Summary
Detta protokoll beskriver och jämför två representativa metoder för att differentiera hiPSCs till mesenkymala stromaceller (MSC). Monolagermetoden kännetecknas av lägre kostnad, enklare drift och enklare osteogen differentiering. Metoden med embryoidkroppar (EB) kännetecknas av lägre tidsåtgång.
Abstract
Mesenkymala stromaceller (MSC) är vuxna pluripotenta stamceller som har använts i stor utsträckning inom regenerativ medicin. Eftersom somatiska vävnadshärledda MSC begränsas av begränsad donation, kvalitetsvariationer och biosäkerhet, har de senaste 10 åren sett en stor ökning av ansträngningarna att generera MSC från humaninducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs). Tidigare och senare ansträngningar för att differentiera hiPSCs till MSC har centrerats kring två odlingsmetoder: (1) bildandet av embryoidkroppar (EB) och (2) användningen av monolayer-odling. Detta protokoll beskriver dessa två representativa metoder för att härleda MSC från hiPSC. Varje metod har sina fördelar och nackdelar, inklusive tid, kostnad, cellproliferationsförmåga, uttrycket av MSC-markörer och deras förmåga till differentiering in vitro. Detta protokoll visar att båda metoderna kan härleda mogna och funktionella MSC:er från hiPSCs. Monolayer-metoden kännetecknas av lägre kostnad, enklare drift och enklare osteogen differentiering, medan EB-metoden kännetecknas av lägre tidsåtgång.
Introduction
Mesenkymala stromaceller (MSC) är pluripotenta stamceller från vuxna som härstammar från mesoderm1. MSC finns i nästan all bindväv2. Sedan MSC först upptäcktes på 1970-talet och framgångsrikt isolerades från benmärg 1987 av Friedenstein et al.3,4,5, har en mängd olika mänskliga somatiska (inklusive foster och vuxna) vävnader använts för att isolera MSC såsom ben, brosk, senor, muskler, fettvävnad och hematopoetiskt stödjande stroma 1,2,6,7 . MSC uppvisar hög proliferativ förmåga och plasticitet att differentiera till många somatiska cellinjer och kan migrera till skadade och inflammerade vävnader 2,8,9. Dessa egenskaper gör MSC till en potentiell kandidat för regenerativ medicin10. Somatiska vävnadsderiverade MSC (st-MSC) begränsas dock av begränsad donation, begränsad cellproliferativ kapacitet, kvalitetsvariationer och biosäkerhetsproblem för eventuell överföring av patogener, om några, från donatorerna11,12.
Humana inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs) härrör från vuxna celler som omprogrammeras med transkriptionsfaktorer (Oct4, Sox2, Klf4 och c-Myc), som har liknande funktioner som embryonala stamceller13,14. De kan förnya sig själva och har potential att differentiera till alla typer av somatiska celler, inklusive MSC. Jämfört med st-MSC har iPSC-MSCs fördelen av obegränsad tillgång, lägre kostnad, högre renhet, bekvämlighet i kvalitetskontroll, lätt för skalproduktion och genmodifiering 15,16,17.
På grund av dessa fördelar med iPSC-MSC har en mängd olika metoder som driver MSC från iPSC rapporterats. Dessa differentieringsmetoder har centrerats kring två odlingsmetoder: (1) bildandet av embryoidkroppar (EB) och (2) användningen av monolagerkulturer 11,18,19,20. Häri karakteriserades ett representativt tillvägagångssätt för var och en av de två metoderna. Dessutom gjordes jämförelser mellan två representativa tillvägagångssätt baserade på tid, kostnad, proliferativ förmåga, uttryck av MSC-biomarkörer och differentieringsförmåga in vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Underhåll av hiPSCs
- Upptining av hiPSC
- Ta ut cellerna från det flytande kvävet och tina snabbt cellerna i ett 37 °C vattenbad. Överför upptiningscellerna till ett 15 ml rör förberett med 3 ml iPSC underhållsmedium (materialförteckning). Blanda mediet försiktigt.
- Centrifugera vid 300 x g i 5 min. Ta bort supernatanten och återsuspendera försiktigt cellerna i 1 ml iPSC underhållsmedium med 10 μM Y-27632 (pipettera cellerna upp och ner 2-3 gånger).
- Överför cellsuspensionen till en 6-håls vävnadsodlingsplatta belagd med tillväxtfaktorreducerad (GFR)-extracellulär matrisgel (1:100) och 2 ml iPSC underhållsmedium med 10 μM Y-27632 tillsatt i förväg (ca 4 x 104 celler/cm2).
- Odla cellerna i 5-6 dagar (80%-90% sammanflöde) vid 37 °C, 5% CO2 med iPSC underhållsmedia byts varje dag.
- Passage av hiPSC
- Ta bort iPSC-underhållsmediet från 6-hålsplattan. Tvätta hiPSC:erna en gång med DPBS.
- Tillsätt 700–800 μL 0,48 mM EDTA-lösning och inkubera i 1 minut vid rumstemperatur (RT), avlägsna sedan uppslutningslösningen. Fortsätt att inkubera vid 37 °C i 3-5 min.
- När cellerna har spjälkats till ark (bryt inte ner cellerna i enstaka celler), tillsätt 1 ml iPSC underhållsmedium med 10 μM Y-27632 för att avsluta uppslutningen. Pipettera försiktigt cellerna upp och ner 2-3 gånger.
- Överför cellsuspensionen till en 6-håls vävnadsodlingsplatta belagd med tillväxtfaktorreducerad (GFR)-extracellulär matrisgel (1:100) och 2 ml iPSC underhållsmedium med 10 μM Y-27632 tillsatt i förväg.
OBS: Passaging-förhållandet sträcker sig från 1:6 till 1:20 (cirka 4 x 104 celler/cm2), och den genomsnittliga aggregeringsstorleken är cirka 50-200 μm. - Odla cellerna tills 80%-90% sammanflöde (5-6 dagar) vid 37 °C, 5% CO2 med iPSC underhållsmedium byts varje dag.
2. MSC-differentiering från hiPSC via EB-bildning
OBS: Metoden är hämtad från tidigare litteratur 21,22,23,24. En översikt över metoden illustreras i figur 1. Metodens egenskaper sammanfattas i tabell 1.
- Beredning av mediet
- Förbered MSC-differentieringsmedium genom att komplettera α-MEM med 1 % (v/v) GlutaMAX, 10 % (v/v) FBS, 10 ng/ml FGF2 och 5 ng/ml TGFβ.
- Förbered MSC-underhållsmedium genom att komplettera α-MEM med 1 % (v/v) GlutMAX, 10 % (v/v) FBS och 1 ng/ml FGF2.
- Beredning av hiPSC
- Odling hiPSCs linjer (passage minst 2-3 gånger efter upptining) i iPSC underhållsmedium på en 6-brunns vävnadsodlingsplatta belagd med tillväxtfaktorreducerad (GFR)-extracellulär matrisgel (1:100) vid 37 °C, 5% CO2 tills 80%-90% sammanflöde.
- Dag 0: EB-bildning
- Ta bort iPSC-underhållsmediet från 6-hålsplattan. Tvätta hiPSC:erna en gång med DPBS.
- Tillsätt 700–800 μl 0,48 mM EDTA-lösning och inkubera i 1 minut vid RT, avlägsna sedan uppslutningslösningen. Fortsätt att inkubera vid 37 °C i 3-5 min.
- När cellerna bryts ner till ark (bryt inte ner cellerna i enstaka celler), tillsätt 2 ml iPSCs underhållsmedium (innehållande 10 μM stenhämmare och 1:100 GFR-extracellulär matrisgel) för att avsluta matsmältningen.
- Överför cellerna till en 6-brunns låg fästplatta. Sådd av cellerna i ett förhållande av 2 brunnar av vävnadsodlingsplatta till 1 brunn av låg fästplatta. Inkubera cellerna i en skakapparat (60 varv/min) vid 37 °C, 5 % CO2 i 24 timmar för att bilda sfäriska EB.
- Dag 1-Dag 7: EB-differentiering
- Överför EB till centrifugröret med en Pasteur-pipett (utan att förstöra EB) och låt EB sedimentera naturligt i 5-10 minuter vid RT. Ta sedan bort supernatanten.
- Överför EB:erna till en 6-håls låg fästplatta med 2 ml MSC-differentieringsmedium. Odla EB i shakern vid 37 °C, 5 % CO2 i 7 dagar med medium förändring en gång.
- Dag 8-Dag 17: EB-inokulering
- Överför EB till centrifugröret med en Pasteur-pipett (utan att förstöra EB) och låt EB sedimentera naturligt i 5-10 minuter. Ta sedan bort supernatanten.
- Överför EB till en GFR-extracellulär matris gelbelagd 6-hålsplatta med 2 ml MSC-underhållsmedium. Odling till 90 % sammanflöde (~10 dagar) med regelbundet mediebyte efter celladhesion.
- Dag 18-Dag 27: MSC:s mognad och expansion
- Behandla den EB-härledda kulturen med en dissociationslösning vid 37 °C i 5-10 minuter (matsmältningstiden varierar beroende på närvaron av olika celltyper).
- När en del av cellerna har spridits till enstaka celler, tillsätt 2 ml MSC-underhållsmedium för att avsluta uppslutningen och överför cellsuspensionen till ett centrifugrör. Tvätta de återstående osmälta cellerna en gång med DPBS och smält igen. Upprepa flera gånger tills alla celler har smälts till enstaka celler. Centrifugera cellsuspensionen vid 250 x g i 5 minuter och avlägsna sedan supernatanten.
- Frö cellerna på en gelatinbelagd odlingsplatta (ca 2 x 105 celler/cm2). Odla till 90 % sammanflöde i MSC underhållsmedium med mediebyte regelbundet. Utse denna generation av celler som passage 0 (P0) vid denna tidpunkt.
- För att göra MSC ren och mogen, fortsätt att passera cellerna två gånger i ett delningsförhållande på 1:3 på cirka 6 dagar. De flesta av cellerna uppvisar fibroblastliknande morfologi (spindelformad).
3. MSC-differentiering från hiPSC via monolayer-odling
OBS: Metoden är hämtad från tidigare litteratur 25,26,27,28. En översikt över denna metod illustreras i figur 1. Metodens egenskaper sammanfattas i tabell 1.
- Beredning av mediet
- Förbered MSC-underhållsmediet genom att komplettera α-MEM med 1 % (v/v) GlutMAX, 10 % (v/v) FBS och 1 ng/ml FGF2.
- Beredning av hiPSC
- Odling hiPSCs linjer (passage minst 2-3 gånger efter upptining) i iPSC underhållsmedium på en 6-brunns vävnadsodlingsplatta belagd med tillväxtfaktorreducerad (GFR)-extracellulär matrisgel (1:100) vid 37 °C, 5% CO2 tills 50%-60% sammanflöde.
- Dag 0-Dag 13: Differentiering genom direkta monolagerkulturer
- Ta bort iPSC-underhållsmediet från 6-hålsplattan.
- Tillsätt direkt 2 ml MSC-underhållsmedium och odla i 14 dagar vid 37 °C, 5 % CO 2 °C, med mediebyte varje dag.
- Dag 14-Dag 35: MSC-mognad genom upprepad passage
- Behandla monolagerkulturerna med en dissociationslösning vid 37 °C i 5-10 minuter (matsmältningstiden varierar beroende på närvaron av olika celltyper).
- När cellerna har spjälkats till enstaka celler, tillsätt 2 ml MSC-underhållsmedium för att avsluta uppslutningen och överför cellsuspensionen till centrifugröret. Tvätta de återstående osmälta cellerna en gång med DPBS och smält igen. Upprepa flera gånger tills alla celler har smälts till enstaka celler. Centrifugera cellsuspensionen vid 250 x g i 5 minuter och avlägsna sedan supernatanten.
- Frö cellerna på en gelatinbelagd odlingsskål (ca 2 x 105 celler/cm2). Odla till 90 % sammanflöde i MSC-underhållsmedium med mediebyte regelbundet. Utse denna generation av celler som passage 0 (P0) vid denna tidpunkt.
- För att göra MSC ren och mogen, fortsätt att passera cellerna 6 gånger med ett delningsförhållande på 1:3 på cirka 18 dagar. De flesta av cellerna uppvisar fibroblastliknande morfologi (spindelformad).
4. Ytantigenanalys av hiPSC-drivande MSC med flödescytometri
OBS: I likhet med ytantigenerna hos MSC från benmärgen, uttrycker hiPSCs-drivande MSC CD105, CD73 och CD90, men uttrycker inte CD45, CD3429. Dessutom kan hiPSCs användas som negativa kontrollceller. Ytantigenanalys av hiPSC-drivande MSC och hiPSCs med flödescytometri visas i figur 2.
- Behandla de hiPSC-drivande MSC:erna med en dissociationslösning vid 37 °C i 2-3 min. Behandla hiPSCs med 0,48 mM EDTA-dissociationsreagens och inkubera i 1 minut vid RT, ta sedan bort dissociationsreagenset. Fortsätt att inkubera vid 37 °C i 3-5 min.
- När cellerna har spjälkats till enstaka celler, tillsätt medium (MSC-underhållsmedium till MSC och iPSC-underhållsmedium till iPSC) för att avsluta matsmältningen.
- Centrifugera cellsuspensionen vid 350 x g i 5 minuter och avlägsna sedan supernatanten.
- Tvätta cellerna en gång med kall DPBS, centrifugera vid 350 x g i 5 minuter och ta sedan bort supernatanten.
- Räkna och återsuspendera cellerna i kall 10 % FBS-DPBS-lösning (v/v) vid 10 x 106 celler/ml och fördela 100 μL/rör cellsuspension (1 x 106 celler/rör) i 1,5 ml centrifugrör.
- Tillsätt 5 μl human Fc-receptorblockerande lösning till 100 μl cellsuspension. Inkubera i 5-10 minuter vid RT för att utföra ospecifik blockering.
- Centrifugera vid 350 x g i 5 minuter och ta bort supernatanten. Tvätta cellerna två gånger med en kall 2% FBS-DPBS (v/v) lösning.
- Återsuspendera cellerna i kall 100 μl 2% FBS-DPBS-lösning (v/v).
- Tillsätt 5 μl (1 test) anti-CD34-FITC och 5 μl (1 test) anti-CD45-APC till 100 μL-cellen
Upphängning. Tillsätt 5 μl (1 test) anti-CD73-APC, 5 μl (1 test) anti-CD90-FITC och 5 μL (1 test) anti-CD105-PE till ytterligare ett 100 μL cellsuspensionsrör. Tillsätt 5 μl humant IgG1 isotypkontroll-FITC, humant IgG1-isotypkontroll-PE och humant IgG1-isotypkontroll-APC till det tredje 100-literscellsuspensionsröret. Inkubera i 15-20 min på is i mörker. Under tiden förbereder du enstaka färgande pärlor. - Tvätta cellerna två gånger med en kall 2% FBS-DPBS (v/v) lösning.
- Tillsätt 300 μL kall 2% FBS-DPBS-lösning (v/v) för att återsuspendera cellerna och filtrera via 200 mesh-filter.
- Analysera proverna med hjälp av flödescytometri. Analysera cellsuspensionen färgad med isotypkontrollantikroppar och ställ in grinden. Analysera sedan cellsuspensionen färgad med målantikroppar.
5. Osteogen differentiering av hiPSC-drivande MSC:er
OBS: De hiPSC-drivande MSC:erna har osteogen differentieringspotential (Figur 3A, B). Protokollet för osteogen differentiering ges nedan.
- Förbered osteogent induktionsmedium genom att komplettera α-MEM med 10 % FBS, 100 nM dexametason, 10 mM beta-glykofosfat och 100 μM askorbinsyra.
- Frö 1 x 105 MSC i en gelatinbelagd 48-hålsplatta och odla tills den är 60%-70% sammanflytande.
- Ta bort mediet och tillsätt 0,3 ml osteogent induktionsmedium. Odla cellerna i ett osteogent induktionsmedium i 14 dagar vid 37 °C, 5 % CO2, med mediebyte var 3:e dag.
- Ta bort mediet och tvätta med DPBS en gång.
- Tillsätt 0,3 ml 4 % PFA och inkubera vid RT i 30 minuter.
- Ta bort PFA. Skölj cellerna med 0,3 ml DPBS i 10 minuter vid RT och upprepa 3 gånger.
- Ta bort DPBS, tillsätt 0.2 ml Alizarin röd färgningslösning och inkubera i 30 minuter vid RT.
- Ta bort färgningslösningen, skölj cellerna med 0.3 ml DPBS i 10 minuter vid RT och upprepa 3 gånger.
- Observera färgningen av kalciumavsättning under ett ljusmikroskop.
6. Adipogen differentiering av hiPSC-drivande MSC:er
OBS: De hiPSC-drivande MSC:erna har adipogen differentieringspotential (Figur 3C, D). Protokollet för adipogen differentiering ges nedan.
- Preparare adipogent induktionsmedium genom att komplettera α-MEM med 10 % FBS, 1 μM dexametason, 1 μM IBMX, 10 μg/ml insulin och 100 μM indometacin. Förbered adipogent underhållsmedium genom att komplettera α-MEM med 10 % FBS och 10 μg/ml insulin.
- Frö 1 x 105 MSC i en gelatinbelagd 48-hålsplatta och odla tills celldensiteten når 90 %.
- Ta bort mediet och tillsätt 0,3 ml adipogent induktionsmedium. Fortsätt att odla cellerna i det adipogena induktionsmediet i 4 dagar vid 37 °C, 5 % CO2 %.
- Ta bort mediet och tillsätt 0,3 ml adipogent underhållsmedium. Fortsätt att odla cellerna i det adipogena underhållsmediet i 3 dagar vid 37 °C, 5 % CO2 .
- Upprepa steg 6.3 och 6.4 2-3 gånger tills adipocytdifferentiering och mognad.
- Ta bort mediet och tvätta med DPBS en gång.
- Tillsätt 0,3 ml 4 % PFA och inkubera vid RT i 10 min. Ta bort PFA och skölj 2 gånger med DPBS.
- Applicera Oli Red O-fläck enligt tillverkarens instruktioner och observera lipiddropparna under ett ljusmikroskop.
7. Kondrogen differentiering av hiPSC-drivande MSC:er
OBS: De hiPSC-drivande MSC:erna har kondrogen differentieringspotential (Figur 3E, F). Protokollet för kondrogen differentiering ges nedan.
- Bered kondroblastinduktionsmedium genom att komplettera α-MEM med 10 % FBS, 100 nM dexametason, 1 % insulintransferrinselen (ITS), 10 μM askorbinsyra, 1 mM natriumpyruvat, 50 μg/ml prolin, 0,02 nM transformerande tillväxtfaktor β3 (TGFβ3) och 0,5 μg/ml benmorfogenetiskt protein 6 (BMP-6).
- Samla 2,5 x 105 hiPSC-drivande MSC:er och centrifugera cellerna vid 150 x g i 5 minuter, ta sedan bort supernatanten. Suspendera cellerna i 1 ml α-MEM och centrifugera sedan vid 150 x g i 5 minuter.
- Ta bort supernatanten och suspendera cellerna i 0,5 ml kondrogen induktionsmedium. Centrifugera cellerna vid 150 x g i 5 minuter.
- Skruva av locket direkt och odla i 21 dagar med kondrogen induktionsmedia byt var 3:e dag vid 37 °C, 5 % CO2 . Snärta försiktigt på centrifugröret för att suspendera de kondrogena pelletsen (utan att förstöra kondrogena pellets) varje dag under kondrogen differentiering.
- Ta bort supernatanten och tvätta med 0,5 ml PBS två gånger.
- Tillsätt 0,3 ml 4 % PFA och fixera i 24 timmar.
- Paraffin bäddar in de kondrogena pelletsen och delar dem sedan (3 μm). Färga sektionerna i toluidinblått (1%) i 30 min.
- Observera den extracellulära kondrocytmatrisen under ett ljusmikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I enlighet med protokollet (figur 1A) differentierades hiPSC till MSC via EB-bildnings- och monolagerodlingsmetoderna. Under differentieringen uppvisade cellerna olika representativa morfologier (Figur 1B,C).
Som visas i figur 1B uppvisar hiPSCs-kolonierna typisk kompakt morfologi före differentiering med en tydlig kant bestående av tätt packade celler. Enhetliga sfäriska EB bildas efter hiPSCs dissociering och odling i 24 timmar på shakern. Under dag 1 till dag 7 av odling i MSCs differentieringsmedium blev den släta kanten av EB grov och volymen av EB växte sig stor. Från dag 8 till dag 17, efter att ha överfört EB till en GFR-extracellulär matrisgelbelagd 6-brunnsplatta, vidhäftade EB gradvis till plattan och många vidhäftande monolagerceller spred sig runt EB. När cellerna nådde 90 % sammanflöde på dag 18 röts cellerna ner och såddes på en gelatinbelagd odlingsplatta. På dag 19 fastnade cellen och visade en polygonal form. I följd passerade cellerna två gånger när de var 90 % konfluenta. De härledda MSC:erna mognade gradvis och uppvisade en typisk spindelform, och kolonin växte i en virvel.
Som visas i figur 1C ökade cellernas volym och spred sig runt kolonin efter att iPSC-underhållsmediet ersatts med MSC-underhållsmediet i 24 timmar. Medan cellerna odlades i ett MSC-underhållsmedium förökade de sig gradvis och bildade flerskiktsvidhäftande celler. På dag 14 rötades cellerna ner och såddes på en gelatinbelagd odlingsplatta. På dag 15 fastnade cellen och visade en polygonal form. I följd passerade cellerna 6 gånger när de var 90% konfluenta. De härledda MSC:erna mognade gradvis och uppvisade en typisk spindelform, och kolonin växte i en virvel.
Ytantigenerna för hiPSCs och hiPSC-drivande MSCs analyserades med flödescytometri (Figur 2). Som visas i figur 2C var hiPSCs positiva för CD90 och negativa för CD34, CD45, CD73 och CD105. Efter att ha differentierat hiPSCs till MSCs via båda metoderna, var drivande MSCs positiva för CD90, CD73 och CD105, och negativa för CD34 och CD45 (Figur 2A,B).
Differentieringsförmågan hos hiPSC-drivande MSC:er undersöktes genom osteogen, adipogen och kondrogen differentiering. Som visas i figur 3 differentierades båda hiPSC-drivande MSC:erna för de två metoderna i osteoblast, adipocyt och kondrocyt. De hiPSC-drivande MSC:erna i monolagermetoden bildade mer kalciumavlagringar än EB-metoden (Figur 3B). De två metoderna hade ingen signifikant skillnad i adipogen differentiering och kondrogen differentieringsförmåga (Figur 3D,F).
Spridningsförmågan hos hiPSC-körande MSC:er undersöktes genom kontinuerlig passagekultur. Som visas i figur 3G kan de hiPSC-drivande MSC:erna för båda metoderna passeras för mer än 20 passager och ändå bibehålla en snabb spridningsförmåga.
Jämförelsen mellan de två tillvägagångssätten som visas i tabell 1 baseras på differentieringstid, kostnad, cellproliferationsförmåga, MSC-markörers uttryck och deras differentieringsförmåga in vitro.
Figur 1: Differentiering av hiPSCs till MSC via EB-bildningsmetod och monolayerodlingsmetod. (A) Schematisk som visar differentieringen av hiPSCs till MSC via EB-bildning och monolayer-odling. Representationsmorfologi av celler vid nyckelfager under MSC-härledning från hiPSCs via (B) EB-bildning och (C) monolagerodling. Skalstaplar: 300 μm och 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: hiPSC-drivande MSC-ytantigenanalys med flödescytometri. Uttrycksprocent av MSC-ytantigener i iPSC-drivande MSC:er via (A) EB-bildning och (B) monolagerodling. C) HiPSC användes som negativ kontroll. MSCs negativa markörer: CD34, CD45; MSCs positiva markörer: CD73, CD90 och CD105. hiPSCs negativa markörer: CD34, CD45, CD73 och CD105; hiPSCs positiva markörer: CD90. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Trelinjedifferentiering och spridningsförmåga hos hiPSC-drivande MSC:er. (A) Alizarinröd färgning av kalciumavlagringar av hiPSC-drivande MSC i osteogent differentieringsmedium i 2 veckor. Skalstreck: 300 μm. (B) Kvantifiering av Alizarinröd S-färgning genom ImageJ-analys. (C) Oli röd O-färgning av lipiddroppar av hiPSC-drivande MSC i adipogent differentieringsmedium i 2 veckor. Skalstreck: 300 μm. (D) Kvantifiering av Oli Red O-färgning med ImageJ-analys. (E) Toluidinblå färgning av extracellulär kondrocytmatris. Skalstreck: 300 μm och 150 μm. (F) Kvantifiering av toluidinblåfärgning med ImageJ-analys. (G) Beräkning av fördubblingstid för MSC-populationen med hiPSC-körning. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Jämförelse | EB-bildningsmetod | Metod för monolagerkulturer |
| Differentieringstid | 27 dagar | 35 dagar |
| Kostnad | Hög | Låg |
| Spridningshastighet | Snabb | Snabb |
| Spridningsförmåga | ≥20 passage | ≥20 passage |
| Uttryck av MSC-markörer | CD73 / CD90 / CD105 positiv, CD34 / CD45 nagativ | CD73 / CD90 / CD105 positiv, CD34 / CD45 nagativ |
| Förmåga till differentiering | Adipogen differentiering, kondrogen differentiering och osteogen differentieringsförmåga | Adipogen differentiering, kondrogen differentiering och starkare osteogen differentieringsförmåga |
| Operation | Invecklad | Enkel |
Tabell 1: Egenskaper hos de två metoderna för att differentiera hiPSC till MSC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I detta protokoll undersöktes två representativa metoder för att differentiera hiPSC till MSC 20,21,22,23,24,25,26,27,28,30. Båda metoderna var kapabla att härleda MSC från hiPSCs. De hiPSC-härledda MSC:erna bekräftades av cellmorfologi (Figur 1), ytantigener (Figur 2) och deras förmåga att differentiera (Figur 3).
Båda metoderna delade samma MSC-underhållsmedium, medan EB-metoden också behövde ett MSC-differentieringsmedium med TGF-β och FGF2. Dessutom krävde EB-metoden låg infästning av 6 brunnsplattor och en speciell shaker som kan placeras i en koldioxidinkubator. Därför var kostnaden för EB-metoden högre än för monolayer-metoden18,20. EB-metoden verkade vara mer komplicerad än monolayer-metoden. Differentieringstiden för EB-metoden var dock kortare, vilket gjorde att man undvek flera passager för att berika MSC.
Vi fann att toleransen mot omgivningsförhållanden för EB-metoden var starkare än för monolayer-metoden. Båda metoderna påverkades av iPSC-status, mänsklig inblandning och kulturmiljö 11,20. Vi fann dock att framgångskvoten för EB-metoden var mycket högre än för monolagermetoden. Det viktigaste steget i EB-metoden var EB-differentieringssteget från dag 1 till dag 7. Under dag 1-7, om EB gradvis blir mindre eller trasigt med många flytande döda celler i odlingsmediet eller bildar vakuolat-EB, har dessa okvalificerade EB svårt att fästa vid gelatinplattan och få, om några, vidhäftande celler kryper ut ur EB. Från dag 1 till dag 7 var kvalificerade EB enhetliga och skulle vara något förstorade, släta kanter som gradvis blir grova med celler som sticker ut. Efter att ha överförts till gelatinplattan vidhäftade EB snabbt till plattan, och många vidhäftande monolagerceller spred sig runt EB. Om EB är kvalificerade under dag 1-7 är det lätt att uppnå efterföljande differentiering. Monolayer-metoden kan däremot misslyckas när som helst. Från dag 1 till dag 14 kan vidhäftande celler falla av fläckvis, vilket tyder på att differentieringen inte fungerar. Normalt förökar sig vidhäftande celler och bildar vidhäftande celler i flera lager. Efter dag 14 skulle monolagermetoden fortfarande misslyckas eftersom få celler är fästa vid skålen. Under dag 0-13 av monolagermetoden observerade vi olika cellmorfologier i skålen. EB-metodens cellmorfologi var dock homogen dag 8-17. Jämfört med monolagermetoden misstänker vi att EB-metoden är mer lik den embryonala utvecklingsprocessen och är en mer kontrollerbar programmerad differentieringsmetod.
Båda metoderna kan användas för mer än 20 passager och ändå bibehålla en snabb spridningsförmåga11. Kalciumavlagringarna för osteogen differentiering i monolagermetoden var större än de för EB-metoden. Stamcellsspecifikt serum måste användas för att undvika att cytokiner i serumet påverkar differentieringen. Vi observerade att cellerna slutade föröka sig om celltätheten var för låg. Så, efter att ha nått sammanflöde, måste cellerna passera med ett delningsförhållande på 1:3. Ingen antibiotika användes under differentieringen; därför är strikt iakttagande av god laboratoriesed (GLP) obligatoriskt för denna experimentella uppställning.
Sammanfattningsvis fanns det fördelar och nackdelar för varje metod som testades i detta protokoll. Båda metoderna kan generera MSC från hiPSCs, valet baseras på användarens krav.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi är oerhört tacksamma mot alla medlemmar i Mao och Hu Lab, tidigare och nuvarande, för de intressanta diskussionerna och de stora bidragen till projektet. Vi är tacksamma mot National Clinical Research Center for Child Health för det stora stödet. Denna studie finansierades ekonomiskt av National Natural Science Foundation of China (U20A20351 till Jianhua Mao, 82200784 till Lidan Hu), Natural Science Foundation of Zhejiang Province of China (nr. LQ22C070004 till Lidan Hu).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alizarin red staining kit | Beyotime Biotechnology | C0148S | |
| Anti-human-CD105 (PE) | Biolegend | 323206 | |
| Anti-human-CD34 (FITC) | Biolegend | 343503 | |
| Anti-human-CD45 (APC) | Biolegend | 304011 | |
| Anti-human-CD73( APC) | Biolegend | 344006 | |
| Anti-human-CD90 (FITC) | Biolegend | 328108 | |
| Ascorbic acid | Solarbio | A8100 | |
| BMP-6 | Novoprotein | C012 | |
| Carbon dioxide level shaker | Crystal | CO-06UC6 | |
| Compensation Beads | BioLegend | 424601 | |
| CryoStor CS10 | STEMCELL Technology | 07959 | |
| Dexamethasone | Beyotime Biotechnology | ST1254 | |
| DMEM/F12 medium | Servicebio | G4610 | |
| Fetal bovine serum | HAKATA | HS-FBS-500 | |
| FGF2 | Stemcell | 78003.1 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G2500-100G | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | |
| human IgG1 isotype control APC | BioLegend | 403505 | |
| human IgG1 isotype control FITC | BioLegend | 403507 | |
| human IgG1 isotype control PE | BioLegend | 403503 | |
| Human TGF-β1 | Stemcell | 78067 | |
| Human TruStain FcX | BioLegend | 422301 | |
| IBMX | Beyotime Biotechnology | ST1398 | |
| Indomethacin | Solarbio | SI9020 | |
| Insulin | Beyotime Biotechnology | P3376 | |
| iPSC maintenance medium | STEMCELL Technology | 85850 | |
| ITS Media Supplement | Beyotime Biotechnology | C0341-10mL | |
| Matrigel, growth factor reduced | BD Corning | 354230 | |
| Oli Red O staining kit | Beyotime Biotechnology | C0158S | |
| Proline | Solarbio | P0011 | |
| Sodium pyruvate | ThermoFisher | 11360-070 | |
| TGFβ3 | Novoprotein | CJ44 | |
| Toluidine blue staining kit | Solarbio | G2543 | |
| TrypLE Express Enzyme(1x) | Gibco | 12604013 | |
| Ultra-Low Attachment 6 Well Plate | Costar | 3471 | |
| Versene | Gibco | 15040-66 | |
| Y-27632 | Stemcell | 72304 | |
| α-MEM | Hyclone | SH30265 | |
| β-glycerophosphate | Solarbio | G8100 |
References
- Weng, Z., et al. Mesenchymal stem/stromal cell senescence: Hallmarks, mechanisms, and combating strategies. Stem Cells Translational Medicine. 11 (4), 356-371 (2022).
- Soliman, H., et al. Multipotent stromal cells: One name, multiple identities. Cell Stem Cell. 28 (10), 1690-1707 (2021).
- Friedenstein, A. J., Chailakhyan, R. K., Gerasimov, U. V. Bone marrow osteogenic stem cells: in vitro cultivation and transplantation in diffusion chambers. Cell and Tissue Kinetics. 20 (3), 263-272 (1987).
- Friedenstein, A. J., et al. Precursors for fibroblasts in different populations of hematopoietic cells as detected by the in vitro colony assay method. Experimental Hematology. 2 (2), 83-92 (1974).
- Friedenstein, A. J., Gorskaja, J. F., Kulagina, N. N. Fibroblast precursors in normal and irradiated mouse hematopoietic organs. Experimental Hematology. 4 (5), 267-274 (1976).
- El Agha, E., et al. Mesenchymal stem cells in fibrotic disease. Cell Stem Cell. 21 (2), 166-177 (2017).
- Mushahary, D., Spittler, A., Kasper, C., Weber, V., Charwat, V. Isolation, cultivation, and characterization of human mesenchymal stem cells. Cytometry A. 93 (1), 19-31 (2018).
- Ullah, M., Liu, D. D., Thakor, A. S. Mesenchymal stromal cell homing: Mechanisms and strategies for improvement. iScience. 15, 421-438 (2019).
- Regmi, S., et al. Enhanced viability and function of mesenchymal stromal cell spheroids is mediated via autophagy induction. Autophagy. 17 (10), 2991-3010 (2021).
- Hoang, D. M., et al. Stem cell-based therapy for human diseases. Signal Transduction and Targeted Therapy. 7 (1), 272 (2022).
- Jiang, B., et al. Concise review: Mesenchymal stem cells derived from human pluripotent cells, an unlimited and quality-controllable source for therapeutic applications. Stem Cells. 37 (5), 572-581 (2019).
- Soontararak, S., et al. Mesenchymal stem cells (MSC) derived from induced pluripotent stem cells (iPSC) equivalent to adipose-derived MSC in promoting intestinal healing and microbiome normalization in mouse inflammatory bowel disease model. Stem Cells Translational Medicine. 7 (6), 456-467 (2018).
- Di Baldassarre, A., Cimetta, E., Bollini, S., Gaggi, G., Ghinassi, B. Human-induced pluripotent stem cell technology and cardiomyocyte generation: Progress and clinical applications. Cells. 7 (6), 48 (2018).
- Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress. Nature Reviews. Drug Discovery. 16 (2), 115-130 (2017).
- Levy, O., et al. Shattering barriers toward clinically meaningful MSC therapies. Science Advances. 6 (30), eaba6884 (2020).
- Zhao, C., Ikeya, M. Generation and applications of induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells International. 2018, 9601623 (2018).
- Path, G., Perakakis, N., Mantzoros, C. S., Seufert, J. Stem cells in the treatment of diabetes mellitus - Focus on mesenchymal stem cells. Metabolism. 90, 1-15 (2019).
- Zhou, Y., et al. One-step derivation of functional mesenchymal stem cells from human pluripotent stem cells. Bio-Protocol. 8 (22), e3080 (2018).
- Hua, Z., et al. Low-intensity pulsed ultrasound promotes osteogenic potential of iPSC-derived MSCs but fails to simplify the iPSC-EB-MSC differentiation process. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 841778 (2022).
- Dupuis, V., Oltra, E. Methods to produce induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells: Mesenchymal stem cells from induced pluripotent stem cells. World Journal of Stem Cells. 13 (8), 1094-1111 (2021).
- Zhang, W., et al. Aging stem cells. A Werner syndrome stem cell model unveils heterochromatin alterations as a driver of human aging. Science. 348 (6239), 1160-1163 (2015).
- Liu, G. H., et al. Modelling Fanconi anemia pathogenesis and therapeutics using integration-free patient-derived iPSCs. Nature Communications. 5, 4330 (2014).
- Kubben, N., et al. Repression of the antioxidant NRF2 pathway in premature aging. Cell. 165 (6), 1361-1374 (2016).
- Duan, S., et al. PTEN deficiency reprogrammes human neural stem cells towards a glioblastoma stem cell-like phenotype. Nature Communications. 6, 10068 (2015).
- Zhang, J., et al. Exosomes released from human induced pluripotent stem cells-derived MSCs facilitate cutaneous wound healing by promoting collagen synthesis and angiogenesis. Journal of Translational Medicine. 13, 49 (2015).
- Hu, G. W., et al. Exosomes secreted by human-induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells attenuate limb ischemia by promoting angiogenesis in mice. Stem Cell Research & Therapy. 6 (1), 10 (2015).
- Kang, R., et al. Mesenchymal stem cells derived from human induced pluripotent stem cells retain adequate osteogenicity and chondrogenicity but less adipogenicity. Stem Cell Research & Therapy. 6 (1), 144 (2015).
- Wang, L. T., et al. Differentiation of mesenchymal stem cells from human induced pluripotent stem cells results in downregulation of c-Myc and DNA replication pathways with immunomodulation toward CD4 and CD8 cells. Stem Cells. 36 (6), 903-914 (2018).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Kim, S., Kim, T. M. Generation of mesenchymal stem-like cells for producing extracellular vesicles. World Journal of Stem Cells. 11 (5), 270-280 (2019).
