPSCs إلى خلايا انسجة اللحمة المتوسطة (MSCs). تتميز طريقة الطبقة الأحادية بتكلفة أقل وتشغيل أبسط وتمايز عظمي أسهل. تتميز طريقة الأجسام الجنينية (EBs) باستهلاك أقل للوقت.

Abstract

الخلايا اللحمية المتوسطة (MSCs) هي خلايا جذعية بالغة متعددة القدرات تستخدم على نطاق واسع في الطب التجديدي. نظرا لأن MSCs المشتقة من الأنسجة الجسدية مقيدة بالتبرع المحدود واختلافات الجودة والسلامة البيولوجية ، فقد شهدت السنوات ال 10 الماضية ارتفاعا كبيرا في الجهود المبذولة لتوليد MSCs من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (hiPSCs). تركزت الجهود السابقة والحديثة في تمايز hiPSCs إلى MSCs حول منهجيتين للاستزراع: (1) تكوين الأجسام الجنينية (EBs) و (2) استخدام الثقافة أحادية الطبقة. يصف هذا البروتوكول هاتين الطريقتين التمثيليتين في اشتقاق MSC من hiPSCs. تقدم كل طريقة مزاياها وعيوبها ، بما في ذلك الوقت والتكلفة والقدرة على تكاثر الخلايا والتعبير عن علامات MSC وقدرتها على التمايز في المختبر. يوضح هذا البروتوكول أن كلتا الطريقتين يمكن أن تشتق MSCs ناضجة ووظيفية من hiPSCs. تتميز طريقة الطبقة الأحادية بتكلفة أقل ، وتشغيل أبسط ، وتمايز عظمي أسهل ، بينما تتميز طريقة EB باستهلاك أقل للوقت.

Introduction

الخلايا اللحمية المتوسطة (MSCs) هي خلايا جذعية بالغة متعددة القدرات مشتقة من الأديم المتوسط1. MSCs موجودة في جميع الأنسجة الضامة تقريبا2. منذ اكتشاف MSCs لأول مرة في سبعينيات القرن العشرين وعزلها بنجاح من نخاع العظام في عام 1987 من قبل Friedenstein et al.3،4،5 ، تم استخدام مجموعة متنوعة من الأنسجة الجسدية البشرية (بما في ذلك الجنين والبالغين) لعزل MSCs مثل العظام والغضاريف والأوتار والعضلات والأنسجة الدهنية ، والسدى الداعم للدم1،2،6،7. تظهر MSCs قدرات تكاثرية عالية ومرونة للتمايز إلى العديد من سلالات الخلايا الجسدية ويمكن أن تهاجر إلى الأنسجة المصابة والملتهبة2،8،9. هذه الخصائص تجعل MSCs مرشحا محتملا للطب التجديدي10. ومع ذلك ، فإن MSCs المشتقة من الأنسجة الجسدية (st-MSCs) مقيدة بالتبرع المحدود ، والقدرة المحدودة على تكاثر الخلايا ، واختلافات الجودة ، ومخاوف السلامة البيولوجية للانتقال المحتمل لمسببات الأمراض ، إن وجدت ، من المتبرعين11،12.

تستمد الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (hiPSCs) من إعادة برمجة الخلايا البالغة بعوامل النسخ (Oct4 و Sox2 و Klf4 و c-Myc) ، والتي لها وظائف مماثلة للخلايا الجذعية الجنينية13,14. يمكنهم التجديد الذاتي وامتلاك إمكانية التمايز إلى أي نوع من الخلايا الجسدية ، بما في ذلك MSCs. بالمقارنة مع st-MSCs ، تتمتع iPSC-MSCs بميزة العرض غير المحدود ، والتكلفة المنخفضة ، والنقاء العالي ، والراحة في مراقبة الجودة ، وسهولة الإنتاج على نطاق واسع وتعديل الجينات15،16،17.

نظرا لهذه المزايا ل iPSC-MSCs ، تم الإبلاغ عن مجموعة متنوعة من الطرق التي تقود MSC من iPSC. تركزت طرق التمايز هذه حول منهجيتين للاستزراع: (1) تكوين الأجسام الجنينية (EBs) و (2) استخدام الثقافات أحادية الطبقة11،18،19،20. وهنا تم تحديد نهج تمثيلي لكل من المنهجيتين. علاوة على ذلك ، تم أيضا الوصول إلى مقارنات بين نهجين تمثيليين على أساس الوقت والتكلفة والقدرة على التكاثر والتعبير عن المؤشرات الحيوية MSC والقدرة على التمايز في المختبر .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. صيانة hiPSCs

  1. ذوبان الجليد من hiPSC
    1. أخرج الخلايا من النيتروجين السائل وقم بإذابة الخلايا بسرعة في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية. انقل خلايا الذوبان إلى أنبوب سعة 15 مل محضر ب 3 مل من وسط صيانة iPSC (جدول المواد). مزيج بلطف المتوسطة.
    2. أجهزة الطرد المركزي في 300 × ز لمدة 5 دقائق. قم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليق الخلايا برفق في 1 مل من وسط صيانة iPSC باستخدام 10 ميكرومتر Y-27632 (ماصة الخلايا لأعلى ولأسفل 2-3 مرات).
    3. انقل معلق الخلايا إلى صفيحة زراعة الأنسجة المكونة من 6 آبار والمغلفة بهلام مصفوفة خارج الخلية مخفض عامل النمو (GFR) (1: 100) و 2 مل من وسط صيانة iPSC مع إضافة 10 ميكرومتر Y-27632 مسبقا (حوالي 4 × 104 خلايا / سم2).
    4. استزرع الخلايا لمدة 5-6 أيام (التقاء 80٪ -90٪) عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 مع تغيير وسائط صيانة iPSC كل يوم.
  2. مرور hiPSC
    1. قم بإزالة وسيط صيانة iPSC من اللوحة المكونة من 6 آبار. اغسل hiPSCs مرة واحدة باستخدام DPBS.
    2. أضف 700-800 ميكرولتر من محلول EDTA 0.48 mM واحتضانه لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT) ، ثم قم بإزالة محلول الهضم. استمر في الاحتضان عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 3-5 دقائق.
    3. عندما يتم هضم الخلايا في صفائح (لا تهضم الخلايا إلى خلايا مفردة) ، أضف 1 مل من وسط صيانة iPSC مع 10 ميكرومتر Y-27632 لإنهاء عملية الهضم. ماصة بعناية الخلايا صعودا وهبوطا 2-3 مرات.
    4. انقل معلق الخلية إلى صفيحة زراعة الأنسجة المكونة من 6 آبار والمغلفة بهلام مصفوفة خارج الخلية مخفض عامل النمو (GFR) (1: 100) و 2 مل من وسط صيانة iPSC مع إضافة 10 ميكرومتر Y-27632 مسبقا.
      ملاحظة: تتراوح نسبة المرور من 1: 6 إلى 1:20 (حوالي 4 × 104 خلايا / سم2) ، ويبلغ متوسط حجم التجميع حوالي 50-200 ميكرومتر.
    5. استزرع الخلايا حتى التقاء 80٪ -90٪ (5-6 أيام) عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 مع تغيير وسائط صيانة iPSC كل يوم.

2. تمايز MSCs من hiPSCs عبر تشكيل EB

ملاحظة: الطريقة مشتقة من الأدبيات السابقة21،22،23،24. نظرة عامة على الطريقة موضحة في الشكل 1. يتم تلخيص خصائص الطريقة في الجدول 1.

  1. تحضير الوسط
    1. قم بإعداد وسط تمايز MSC عن طريق استكمال α-MEM ب 1٪ (v / v) GlutaMAX ، و 10٪ (v / v) FBS ، و 10 نانوغرام / مل FGF2 ، و 5 نانوغرام / مل TGFβ.
    2. قم بإعداد وسيط صيانة MSC عن طريق استكمال α-MEM ب 1٪ (v / v) GlutMAX و 10٪ (v / v) FBS و 1 نانوغرام / مل FGF2.
  2. إعداد hiPSCs
    1. خطوط hiPSCs المستنبتة (مرور 2-3 مرات على الأقل بعد الذوبان) في وسط صيانة iPSC على صفيحة استزراع أنسجة ذات 6 آبار مغطاة بعامل نمو منخفض (GFR) - هلام مصفوفة خارج الخلية (1: 100) عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 حتى التقاء 80٪ -90٪.
  3. اليوم 0: تشكيل EB
    1. قم بإزالة وسيط صيانة iPSC من اللوحة المكونة من 6 آبار. اغسل hiPSCs مرة واحدة باستخدام DPBS.
    2. أضف 700-800 ميكرولتر من محلول 0.48 mM EDTA واحتضانه لمدة 1 دقيقة في RT ، ثم قم بإزالة محلول الهضم. استمر في الاحتضان عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 3-5 دقائق.
    3. عندما يتم هضم الخلايا في صفائح (لا تهضم الخلايا إلى خلايا مفردة) ، أضف 2 مل من وسط صيانة iPSCs (يحتوي على مثبط 10 ميكرومتر Rock و 1: 100 GFR- هلام مصفوفة خارج الخلية) لإنهاء الهضم.
    4. انقل الخلايا إلى لوحة تثبيت منخفضة 6 آبار. بذر الخلايا بنسبة 2 بئر من لوحة زراعة الأنسجة إلى 1 بئر من لوحة التعلق المنخفضة. احتضان الخلايا في شاكر (60 دورة في الدقيقة / دقيقة) عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 لمدة 24 ساعة لتشكيل EBs كروية.
  4. اليوم 1-اليوم 7: تمايز EB
    1. انقل EBs إلى أنبوب الطرد المركزي باستخدام ماصة باستور (دون تدمير EBs) واترك EBs تترسب بشكل طبيعي لمدة 5-10 دقائق في RT. ثم قم بإزالة المادة الطافية.
    2. انقل EBs إلى لوحة تثبيت منخفضة 6 بئر مع 2 مل من وسط التمايز MSC. استزرع EBs على شاكر عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 لمدة 7 أيام مع تغيير متوسط مرة واحدة.
  5. اليوم 8-اليوم 17: تلقيح EB
    1. انقل EBs إلى أنبوب الطرد المركزي باستخدام ماصة باستور (دون تدمير EBs) واترك EBs تترسب بشكل طبيعي لمدة 5-10 دقائق. ثم قم بإزالة المادة الطافية.
    2. انقل EBs إلى صفيحة 6 آبار مغلفة بالهلام بمصفوفة GFR خارج الخلية مع 2 مل من وسط صيانة MSC. الثقافة حتى التقاء 90٪ (~ 10 أيام) مع تغيير الوسائط المنتظم بعد التصاق الخلية.
  6. اليوم 18-اليوم 27: نضج MSCs وتوسعها
    1. عالج المستنبتة المشتقة من EB بمحلول تفكك عند 37 درجة مئوية لمدة 5-10 دقائق (يختلف وقت الهضم بسبب وجود أنواع مختلفة من الخلايا).
    2. عندما يتم هضم جزء من الخلايا في خلايا مفردة ، أضف 2 مل من وسيط صيانة MSC لإنهاء عملية الهضم ونقل تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي. اغسل الخلايا المتبقية غير المهضومة مرة واحدة باستخدام DPBS واهضمها مرة أخرى. كرر عدة مرات حتى يتم هضم جميع الخلايا في خلايا واحدة. جهاز الطرد المركزي تعليق الخلية عند 250 × جم لمدة 5 دقائق ، ثم قم بإزالة المادة الطافية.
    3. قم بزرع الخلايا على صفيحة استزراع مغلفة بالجيلاتين (حوالي 2 × 105 خلايا / سم2). الثقافة حتى التقاء 90٪ في وسط صيانة MSC مع تغيير متوسط بانتظام. عين هذا الجيل من الخلايا كممر 0 (P0) في هذه المرحلة.
    4. من أجل جعل MSC نقيا وناضجا ، استمر في تمرير الخلايا مرتين بنسبة انقسام 1: 3 في حوالي 6 أيام. تقدم معظم الخلايا مورفولوجيا تشبه الخلايا الليفية (على شكل مغزل).

3. تمايز MSCs من hiPSCs عبر ثقافة أحادية الطبقة

ملاحظة: الطريقة مشتقة من الأدبيات السابقة25،26،27،28. نظرة عامة على هذه الطريقة موضحة في الشكل 1. يتم تلخيص خصائص الطريقة في الجدول 1.

  1. تحضير الوسط
    1. قم بإعداد وسيط صيانة MSC عن طريق استكمال α-MEM ب 1٪ (v / v) GlutMAX و 10٪ (v / v) FBS و 1 نانوغرام / مل FGF2.
  2. إعداد hiPSCs
    1. خطوط hiPSCs المستنبتة (مرور 2-3 مرات على الأقل بعد الذوبان) في وسط صيانة iPSC على صفيحة زراعة الأنسجة المكونة من 6 آبار مغلفة بهلام مصفوفة خارج الخلية مخفض عامل النمو (GFR) (1: 100) عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 حتى التقاء 50٪ -60٪.
  3. اليوم 0-اليوم 13: التمايز عن طريق الثقافات أحادية الطبقة المباشرة
    1. قم بإزالة وسيط صيانة iPSC من اللوحة المكونة من 6 آبار.
    2. أضف مباشرة 2 مل من وسيط صيانة MSC والثقافة لمدة 14 يوما عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 ، مع تغيير الوسائط كل يوم.
  4. اليوم 14-اليوم 35: نضوج MSCs عن طريق المرور المتكرر
    1. عالج الثقافات أحادية الطبقة بمحلول تفكك عند 37 درجة مئوية لمدة 5-10 دقائق (يختلف وقت الهضم بسبب وجود أنواع مختلفة من الخلايا).
    2. عندما يتم هضم الخلايا في خلايا مفردة ، أضف 2 مل من وسيط صيانة MSC لإنهاء عملية الهضم ونقل تعليق الخلية إلى أنبوب الطرد المركزي. اغسل الخلايا المتبقية غير المهضومة مرة واحدة باستخدام DPBS واهضمها مرة أخرى. كرر عدة مرات حتى يتم هضم جميع الخلايا في خلايا واحدة. جهاز الطرد المركزي تعليق الخلية عند 250 × جم لمدة 5 دقائق ، ثم قم بإزالة المادة الطافية.
    3. بذر الخلايا على طبق استزراع مغلف بالجيلاتين (حوالي 2 × 105 خلايا / سم2). الثقافة حتى التقاء 90٪ في وسيط صيانة MSC مع تغيير الوسائط بانتظام. عين هذا الجيل من الخلايا كممر 0 (P0) في هذه المرحلة.
    4. من أجل جعل MSC نقيا وناضجا ، استمر في تمرير الخلايا 6 مرات بنسبة انقسام 1: 3 في حوالي 18 يوما. تقدم معظم الخلايا مورفولوجيا تشبه الخلايا الليفية (على شكل مغزل).

4. تحليل المستضدات السطحية ل MSCs التي تقود hiPSC عن طريق قياس التدفق الخلوي

ملاحظة: على غرار المستضدات السطحية ل MSCs المشتقة من نخاع العظم ، فإن MSC الذي يقود hiPSCs يعبر عن CD105 و CD73 و CD90 ، ولكن لا يعبر عن CD45 و CD3429. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام hiPSCs كخلايا تحكم سلبية. يوضح الشكل 2 تحليل المستضدات السطحية ل MSCs التي تقود hiPSC و hiPSCs عن طريق قياس التدفق الخلوي.

  1. عالج MSCs التي تقود hiPSC بمحلول تفكك عند 37 درجة مئوية لمدة 2-3 دقائق. عالج hiPSCs بكاشف تفكك 0.48 mM EDTA واحتضانه لمدة 1 دقيقة في RT ، ثم قم بإزالة كاشف التفكك. استمر في الاحتضان عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 3-5 دقائق.
  2. عندما يتم هضم الخلايا في خلايا مفردة ، أضف وسيطا (وسيط صيانة MSC إلى MSCs ووسط صيانة iPSC إلى iPSCs) لإنهاء عملية الهضم.
  3. أجهزة الطرد المركزي تعليق الخلية في 350 × غرام لمدة 5 دقائق ، ثم إزالة طاف.
  4. اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام DPBS البارد ، وأجهزة الطرد المركزي عند 350 × جم لمدة 5 دقائق ، ثم قم بإزالة المادة الطافية.
  5. عد الخلايا وإعادة تعليقها في محلول FBS-DPBS (v / v) بارد بنسبة 10٪ عند 10 × 106 خلايا / مل وتوزيع 100 ميكرولتر / أنبوب تعليق الخلية (1 × 106 خلايا / أنبوب) في أنابيب طرد مركزي سعة 1.5 مل.
  6. أضف 5 ميكرولتر من محلول حجب مستقبلات Fc البشري إلى 100 ميكرولتر من تعليق الخلية. احتضان لمدة 5-10 دقائق في RT لأداء حجب غير محدد.
  7. أجهزة الطرد المركزي في 350 × ز لمدة 5 دقائق وإزالة طاف. اغسل الخلايا مرتين بمحلول FBS-DPBS (v / v) بارد بنسبة 2٪.
  8. أعد تعليق الخلايا في محلول بارد 100 ميكرولتر من محلول FBS-DPBS (v / v) بنسبة 2٪.
  9. أضف 5 ميكرولتر (اختبار واحد) من مضاد CD34-FITC و 5 ميكرولتر (اختبار واحد) من مضاد CD45-APC إلى خلية 100 ميكرولتر
    تعليق. أضف 5 ميكرولتر (اختبار واحد) من anti-CD73-APC ، و 5 ميكرولتر (اختبار واحد) من anti-CD90-FITC و 5 ميكرولتر (اختبار واحد) من anti-CD105-PE إلى أنبوب تعليق خلية 100 ميكرولتر آخر. أضف 5 ميكرولتر من التحكم في النمط المتماثل IgG1 البشري FITC ، والتحكم في النمط المتماثل IgG1 البشري PE و APC للتحكم في النمط المتماثل IgG1 البشري إلى أنبوب تعليق الخلية الثالث 100 ميكرولتر. احتضان لمدة 15-20 دقيقة على الجليد في الظلام. وفي الوقت نفسه ، إعداد حبات تلطيخ واحد.
  10. اغسل الخلايا مرتين بمحلول FBS-DPBS (v / v) بارد بنسبة 2٪.
  11. أضف 300 ميكرولتر من محلول FBS-DPBS (v / v) البارد 2٪ لإعادة تعليق الخلايا ، وقم بالتصفية عبر مرشح شاشة 200 شبكة.
  12. تحليل العينات باستخدام قياس التدفق الخلوي. تحليل تعليق الخلية ملطخة بالأجسام المضادة للتحكم في النمط المتماثل وتعيين البوابة. ثم تحليل تعليق الخلية ملطخة بالأجسام المضادة المستهدفة.

5. التمايز العظمي ل MSCs التي تقود hiPSC

ملاحظة: تمتلك MSCs التي تقود hiPSC إمكانية تمايز عظمي (الشكل 3 أ ، ب). ويرد أدناه بروتوكول التمايز العظمي.

  1. تحضير وسط الحث العظمي عن طريق استكمال α-MEM مع 10٪ FBS ، 100 نانومتر ديكساميثازون ، 10 مللي مول بيتا جليسيروفوسفات ، و 100 ميكرومتر حمض الأسكوربيك.
  2. بذر 1 × 105 MSCs في صفيحة 48 بئر مغلفة بالجيلاتين وثقافة حتى تتلاقى بنسبة 60٪ -70٪.
  3. قم بإزالة الوسط وإضافة 0.3 مل من وسط الحث العظمي. استزراع الخلايا في وسط تحريض عظمي لمدة 14 يوما عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 ، مع تغيير الوسائط كل 3 أيام.
  4. قم بإزالة الوسط واغسله باستخدام DPBS مرة واحدة.
  5. أضف 0.3 مل من 4٪ PFA واحتضان في RT لمدة 30 دقيقة.
  6. إزالة PFA. شطف الخلايا مع 0.3 مل من DPBS لمدة 10 دقائق في RT وكرر 3 مرات.
  7. قم بإزالة DPBS ، وأضف 0.2 مل من محلول تلطيخ Alizarin الأحمر ، واحتضانه لمدة 30 دقيقة في RT.
  8. قم بإزالة محلول التلوين ، وشطف الخلايا باستخدام 0.3 مل DPBS لمدة 10 دقائق في RT ، وكرر 3 مرات.
  9. مراقبة تلطيخ ترسب الكالسيوم تحت المجهر الضوئي.

6. التمايز الأديبوجيني ل MSCs التي تقود hiPSC

ملاحظة: تمتلك MSCs التي تقود hiPSC إمكانية تمايز adipogenic (الشكل 3C ، D). ويرد أدناه بروتوكول التمايز الشحمي.

  1. تحضير وسط الحث الشحمي عن طريق استكمال α-MEM مع 10٪ FBS ، 1 ميكرومتر ديكساميثازون ، 1 ميكرومتر IBMX ، 10 ميكروغرام / مل أنسولين ، و 100 ميكرومتر إندوميتاسين. تحضير وسط صيانة منشأ عن طريق استكمال α-MEM ب 10٪ FBS و 10 ميكروغرام / مل من الأنسولين.
  2. بذر 1 × 105 MSCs في صفيحة 48 بئر مغلفة بالجيلاتين وثقافة حتى تصل كثافة الخلية إلى 90٪.
  3. قم بإزالة الوسط وإضافة 0.3 مل من وسط الحث الشحمي. استمر في زراعة الخلايا في وسط الحث الشحمي لمدة 4 أيام عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2.
  4. قم بإزالة الوسط وإضافة 0.3 مل من وسط الصيانة المحفز. استمر في زراعة الخلايا في وسط الصيانة الشحمي لمدة 3 أيام عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2.
  5. كرر الخطوتين 6.3 و 6.4 2-3 مرات حتى تمايز الخلايا الشحمية ونضجها.
  6. قم بإزالة الوسط واغسله باستخدام DPBS مرة واحدة.
  7. أضف 0.3 مل من 4٪ PFA واحتضانها في RT لمدة 10 دقائق. إزالة PFA وشطف 2 مرات مع DPBS.
  8. ضع صبغة Oli Red O وفقا لتعليمات الشركة المصنعة وراقب قطرات الدهون تحت المجهر الضوئي.

7. التمايز الغضروفي ل MSCs التي تقود hiPSC

ملاحظة: تمتلك MSCs التي تقود hiPSC إمكانية تمايز غضروفي (الشكل 3E ، F). ويرد أدناه بروتوكول التمايز الغضروفي.

  1. تحضير وسط تحريض الأرومة الغضروفية عن طريق إضافة α-MEM مع 10٪ FBS ، 100 نانومتر ديكساميثازون ، 1٪ أنسولين ترانسفيرين سيلينيوم (ITS) ، 10 ميكرومتر حمض الأسكوربيك ، 1 مللي مول بيروفات الصوديوم ، 50 ميكروغرام / مل برولين ، 0.02 نانومتر عامل نمو تحويل β3 (TGFβ3) ، و 0.5 ميكروغرام / مل بروتين مورفوجيني عظمي 6 (BMP-6).
  2. اجمع 2.5 × 105 MSCs التي تقود hiPSC وأجهزة الطرد المركزي الخلايا عند 150 × جم لمدة 5 دقائق ، ثم قم بإزالة المادة الطافية. تعليق الخلايا في 1 مل من α-MEM ثم أجهزة الطرد المركزي عند 150 × غرام لمدة 5 دقائق.
  3. قم بإزالة المادة الطافية وتعليق الخلايا في 0.5 مل من وسط الحث الغضروفي المولد. أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 150 × غرام لمدة 5 دقائق.
  4. قم بفك الغطاء والثقافة مباشرة لمدة 21 يوما مع تغيير وسائط الحث الغضروفي كل 3 أيام عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2. حرك أنبوب الطرد المركزي برفق لتعليق الكريات الغضروفية (دون تدمير الكريات الغضروفية) كل يوم أثناء التمايز الغضروفي.
  5. قم بإزالة المادة الطافية واغسلها ب 0.5 مل من برنامج تلفزيوني مرتين.
  6. أضف 0.3 مل من 4٪ PFA وثبت لمدة 24 ساعة.
  7. يقوم البارافين بتضمين الكريات الغضروفية ، ثم تقسيمها (3 ميكرومتر). تلطيخ المقاطع باللون الأزرق التولويدين (1٪) لمدة 30 دقيقة.
  8. مراقبة مصفوفة الخلايا الغضروفية خارج الخلية تحت المجهر الضوئي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

باتباع البروتوكول (الشكل 1 أ) ، تم تمييز hiPSCs إلى MSCs عبر تكوين EB وطرق الاستزراع أحادي الطبقة. أثناء التمايز ، أظهرت الخلايا مورفولوجيات تمثيلية مختلفة (الشكل 1B ، C).

كما هو موضح في الشكل 1B ، تعرض مستعمرات hiPSCs مورفولوجيا مضغوطة نموذجية قبل التمايز بحدود واضحة تتكون من خلايا معبأة بإحكام. تشكلت EBs كروية موحدة بعد انفصال hiPSCs واستزراعها لمدة 24 ساعة على شاكر. خلال اليوم 1 إلى اليوم 7 من الثقافة في وسط تمايز MSCs ، أصبحت الحافة الملساء ل EB خشنة ، ونما حجم EB بشكل كبير. من اليوم 8 إلى اليوم 17 ، بعد نقل EBs إلى لوحة 6 آبار مغلفة بالهلام خارج الخلية GFR ، التصقت EBs تدريجيا باللوحة ، وانتشرت العديد من الخلايا أحادية الطبقة الملتصقة حول EBs. عندما وصلت الخلايا إلى التقاء 90٪ في اليوم 18 ، تم هضم الخلايا وزرعها على صفيحة ثقافة مغلفة بالجيلاتين. في اليوم 19 ، التصقت الخلية وأظهرت شكلا متعدد الأضلاع. على التوالي ، تم تمرير الخلايا مرتين عندما كانت متقاربة بنسبة 90٪. نضجت MSCs المشتقة تدريجيا وأظهرت شكل مغزل نموذجي ، ونمت المستعمرة في دوامة.

كما هو موضح في الشكل 1C ، زاد حجم الخلايا وانتشرت حول المستعمرة بعد استبدال وسط صيانة iPSC بوسط صيانة MSC لمدة 24 ساعة. أثناء استزراعها في وسط صيانة MSC ، تكاثرت الخلايا تدريجيا وشكلت خلايا ملتصقة متعددة الطبقات. في اليوم 14 ، تم هضم الخلايا وزرعها على طبق ثقافة مغلف بالجيلاتين. في اليوم 15 ، التصقت الخلية وأظهرت شكلا متعدد الأضلاع. على التوالي ، تم تمرير الخلايا 6 مرات عندما كانت متقاربة بنسبة 90٪. نضجت MSCs المشتقة تدريجيا وأظهرت شكل مغزل نموذجي ، ونمت المستعمرة في دوامة.

تم تحليل المستضدات السطحية ل hiPSCs و MSCs التي تقود hiPSC بواسطة قياس التدفق الخلوي (الشكل 2). كما هو موضح في الشكل 2C ، كانت hiPSCs موجبة ل CD90 وسالبة ل CD34 و CD45 و CD73 و CD105. بعد التمييز بين hiPSCs إلى MSCs عبر كلتا الطريقتين ، كانت MSCs الدافعة موجبة ل CD90 و CD73 و CD105 ، وسلبية ل CD34 و CD45 (الشكل 2A ، B).

تم التحقيق في قدرة التمايز ل MSCs التي تقود hiPSC من خلال التمايز العظمي ، والشحمي ، والغضروفي. كما هو موضح في الشكل 3 ، تم تمييز كل من MSCs التي تقود hiPSC من الطريقتين إلى بانيات العظم ، والخلايا الشحمية ، والخلايا الغضروفية. شكلت MSCs التي تقود hiPSC لطريقة أحادية الطبقة رواسب كالسيوم أكثر من طريقة EB (الشكل 3B). لم يكن للطريقتين فرق كبير في التمايز الدهني وقدرة التمايز الغضروفي (الشكل 3D ، F).

تم فحص قدرة انتشار MSCs التي تقود hiPSC من خلال ثقافة المرور المستمر. كما هو موضح في الشكل 3G ، يمكن تمرير MSCs التي تقود hiPSC لكلتا الطريقتين لأكثر من 20 مقطعا ولا تزال تحافظ على قدرة الانتشار السريع.

تعتمد المقارنة بين النهجين المبينين في الجدول 1 على وقت التمايز والتكلفة والقدرة على تكاثر الخلايا وتعبير علامات MSC وقدرتها على التمايز في المختبر.

Figure 1
الشكل 1: تمييز hiPSCs إلى MSCs عبر طريقة تكوين EB وطريقة الثقافة أحادية الطبقة. (أ) رسم تخطيطي يوضح تمايز hiPSCs إلى MSCs عبر تكوين EB وثقافة أحادية الطبقة. مورفولوجيا تمثيل الخلايا في العاثيات الرئيسية أثناء اشتقاق MSCs من hiPSCs عبر (B) تكوين EB و (C) ثقافة أحادية الطبقة. قضبان المقياس: 300 ميكرومتر و 50 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 2
الشكل 2: تحليل المستضدات السطحية ل MSCs التي تقود hiPSC عن طريق قياس التدفق الخلوي. نسب التعبير لمستضدات سطح MSC في MSCs التي تقود iPSC عبر (A) تكوين EB و (B) ثقافة أحادية الطبقة. (ج) تم استخدام hiPSCs كعنصر تحكم سلبي. علامات MSCs السلبية: CD34 ، CD45 ؛ علامات MSCs الإيجابية: CD73 و CD90 و CD105. العلامات السلبية hiPSCs: CD34 و CD45 و CD73 و CD105 ؛ علامات إيجابية hiPSCs: CD90. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: التمايز ثلاثي الأسطر والقدرة على الانتشار ل MSCs التي تقود hiPSC. (أ) تلطيخ أحمر أليزارين لرواسب الكالسيوم في MSCs التي تقود hiPSC في وسط التمايز العظمي لمدة 2 أسابيع. قضبان المقياس: 300 ميكرومتر. (ب) القياس الكمي لتلطيخ أحمر أليزارين S بواسطة تحليل ImageJ. (C) تلطيخ Oli red O لقطرات الدهون من MSCs التي تقود hiPSC في وسط التمايز الشحمي لمدة 2 أسابيع. قضبان المقياس: 300 ميكرومتر. (د) القياس الكمي لتلطيخ Oli Red O بواسطة تحليل ImageJ. ه: تلطيخ التولويدين الأزرق لمصفوفة الخلايا الغضروفية خارج الخلية. قضبان المقياس: 300 ميكرومتر و 150 ميكرومتر. (F) القياس الكمي لتلطيخ التولويدين الأزرق بواسطة تحليل ImageJ. (ز) حساب مضاعفة عدد MSCs لقيادة hiPSC. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المقارنه طريقة تشكيل EB طريقة الثقافات أحادية الطبقة
وقت التمايز 27 يوما 35 يوما
كلف عال منخفض
سرعة الانتشار صوم صوم
القدرة على الانتشار ≥20 مرور ≥20 مرور
التعبير عن علامات MSC CD73 / CD90 / CD105 إيجابي ، CD34 / CD45 nagative CD73 / CD90 / CD105 إيجابي ، CD34 / CD45 nagative
القدرة على التمايز التمايز الأديبوجيني ، التمايز الغضروفي والقدرة على التمايز العظمي التمايز الأديبوجيني ، التمايز الغضروفي وقدرة تمايز عظمية أقوى
عملية معقد بسيط

الجدول 1: خصائص الطريقتين للتمييز بين hiPSCs إلى MSCs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في هذا البروتوكول ، تم فحص طريقتين تمثيليتين للتمييز بين hiPSCs إلى MSCs20،21،22،23،24،25،26،27،28،30. كانت كلتا الطريقتين قادرتين على اشتقاق MSCs من hiPSCs. تم تأكيد MSCs المشتقة من hiPSC بواسطة مورفولوجيا الخلية (الشكل 1) ، والمستضدات السطحية (الشكل 2) ، وقدرتها على التمايز (الشكل 3).

تشترك كلتا الطريقتين في نفس وسيط صيانة MSC ، بينما تحتاج طريقة EB أيضا إلى وسيط تمايز MSC مع TGF-β و FGF2. بالإضافة إلى ذلك ، تتطلب طريقة EB ارتباطا منخفضا ب 6 ألواح بئر وشاكر خاص يمكن وضعه في حاضنة ثاني أكسيد الكربون. لذلك ، كانت تكلفة طريقة EB أعلى من تكلفة طريقة أحادية الطبقة18,20. يبدو أن طريقة EB أكثر تعقيدا من طريقة الطبقة الأحادية. ومع ذلك ، كان وقت التمايز لطريقة EB أقصر ، مما أدى إلى تجنب مقاطع متعددة لإثراء MSCs.

وجدنا أن التسامح مع الظروف المحيطة لطريقة EB كان أقوى من طريقة الطبقة الأحادية. تأثرت كلتا الطريقتين بحالة iPSC والتدخل البشري وبيئة الثقافة11،20. ومع ذلك ، وجدنا أن نسبة نجاح طريقة EB كانت أعلى بكثير من طريقة الطبقة الأحادية. كانت المرحلة الرئيسية لطريقة EB هي مرحلة تمايز EB من اليوم 1 إلى اليوم 7. خلال الأيام 1-7 ، إذا أصبحت EBs تدريجيا أصغر أو مكسورة مع الكثير من الخلايا الميتة العائمة في وسط الثقافة أو شكلت EBs فراغ ، فإن EBs غير المؤهلين يواجهون صعوبة في الالتصاق بلوحة الجيلاتين والقليل ، إن وجد ، الخلايا الملتصقة التي تزحف من EBs. من اليوم 1 إلى اليوم 7 ، كانت EBs المؤهلة موحدة وسيتم توسيعها قليلا ، وتصبح حوافها الملساء خشنة تدريجيا مع الخلايا البارزة. بعد نقلها إلى لوحة الجيلاتين ، التصقت EBs باللوحة بسرعة ، وانتشرت العديد من الخلايا أحادية الطبقة الملتصقة حول EBs. إذا تم تأهيل EBs خلال الأيام 1-7 ، فمن السهل تحقيق التمايز اللاحق. في المقابل ، يمكن أن تفشل طريقة الطبقة الأحادية في أي مرحلة. من اليوم 1 إلى اليوم 14 ، قد تسقط الخلايا الملتصقة في بقع ، مما يشير إلى فشل التمايز. عادة ، تتكاثر الخلايا الملتصقة وتشكل خلايا ملتصقة متعددة الطبقات. بعد اليوم 14 ، ستظل طريقة الطبقة الأحادية تفشل لأن عددا قليلا من الخلايا متصلة بالطبق. خلال الأيام 0-13 من طريقة أحادية الطبقة ، لاحظنا مورفولوجيا الخلية المختلفة في الطبق. ومع ذلك ، كان مورفولوجيا الخلية لطريقة EB في الأيام 8-17 متجانسة. بالمقارنة مع طريقة الطبقة الأحادية ، نشك في أن طريقة EB تشبه إلى حد كبير عملية التطور الجنيني وهي طريقة تمايز مبرمجة أكثر قابلية للتحكم.

يمكن استخدام كلتا الطريقتين لأكثر من 20 مقطعا مع الحفاظ على قدرة الانتشار السريع11. كانت رواسب الكالسيوم في التمايز العظمي في طريقة الطبقة الأحادية أكثر من تلك الموجودة في طريقة EB. يجب استخدام مصل خاص بالخلايا الجذعية لتجنب تأثير السيتوكينات في المصل على التمايز. لاحظنا أن الخلايا ستتوقف عن التكاثر إذا كانت كثافة الخلية منخفضة للغاية. لذلك ، بعد الوصول إلى نقطة التقاء ، يجب تمرير الخلايا بنسبة انقسام 1: 3. لم يتم استخدام المضادات الحيوية أثناء التمايز. لذلك ، فإن التقيد الصارم بالممارسات المختبرية الجيدة (GLP) إلزامي لهذا الإعداد التجريبي.

في الختام ، كانت هناك مزايا وعيوب لكل طريقة تم اختبارها في هذا البروتوكول. يمكن لكلتا الطريقتين إنشاء MSC من hiPSCs ، ويعتمد الاختيار على متطلبات المستخدم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

نحن ممتنون للغاية لجميع أعضاء مختبر ماو وهيو ، في الماضي والحاضر ، على المناقشات الشيقة والمساهمات العظيمة في المشروع. نحن ممتنون للمركز الوطني للبحوث السريرية لصحة الطفل على الدعم الكبير. تم دعم هذه الدراسة ماليا من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (U20A20351 إلى جيانهوا ماو ، 82200784 إلى ليدان هو) ، ومؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة تشجيانغ الصينية (No. LQ22C070004 إلى ليدان هو).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alizarin red staining kit Beyotime Biotechnology C0148S
Anti-human-CD105 (PE) Biolegend 323206
Anti-human-CD34 (FITC) Biolegend 343503
Anti-human-CD45 (APC) Biolegend 304011
Anti-human-CD73( APC) Biolegend 344006
Anti-human-CD90 (FITC) Biolegend 328108
Ascorbic acid Solarbio A8100
BMP-6 Novoprotein C012
Carbon dioxide level shaker Crystal CO-06UC6
Compensation Beads BioLegend 424601
CryoStor CS10 STEMCELL Technology 07959
Dexamethasone Beyotime Biotechnology ST1254
DMEM/F12  medium Servicebio G4610
Fetal bovine serum HAKATA HS-FBS-500
FGF2 Stemcell 78003.1
Gelatin Sigma-Aldrich G2500-100G
GlutaMAX Gibco 35050061
human IgG1 isotype control APC BioLegend 403505
human IgG1 isotype control FITC BioLegend 403507
human IgG1 isotype control PE BioLegend 403503
Human TGF-β1 Stemcell 78067
Human TruStain FcX  BioLegend 422301
IBMX Beyotime Biotechnology ST1398
Indomethacin Solarbio SI9020
Insulin Beyotime Biotechnology P3376
iPSC maintenance medium STEMCELL Technology 85850
ITS Media Supplement Beyotime Biotechnology C0341-10mL
Matrigel, growth factor reduced BD Corning 354230
Oli Red O staining kit Beyotime Biotechnology C0158S
Proline Solarbio P0011
Sodium pyruvate ThermoFisher 11360-070
TGFβ3 Novoprotein CJ44
Toluidine blue staining kit Solarbio G2543
TrypLE Express Enzyme(1x)  Gibco 12604013
Ultra-Low Attachment 6 Well Plate Costar 3471
Versene Gibco 15040-66
Y-27632 Stemcell 72304
α-MEM Hyclone SH30265
β-glycerophosphate Solarbio G8100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Weng, Z., et al. Mesenchymal stem/stromal cell senescence: Hallmarks, mechanisms, and combating strategies. Stem Cells Translational Medicine. 11 (4), 356-371 (2022).
  2. Soliman, H., et al. Multipotent stromal cells: One name, multiple identities. Cell Stem Cell. 28 (10), 1690-1707 (2021).
  3. Friedenstein, A. J., Chailakhyan, R. K., Gerasimov, U. V. Bone marrow osteogenic stem cells: in vitro cultivation and transplantation in diffusion chambers. Cell and Tissue Kinetics. 20 (3), 263-272 (1987).
  4. Friedenstein, A. J., et al. Precursors for fibroblasts in different populations of hematopoietic cells as detected by the in vitro colony assay method. Experimental Hematology. 2 (2), 83-92 (1974).
  5. Friedenstein, A. J., Gorskaja, J. F., Kulagina, N. N. Fibroblast precursors in normal and irradiated mouse hematopoietic organs. Experimental Hematology. 4 (5), 267-274 (1976).
  6. El Agha, E., et al. Mesenchymal stem cells in fibrotic disease. Cell Stem Cell. 21 (2), 166-177 (2017).
  7. Mushahary, D., Spittler, A., Kasper, C., Weber, V., Charwat, V. Isolation, cultivation, and characterization of human mesenchymal stem cells. Cytometry A. 93 (1), 19-31 (2018).
  8. Ullah, M., Liu, D. D., Thakor, A. S. Mesenchymal stromal cell homing: Mechanisms and strategies for improvement. iScience. 15, 421-438 (2019).
  9. Regmi, S., et al. Enhanced viability and function of mesenchymal stromal cell spheroids is mediated via autophagy induction. Autophagy. 17 (10), 2991-3010 (2021).
  10. Hoang, D. M., et al. Stem cell-based therapy for human diseases. Signal Transduction and Targeted Therapy. 7 (1), 272 (2022).
  11. Jiang, B., et al. Concise review: Mesenchymal stem cells derived from human pluripotent cells, an unlimited and quality-controllable source for therapeutic applications. Stem Cells. 37 (5), 572-581 (2019).
  12. Soontararak, S., et al. Mesenchymal stem cells (MSC) derived from induced pluripotent stem cells (iPSC) equivalent to adipose-derived MSC in promoting intestinal healing and microbiome normalization in mouse inflammatory bowel disease model. Stem Cells Translational Medicine. 7 (6), 456-467 (2018).
  13. Di Baldassarre, A., Cimetta, E., Bollini, S., Gaggi, G., Ghinassi, B. Human-induced pluripotent stem cell technology and cardiomyocyte generation: Progress and clinical applications. Cells. 7 (6), 48 (2018).
  14. Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress. Nature Reviews. Drug Discovery. 16 (2), 115-130 (2017).
  15. Levy, O., et al. Shattering barriers toward clinically meaningful MSC therapies. Science Advances. 6 (30), eaba6884 (2020).
  16. Zhao, C., Ikeya, M. Generation and applications of induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells International. 2018, 9601623 (2018).
  17. Path, G., Perakakis, N., Mantzoros, C. S., Seufert, J. Stem cells in the treatment of diabetes mellitus - Focus on mesenchymal stem cells. Metabolism. 90, 1-15 (2019).
  18. Zhou, Y., et al. One-step derivation of functional mesenchymal stem cells from human pluripotent stem cells. Bio-Protocol. 8 (22), e3080 (2018).
  19. Hua, Z., et al. Low-intensity pulsed ultrasound promotes osteogenic potential of iPSC-derived MSCs but fails to simplify the iPSC-EB-MSC differentiation process. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 841778 (2022).
  20. Dupuis, V., Oltra, E. Methods to produce induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells: Mesenchymal stem cells from induced pluripotent stem cells. World Journal of Stem Cells. 13 (8), 1094-1111 (2021).
  21. Zhang, W., et al. Aging stem cells. A Werner syndrome stem cell model unveils heterochromatin alterations as a driver of human aging. Science. 348 (6239), 1160-1163 (2015).
  22. Liu, G. H., et al. Modelling Fanconi anemia pathogenesis and therapeutics using integration-free patient-derived iPSCs. Nature Communications. 5, 4330 (2014).
  23. Kubben, N., et al. Repression of the antioxidant NRF2 pathway in premature aging. Cell. 165 (6), 1361-1374 (2016).
  24. Duan, S., et al. PTEN deficiency reprogrammes human neural stem cells towards a glioblastoma stem cell-like phenotype. Nature Communications. 6, 10068 (2015).
  25. Zhang, J., et al. Exosomes released from human induced pluripotent stem cells-derived MSCs facilitate cutaneous wound healing by promoting collagen synthesis and angiogenesis. Journal of Translational Medicine. 13, 49 (2015).
  26. Hu, G. W., et al. Exosomes secreted by human-induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells attenuate limb ischemia by promoting angiogenesis in mice. Stem Cell Research & Therapy. 6 (1), 10 (2015).
  27. Kang, R., et al. Mesenchymal stem cells derived from human induced pluripotent stem cells retain adequate osteogenicity and chondrogenicity but less adipogenicity. Stem Cell Research & Therapy. 6 (1), 144 (2015).
  28. Wang, L. T., et al. Differentiation of mesenchymal stem cells from human induced pluripotent stem cells results in downregulation of c-Myc and DNA replication pathways with immunomodulation toward CD4 and CD8 cells. Stem Cells. 36 (6), 903-914 (2018).
  29. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  30. Kim, S., Kim, T. M. Generation of mesenchymal stem-like cells for producing extracellular vesicles. World Journal of Stem Cells. 11 (5), 270-280 (2019).

Tags

الخلايا اللحمية المتوسطة ، MSCs ، الطب التجديدي ، الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان ، HiPSCs ، التمايز ، منهجيات الثقافة ، الأجسام الجنينية ، الثقافة أحادية الطبقة ، المزايا ، العيوب ، استهلاك الوقت ، التكلفة ، قدرة تكاثر الخلايا ، علامات MSC ، القدرة على التمايز في المختبر ، MSCs الناضجة
مقارنة بين طريقتين تمثيليتين لتمايز الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة بشريا إلى خلايا لحمية وسيطة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, F., Gao, L., Fu, X., Yan, Q.,… More

Wang, F., Gao, L., Fu, X., Yan, Q., Hu, L., Mao, J. Comparison of Two Representative Methods for Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells into Mesenchymal Stromal Cells. J. Vis. Exp. (200), e65729, doi:10.3791/65729 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter