Comparação de Dois Métodos Representativos para Diferenciação de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas por Humanos em Células Estromais Mesenquimais
Summary
Este protocolo descreve e compara dois métodos representativos para diferenciar hiPSCs em células estromais mesenquimais (CTMs). O método da monocamada é caracterizado por menor custo, operação mais simples e diferenciação osteogênica mais fácil. O método dos corpos embrionários (BEs) é caracterizado por menor consumo de tempo.
Abstract
As células estromais mesenquimais (CTMs) são células-tronco pluripotentes adultas que têm sido amplamente utilizadas na medicina regenerativa. Como as CTMs derivadas de tecidos somáticos são restritas por doação limitada, variações de qualidade e biossegurança, nos últimos 10 anos houve um grande aumento nos esforços para gerar CTMs a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSCs). Esforços passados e recentes na diferenciação de hiPSCs em CTMs têm se centrado em torno de duas metodologias de cultura: (1) a formação de corpos embrionários (BEs) e (2) o uso de cultura de monocamadas. Este protocolo descreve esses dois métodos representativos na derivação de CTM de hiPSCs. Cada método apresenta suas vantagens e desvantagens, incluindo tempo, custo, capacidade de proliferação celular, expressão de marcadores de CTM e sua capacidade de diferenciação in vitro. Esse protocolo demonstra que ambos os métodos podem derivar CTMs maduras e funcionais de hiPSCs. O método monocamada é caracterizado por menor custo, operação mais simples e diferenciação osteogênica mais fácil, enquanto o método EB é caracterizado por menor consumo de tempo.
Introduction
As células estromais mesenquimais (CTMs) são células-tronco pluripotentes adultas derivadas do mesoderma1. As CTMs estão presentes em quase todos os tecidos conjuntivos2. Desde que as CTMs foram descobertas na década de 1970 e isoladas com sucesso da medula óssea em 1987 por Friedenstein et al.3,4,5, uma variedade de tecidos somáticos humanos (incluindo fetais e adultos) tem sido usada para isolar CTMs, como osso, cartilagem, tendão, músculo, tecido adiposo e estroma de suporte hematopoético 1,2,6,7 . As CTMs demonstram alta capacidade proliferativa e plasticidade para se diferenciarem em muitas linhagens celulares somáticas, podendo migrar para tecidos lesados e inflamados 2,8,9. Essas propriedades fazem das CTMs um potencial candidato para a medicina regenerativa10. No entanto, as CTMs derivadas de tecidos somáticos (CTMs-st) são limitadas por doação limitada, capacidade proliferativa celular limitada, variações de qualidade e preocupação com a biossegurança para possível transmissão de patógenos, se houver, a partir dos doadores11,12.
As células-tronco pluripotentes induzidas humanas (hiPSCs) são derivadas da reprogramação de células adultas com fatores de transcrição (Oct4, Sox2, Klf4 e c-Myc), que têm funções semelhantes às células-tronco embrionárias13,14. Elas podem se auto-renovar e possuem o potencial de se diferenciar em qualquer tipo de células somáticas, incluindo as CTMs. Comparadas às CTMs-st, as CTMs-iPSC têm a vantagem de fornecimento ilimitado, menor custo, maior pureza, conveniência no controle de qualidade, facilidade de produção em escala e modificação gênica 15,16,17.
Devido a essas vantagens das CTMs-iPSC, uma variedade de métodos que conduzem as CTM a partir de iPSC têm sido relatadas. Esses métodos de diferenciação têm sido centrados em torno de duas metodologias de cultura: (1) a formação de corpos embrionários (BEs) e (2) o uso de culturas de monocamadas 11,18,19,20. Neste trabalho, caracterizou-se uma abordagem representativa para cada uma das duas metodologias. Além disso, comparações entre duas abordagens representativas baseadas em tempo, custo, capacidade proliferativa, expressão de biomarcadores de CTM e capacidade de diferenciação in vitro também foram acessadas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nesse protocolo, foram examinados dois métodos representativos de diferenciação das hiPSCs em CTMs20,21,22,23,24,25,26,27,28,30. Ambos os métodos foram capazes de derivar CTMs a parti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Somos extremamente gratos a todos os membros do Mao e Hu Lab, do passado e do presente, pelas interessantes discussões e grandes contribuições para o projeto. Somos gratos ao Centro Nacional de Pesquisa Clínica em Saúde Infantil pelo grande apoio. Este estudo foi financiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (U20A20351 para Jianhua Mao, 82200784 para Lidan Hu), a Fundação de Ciências Naturais da Província de Zhejiang da China (No. LQ22C070004 a Lidan Hu).
Materials
| Alizarin red staining kit | Beyotime Biotechnology | C0148S | |
| Anti-human-CD105 (PE) | Biolegend | 323206 | |
| Anti-human-CD34 (FITC) | Biolegend | 343503 | |
| Anti-human-CD45 (APC) | Biolegend | 304011 | |
| Anti-human-CD73( APC) | Biolegend | 344006 | |
| Anti-human-CD90 (FITC) | Biolegend | 328108 | |
| Ascorbic acid | Solarbio | A8100 | |
| BMP-6 | Novoprotein | C012 | |
| Carbon dioxide level shaker | Crystal | CO-06UC6 | |
| Compensation Beads | BioLegend | 424601 | |
| CryoStor CS10 | STEMCELL Technology | 07959 | |
| Dexamethasone | Beyotime Biotechnology | ST1254 | |
| DMEM/F12 medium | Servicebio | G4610 | |
| Fetal bovine serum | HAKATA | HS-FBS-500 | |
| FGF2 | Stemcell | 78003.1 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G2500-100G | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | |
| human IgG1 isotype control APC | BioLegend | 403505 | |
| human IgG1 isotype control FITC | BioLegend | 403507 | |
| human IgG1 isotype control PE | BioLegend | 403503 | |
| Human TGF-β1 | Stemcell | 78067 | |
| Human TruStain FcX | BioLegend | 422301 | |
| IBMX | Beyotime Biotechnology | ST1398 | |
| Indomethacin | Solarbio | SI9020 | |
| Insulin | Beyotime Biotechnology | P3376 | |
| iPSC maintenance medium | STEMCELL Technology | 85850 | |
| ITS Media Supplement | Beyotime Biotechnology | C0341-10mL | |
| Matrigel, growth factor reduced | BD Corning | 354230 | |
| Oli Red O staining kit | Beyotime Biotechnology | C0158S | |
| Proline | Solarbio | P0011 | |
| Sodium pyruvate | ThermoFisher | 11360-070 | |
| TGFβ3 | Novoprotein | CJ44 | |
| Toluidine blue staining kit | Solarbio | G2543 | |
| TrypLE Express Enzyme(1x) | Gibco | 12604013 | |
| Ultra-Low Attachment 6 Well Plate | Costar | 3471 | |
| Versene | Gibco | 15040-66 | |
| Y-27632 | Stemcell | 72304 | |
| α-MEM | Hyclone | SH30265 | |
| β-glycerophosphate | Solarbio | G8100 |
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