Summary
このプロトコルでは、ヒトiPS細胞を間葉系間質細胞(MSC)に分化させるための2つの代表的な方法を説明し、比較します。単層法は、低コスト、操作の簡便さ、骨形成の分化の容易さを特徴としています。胚様体(EB)法は、時間消費が少ないという特徴があります。
Abstract
間葉系間質細胞(MSC)は、再生医療で広く利用されている成体多能性幹細胞です。体細胞組織由来のMSCは、提供が限られていること、品質のばらつきがあること、バイオセーフティーによって制限されているため、過去10年間で、ヒト人工多能性幹細胞(iPS細胞)からMSCを作製する取り組みが大幅に増加しています。ヒトiPS細胞を間幹細胞に分化させるためのこれまでの取り組みは、(1)胚様体(EB)の形成と(2)単層培養の2つの培養方法が中心でした。このプロトコルでは、iPS細胞からMSCを誘導する際のこれら2つの代表的な方法について説明します。それぞれの方法には、時間、コスト、細胞増殖能、MSCマーカーの発現、 in vitroでの分化能力など、長所と短所があります。このプロトコルは、どちらの方法もiPS細胞から成熟した機能的なMSCを導き出すことができることを示しています。単層法は低コスト、操作の簡便さ、骨形成の分化の容易さを特徴とし、EB法は時間消費が少ないという特徴があります。
Introduction
間葉系間質細胞(MSC)は、中胚葉由来の成体多能性幹細胞です1。MSCは、ほとんどすべての結合組織に存在します2。MSCが1970年代に初めて発見され、1987年にFriedensteinらによって骨髄からの単離に成功して以来3,4,5、骨、軟骨、腱、筋肉、脂肪組織、造血支持間質などのさまざまなヒト体細胞組織(胎児および成人を含む)がMSCの単離に使用されてきました1,2,6,7.MSCは、多くの体細胞系統に分化するための高い増殖能力と可塑性を示し、損傷組織や炎症組織に移動する可能性があります2,8,9。これらの特性により、MSCは再生医療の候補となる可能性があります10。しかし、体細胞組織由来MSC(st-MSC)は、提供が限られていること、細胞増殖能力が限られていること、品質のばらつき、およびドナーからの病原体の伝播の可能性に対するバイオセーフティー上の懸念によって制限されている11,12。
ヒト人工多能性幹細胞(iPS細胞)は、胚性幹細胞と同様の機能を持つ転写因子(Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc)でリプログラミングした成体細胞に由来します13,14。iPS細胞は、ST-MSCと比較して、供給量が無制限で、低コスト、高純度、品質管理の利便性、スケール生産や遺伝子改変が容易であるという利点があります15,16,17。
iPS細胞-MSCのこれらの利点により、iPS細胞からMSCを駆動する方法がいろいろと報告されています。これらの分化法は、(1)胚様体(EB)の形成と(2)単層培養の使用という2つの培養方法論を中心としています11,18,19,20。本明細書では、2つの方法論のそれぞれに対する代表的なアプローチを特徴づけた。さらに、時間、コスト、増殖能、MSCバイオマーカーの発現、およびin vitroでの分化能力に基づく2つの代表的なアプローチの比較もアクセスしました。
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Protocol
1. iPS細胞のメンテナンス
- iPS細胞の解凍
- 液体窒素から細胞を取り出し、37°Cのウォーターバスで細胞を速やかに融解します。融解細胞を、3 mLのiPS細胞維持培地(材料表)で調製した15 mLのチューブに移します。培地を静かに混ぜます。
- 300 x g で5分間遠心分離します。上清を取り除き、10 μM Y-27632を含む1 mLのiPS細胞維持培地に細胞を静かに再懸濁します(細胞を上下に2〜3回ピペットで移動させます)。
- 成長因子低減(GFR)細胞外マトリックスゲル(1:100)でコーティングした6ウェル組織培養プレートに細胞懸濁液を移し、10 μM Y-27632をあらかじめ添加したiPS細胞維持培地2 mL(約4 x 104 cells/cm2)に細胞懸濁液を移します。
- 細胞を37°C、5%CO2 で5〜6日間(80%〜90%コンフルエント)培養し、iPS細胞維持培地を毎日交換します。
- ヒトiPS細胞の通過
- iPS細胞維持培地を6ウェルプレートから取り出します。iPS細胞をDPBSで一度洗浄します。
- 700〜800μLの0.48 mM EDTA溶液を加え、室温(RT)で1分間インキュベートした後、分解溶液を除去します。37°Cの温度で3〜5分間インキュベートし続けます。
- 細胞がシート状に消化されたら(細胞を単一細胞に消化しない)、10 μM Y-27632を含むiPS細胞維持培地1 mLを加えて消化を終了します。細胞を慎重に上下に2〜3回ピペットで移動させます。
- 細胞懸濁液を、成長因子低減(GFR)細胞外マトリックスゲル(1:100)と10 μM Y-27632をあらかじめ添加したiPS細胞維持培地2 mLでコーティングした6ウェル組織培養プレートに移します。
注:継代比は1:6〜1:20(約4×104 細胞/cm2)の範囲で、平均凝集サイズは約50〜200μmである。 - 37°Cで80%〜90%のコンフルエント(5〜6日)まで細胞を培養し、iPS細胞の維持培地を毎日 交換します。
2. EB形成による間葉系幹細胞とiPS細胞の分化
注:この方法は、以前の文献21、22、23、24から導出されたものである。この方法の概要を 図1に示します。この方法の特徴を 表1にまとめた。
- 培地の調製
- α-MEMに1%(v/v)のGlutaMAX、10%(v/v)のFBS、10 ng/mLのFGF2、および5 ng/mLのTGFβを添加して、MSC分化培地を調製します。
- α-MEMに1%(v/v)のGlutMAX、10%(v/v)のFBS、および1 ng/mLのFGF2を添加して、MSC維持培地を調製します。
- iPS細胞の作製
- 成長因子還元(GFR)細胞外マトリックスゲル(1:100)でコーティングした6ウェル組織培養プレート上のiPS細胞維持培地中で、37°C、5%CO2 で80%〜90%のコンフルエントになるまで培養hiPS細胞ライン(融解後少なくとも2〜3回継代)。
- 0日目:EB形成
- iPS細胞維持培地を6ウェルプレートから取り出します。iPS細胞をDPBSで一度洗浄します。
- 700〜800 μLの0.48 mM EDTA溶液を加え、室温で1分間インキュベートした後、消化溶液を除去します。37°Cの温度で3〜5分間インキュベートし続けます。
- 細胞がシート状に消化されたら(細胞を単一細胞に消化しないでください)、iPS細胞維持培地(10 μMのRock阻害剤と1:100のGFR-細胞外マトリックスゲルを含む)2 mLを添加して消化を終了します。
- 細胞を6ウェル低接着プレートに移します。組織培養プレートの2ウェルと低接着プレートのウェル1ウェルの比率で細胞を播種します。細胞をシェーカー(60 rpm/min)で37°C、5% CO2 で24時間インキュベートし、球状のEBを形成します。
- 1日目-7日目:EBの分化
- EBをパスツールピペットで遠心分離管に移し(EBを破壊せずに)、室温でEBを5〜10分間自然に沈殿させます。次に、上澄み液を取り除きます。
- EB を 2 mL の MSC 分化培地を含む 6 ウェル低アタッチメントプレートに移します。EBをシェーカーで37°C、5%CO2 で7日間培養し、培地を1回交換します。
- 8日目-17日目:EB接種
- EBをパスツールピペットで遠心チューブに移し(EBを破壊せずに)、EBを5〜10分間自然に沈殿させます。次に、上澄み液を取り除きます。
- EBを、2 mLのMSC維持培地を含むGFR細胞外マトリックスゲルコーティングされた6ウェルプレートに移します。細胞接着後、定期的な培地交換で90%のコンフルエント(~10日)まで培養します。
- 18日目-27日目:MSCの成熟と拡大
- EB由来の培養物を37°Cの解離溶液で5〜10分間処理します(消化時間は細胞の種類によって異なります)。
- 細胞の一部が単一細胞に消化されたら、MSC維持培地2 mLを添加して消化を終了させ、細胞懸濁液を遠心分離チューブに移します。残った未消化細胞をDPBSで一旦洗浄し、再度消化します。すべての細胞が単一の細胞に消化されるまで、数回繰り返します。細胞懸濁液を250 x g で5分間遠心分離し、上清を除去します。
- ゼラチンでコーティングした培養プレート(約2×105 細胞/cm2)に細胞を播種します。培地を定期的に交換するMSC維持培地で90%のコンフルエントになるまで培養します。この時点で、この世代のセルを継代0(P0)として指定します。
- MSCを純粋で成熟させるために、約6日間で1:3の分割比で細胞を2回継代し続けます。ほとんどの細胞は線維芽細胞様の形態(紡錘形)を示します。
3. 単層培養による間葉系幹細胞とiPS細胞の分化
注:この方法は、以前の文献25、26、27、28から導出されたものである。この方法の概要を 図1に示します。この方法の特徴を 表1にまとめた。
- 培地の調製
- α-MEMに1%(v/v)のGlutMAX、10%(v/v)のFBS、および1 ng/mLのFGF2を添加して、MSC維持培地を調製します。
- iPS細胞の作製
- 成長因子還元(GFR)細胞外マトリックスゲル(1:100)でコーティングした6ウェル組織培養プレート上のiPS細胞維持培地中で、50%〜60%のコンフルエントになるまで50%〜60%の濃度になるまで培養 hiPS細胞ライン(融解後少なくとも2〜3回継代)。
- 0日目-13日目:直接単層培養による分化
- iPS細胞維持培地を6ウェルプレートから取り出します。
- MSC維持培地2 mLを直接添加し、培地を毎日交換しながら、37°C、5%CO2 で14日間培養します。
- 14日目-35日目:反復継代によるMSCの成熟
- 単層培養物を37°Cの解離溶液で5〜10分間処理します(消化時間は細胞の種類によって異なります)。
- 細胞が単一細胞に消化されたら、2 mLのMSC維持培地を添加して消化を終了させ、細胞懸濁液を遠心分離チューブに移します。残った未消化細胞をDPBSで一旦洗浄し、再度消化します。すべての細胞が単一の細胞に消化されるまで、数回繰り返します。細胞懸濁液を250 x g で5分間遠心分離し、上清を除去します。
- ゼラチンでコーティングした培養皿(約2 x 105 cells/cm2)に細胞を播種します。培地とMSC維持培地で90%のコンフルエントになるまで培養し、定期的に交換します。この時点で、この世代のセルを継代0(P0)として指定します。
- MSCを純粋で成熟させるために、約18日間に1:3の分割比で細胞を6回継代し続けます。ほとんどの細胞は線維芽細胞様の形態(紡錘形)を示します。
4. フローサイトメトリーによるヒト-PS細胞増殖幹細胞の表面抗原解析
注:骨髄由来MSCの表面抗原と同様に、iPS細胞を駆動するMSCはCD105、CD73、CD90を発現するが、CD45、CD34は発現しない29。また、ヒトiPS細胞はネガティブコントロール細胞としても利用することができます。フローサイトメトリーによるヒトiPS細胞駆動型幹細胞およびiPS細胞の表面抗原解析を 図2に示します。
- iPS細胞駆動型MSCを解離液で37°Cで2〜3分間処理します。ヒトiPS細胞を0.48 mM EDTA解離試薬で処理し、室温で1分間インキュベートした後、解離試薬を除去します。37°Cの温度で3〜5分間インキュベートし続けます。
- 細胞が単一細胞に消化されたら、培地(MSCにはMSC維持培地、iPS細胞にはiPS細胞維持培地)を加えて消化を終了します。
- 細胞懸濁液を350 x g で5分間遠心分離し、上清を除去します。
- 細胞を冷たいDPBSで一度洗浄し、350 x g で5分間遠心分離した後、上清を除去します。
- 細胞をカウントし、10 x 106 cells/mL の冷たい 10% FBS-DPBS (v/v) 溶液に再懸濁し、100 μL/チューブの細胞懸濁液 (1 x 106 cells/tube) を 1.5 mL 遠心チューブに分配します。
- 100 μLの細胞懸濁液に5 μLのヒトFc受容体遮断溶液を加えます。室温で5〜10分間インキュベートして、非特異的ブロッキングを実行します。
- 350 x g で5分間遠心分離し、上清を除去します。細胞を冷たい2%FBS-DPBS(v/v)溶液で2回洗浄します。
- 細胞を100μLの2%FBS-DPBS(v/v)溶液に再懸濁します。
- 100 μLの細胞に5 μL(1試験)の抗CD34-FITCおよび5 μL(1試験)の抗CD45-APCを加えます
停止。抗CD73-APC5 μL(1試験)、抗CD90-FITC5 μL(1試験)、抗CD105-PE5 μL(1試験)を別の100 μL細胞懸濁チューブに加えます。5 μL のヒト IgG1 アイソタイプコントロール FITC、ヒト IgG1 アイソタイプコントロール PE、およびヒト IgG1 アイソタイプコントロール APC を 3 本目の 100 μL 細胞懸濁チューブに加えます。暗闇の中で氷の上で15〜20分間インキュベートします。その間に、単一染色ビーズを準備します。 - 細胞を冷たい2%FBS-DPBS(v/v)溶液で2回洗浄します。
- 300 μLの冷たい2%FBS-DPBS(v/v)溶液を加えて細胞を再懸濁し、200メッシュスクリーンフィルターでろ過します。
- フローサイトメトリーを用いてサンプルを解析します。アイソタイプコントロール抗体で染色した細胞懸濁液を分析し、ゲートを設定します。次に、標的抗体で染色した細胞懸濁液を分析します。
5. ヒトリヒトiPS細胞を駆動する間葉系幹細胞の骨形成分化
注:ヒトiPS細胞を駆動するMSCは、骨形成分化能を有する(図3A、B)。骨形成分化のプロトコルは以下に示されています。
- α-MEMに10%FBS、100 nMデキサメタゾン、10 mMベータ-グリセロリン酸、および100 μMアスコルビン酸を添加して、骨形成誘導培地を調製します。
- 1 x 105 MSCをゼラチンでコーティングした48ウェルプレートに播種し、60%〜70%のコンフルエントになるまで培養します。
- 培地を除去し、0.3 mLの骨形成誘導培地を添加します。細胞を骨形成誘導培地中で37°C、5%CO 2で14日間培養し、 培地を3日ごとに交換します。
- 培地を取り出し、一度DPBSで洗浄してください。
- 0.3 mL の 4% PFA を加え、室温で 30 分間インキュベートします。
- PFA を除去します。細胞を0.3 mLのDPBSで10分間室温で洗浄し、3回繰り返します。
- DPBSを除去し、0.2 mLのアリザリンレッド染色溶液を加え、室温で30分間インキュベートします。
- 染色液を除去し、0.3 mL DPBSで細胞を室温で10分間リンスし、3回繰り返します。
- カルシウム沈着の染色を光学顕微鏡で観察します。
6. ヒトiPS細胞駆動型幹細胞の脂肪分化
注:ヒトiPS細胞を駆動する間葉系幹細胞は、脂肪分化能を持っています(図3C、D)。脂肪形成の微分のためのプロトコルは次与えられる。
- α-MEMに10%FBS、1 μMデキサメタゾン、1μMのIBMX、10 μg/mLのインスリン、および100 μMのインドメタシンを添加して、脂肪誘発培地を調製します。α-MEMに10%FBSおよび10μg/mLのインスリンを添加することにより、脂肪形成維持培地を調製します。
- 1 x 105 MSCをゼラチンでコーティングした48ウェルプレートに播種し、細胞密度が90%に達するまで培養します。
- 培地を取り除き、0.3 mLの脂肪誘発培地を加えます。細胞を脂肪誘導培地中で37°C、5%CO2で4日間培養し続けます。
- 培地を除去し、0.3 mLの脂肪形成維持培地を添加します。細胞を脂肪形成維持培地中で37°C、5%CO2で3日間培養し続けます。
- 脂肪細胞の分化と成熟まで、手順6.3と6.4を2〜3回繰り返します。
- 培地を取り出し、一度DPBSで洗浄してください。
- 0.3 mL の 4% PFA を加え、室温で 10 分間インキュベートします。PFAを除去し、DPBSで2回すすぎます。
- メーカーの指示に従ってOli Red O染色剤を塗布し、光学顕微鏡で脂質滴を観察します。
7. ヒトiPS細胞を駆動する間葉細胞の軟骨分化
注:ヒトiPS細胞を駆動する間葉系幹細胞は、軟骨形成分化能を有する(図3E、F)。軟骨形成分化のプロトコールは以下に示す。
- α-MEMに10%FBS、100 nMデキサメタゾン、1%インスリン-トランスフェリン-セレン(ITS)、10 μMアスコルビン酸、1 mMピルビン酸ナトリウム、50 μg/mLプロリン、0.02 nMトランスフォーミング成長因子β3(TGFβ3)、および0.5 μg/mL骨形成タンパク質6(BMP-6)を添加して軟骨芽細胞誘導培地を調製します。
- 2.5 x 105 iPS細胞駆動型MSCを採取し、150 x g で5分間遠心分離した後、上清を除去します。細胞を1 mLのα-MEMに懸濁し、150 x g で5分間遠心分離します。
- 上清を除去し、細胞を0.5 mLの軟骨形成誘導培地に懸濁します。細胞を150 x g で5分間遠心分離します。
- 蓋を直接緩め、軟骨誘発培地を3日ごとに37°C、5%CO2で21日間培養します。遠心分離管を静かにはじいて、軟骨分化中は毎日軟骨形成ペレットを(軟骨形成ペレットを破壊することなく)懸濁させます。
- 上清を取り除き、0.5 mLのPBSで2回洗浄します。
- 0.3 mL の 4% PFA を加え、24 時間固定します。
- パラフィンは軟骨形成ペレットを包埋し、それらを切片化します(3 μm)。切片をトルイジンブルー(1%)で30分間染色します。
- 細胞外軟骨細胞マトリックスを光学顕微鏡で観察します。
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Representative Results
プロトコール(図1A)に従い、iPS細胞をEB形成法および単層培養法でMSCに分化させました。分化中、細胞は異なる代表的な形態を示しました(図1B、C)。
図1Bに示すように、iPS細胞コロニーは、分化前は典型的なコンパクトな形態を示し、細胞が密集した明確な境界を示しています。iPS細胞が解離し、シェーカー上で24時間培養した後、均一な球状のEBが形成されました。MSC分化培地での培養1日目から7日目にかけて、EBの滑らかなエッジが粗くなり、EBの体積が大きくなりました。8日目から17日目にかけて、EBをGFR細胞外マトリックスゲルコーティングされた6ウェルプレートに移した後、EBは徐々にプレートに付着し、多くの接着単層細胞がEBの周囲に広がりました。18日目に細胞のコンフルエント度が90%に達したら、細胞を消化し、ゼラチンでコーティングした培養プレートに播種しました。19日目に細胞が接着し、多角形を呈した。連続して、細胞が90%コンフルエントになったときに2回継代しました。派生したMSCは徐々に成熟し、典型的な紡錘体形状を示し、コロニーは渦を巻いて成長しました。
図1Cに示すように、iPS細胞維持培地をMSC維持培地に24時間入れ替えた後、細胞の体積が増加し、コロニー周辺に広がりました。間葉系幹細胞維持培地で培養している間に、細胞は徐々に増殖し、多層接着細胞を形成しました。14日目に、細胞を消化し、ゼラチンでコーティングした培養プレートに播種しました。15日目に細胞が接着し、多角形を呈した。連続して、細胞が90%コンフルエントになったときに6回継代しました。派生したMSCは徐々に成熟し、典型的な紡錘体形状を示し、コロニーは渦を巻いて成長しました。
ヒトiPS細胞およびヒトiPS細胞駆動型MSCの表面抗原をフローサイトメトリーで解析しました(図2)。 図2Cに示すように、ヒトiPS細胞はCD90が陽性、CD34、CD45、CD73、CD105が陰性でした。両方の方法でヒトiPS細胞をMSCに分化したところ、駆動MSCはCD90、CD73、CD105が陽性、CD34、CD45が陰性でした(図2A、B)。
ヒトiPS細胞を駆動する間葉細胞の分化能は、骨形成分化、脂肪分化、軟骨分化によって調べられました。 図3に示すように、2つの方法のヒトiPS細胞駆動型MSCは、いずれも骨芽細胞、脂肪細胞、軟骨細胞に分化しました。単分子膜法のiPS細胞駆動型MSCは、EB法よりも多くのカルシウム沈着物を形成しました(図3B)。2つの方法では、脂肪形成分化と軟骨形成分化能に有意差はありませんでした(図3D、F)。
ヒトiPS細胞を駆動する間葉系幹細胞の増殖能を連続継代培養により調べた。 図3Gに示すように、どちらの方法でもiPS細胞駆動型MSCは、20継代以上継代することができ、なおかつ急速な増殖能を維持することができます。
表 1 に示す 2 つのアプローチの比較は、分化時間、コスト、細胞増殖能、MSC マーカーの発現、および in vitro での分化能に基づいています。
図1:EB形成法と単層培養法によるiPS細胞のMSCへの分化。 (A)iPS細胞がEB形成と単層培養によってMSCに分化していく様子を示す模式図。(B)EB形成および(C)単層培養を介したiPS細胞からのMSC誘導中のキーファージにおける細胞の形態の表現。スケールバー:300 μmおよび50 μm。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:フローサイトメトリーによるヒトiPS細胞駆動型幹細胞表面抗原解析。 (A)EB形成および(B)単層培養によるiPS細胞駆動MSCにおけるMSC表面抗原の発現率。(C)ヒトiPS細胞をネガティブコントロールとして使用した。MSC陰性マーカー:CD34、CD45;間葉系幹細胞陽性マーカー:CD73、CD90、およびCD105。iPS細胞陰性マーカー:CD34、CD45、CD73、CD105;iPS細胞陽性マーカー:CD90。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:ヒトiPS細胞を駆動する間葉系幹細胞の3系統分化・増殖能 (A)骨形成分化培地中で、ヒトiPS細胞駆動型MSCのカルシウム沈着物を2週間アリザリン赤色染色した。スケールバー:300 μm。 (B)ImageJ分析によるアリザリンレッドS染色の定量。(C)脂肪分化培地中で、iPS細胞駆動型MSCの脂質滴を2週間Oli red O染色。スケールバー:300 μm。 (D)ImageJ分析によるOli Red O染色の定量。(E)細胞外軟骨細胞マトリックスのトルイジンブルー染色。スケールバー:300 μmおよび150 μm。 (F)ImageJ分析によるトルイジン青色染色の定量。(G)iPS細胞駆動型MSCの個体群倍加時間計算。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
| 比較 | EB形成法 | 単層培養法 |
| 微分時間 | 27日間 | 35日間 |
| 費用 | 高い | 低い |
| 増殖速度 | 速い | 速い |
| 拡散能力 | ≥20パッセージ | ≥20パッセージ |
| 間葉系幹細胞マーカーの発現 | CD73 / CD90 / CD105陽性、CD34 / CD45ナガティブ | CD73 / CD90 / CD105陽性、CD34 / CD45ナガティブ |
| 差別化能力 | 脂肪分化、軟骨分化、骨分化能 | 脂肪分化、軟骨分化、骨分化能力の強化 |
| 操作 | 複雑 | 簡単 |
表1:ヒトiPS細胞を間葉系細胞に鑑別する2つの方法の特徴
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Discussion
このプロトコルでは、ヒトiPS細胞をMSCに鑑別する2つの代表的な方法を検討しました20,21,22,23,24,25,26,27,28,30。どちらの方法も、iPS細胞からMSCを誘導することができました。ヒトiPS細胞由来のMSCは、細胞形態(図1)、表面抗原(図2)、分化能(図3)によって確認されました。
どちらの方法も同じMSC維持培地を共有していましたが、EB法ではTGF-βとFGF2を含むMSC分化培地も必要でした。さらに、EB法では、6枚のウェルプレートと二酸化炭素インキュベーターに設置できる特殊なシェーカーの取り付けが少なくて済みました。したがって、EB法のコストは単層法のそれよりも高かった18,20。EB法は単層法よりも複雑に見えました。しかし、EB法は分化時間が短く、MSCを濃縮するための複数回の継代を避けることができました。
その結果、EB法は単層法よりも周囲条件に対する耐性が強いことが分かりました。どちらの方法も、iPS細胞の状態、人間の干渉、および培養環境の影響を受けました11,20。しかし、EB法の成功率は単層法よりもはるかに高いことがわかりました。EB法の重要な段階は、1日目から7日目までのEB分化段階でした。1〜7日目に、EBが徐々に小さくなったり、培地中に多くの死細胞が浮遊して壊れたり、空胞のEBを形成したりすると、これらの不適格なEBはゼラチンプレートに付着しにくくなり、付着細胞がEBから這い出ることはめったにありません。1日目から7日目まで、適格なEBは均一で、わずかに拡大し、その滑らかなエッジは徐々に粗くなり、細胞が突出していました。ゼラチンプレートに移された後、EBはプレートに素早く付着し、多くの付着単層細胞がEBの周囲に広がりました。EB が 1 日目から 7 日目に認定された場合、その後の差別化は簡単に達成できます。対照的に、単層法はどの段階でも失敗する可能性があります。1日目から14日目にかけて、接着細胞が斑点状に脱落することがあり、分化の失敗を示しています。通常、接着細胞は増殖し、多層接着細胞を形成します。14日目以降も、ディッシュに付着する細胞が少ないため、単層法は失敗します。単分子膜法の0日目から13日目にかけて、ディッシュ内の様々な細胞形態を観察しました。しかし、8-17日目のEB法の細胞形態は均一であった。単分子膜法と比較して、EB法は胚発生プロセスに似ており、より制御可能なプログラム分化法であると考えられます。
どちらの方法も、20以上の継代に使用でき、それでも急速な増殖能力を維持することができます11。単層法における骨形成分化のカルシウム沈着物は、EB法よりも多かった。血清中のサイトカインが分化に及ぼす影響を回避するために、幹細胞特異的血清を使用する必要があります。細胞密度が低すぎると、細胞の増殖が止まることが観察されました。したがって、コンフルエントに達した後、細胞は1:3の分割比で継代する必要があります。分化中に抗生物質は使用されませんでした。したがって、この実験セットアップでは、Good Laboratory Practices(GLP)を厳守することが必須です。
結論として、このプロトコルでテストされた各方法には長所と短所がありました。どちらの方法も、iPS細胞からMSCを作製することができ、選択はユーザーの要件に基づいています。
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Disclosures
著者は何も開示していません。
Acknowledgments
過去と現在のMao and Hu Labのすべてのメンバーに、興味深い議論とプロジェクトへの多大な貢献に心から感謝しています。国立成育医療研究センターの多大なるご支援に感謝いたします。本研究は、中国国家自然科学基金会(U20A20351は毛建華、胡立丹82200784)、中国浙江省自然科学基金会(No.LQ22C070004 Lidan Hu へ)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alizarin red staining kit | Beyotime Biotechnology | C0148S | |
| Anti-human-CD105 (PE) | Biolegend | 323206 | |
| Anti-human-CD34 (FITC) | Biolegend | 343503 | |
| Anti-human-CD45 (APC) | Biolegend | 304011 | |
| Anti-human-CD73( APC) | Biolegend | 344006 | |
| Anti-human-CD90 (FITC) | Biolegend | 328108 | |
| Ascorbic acid | Solarbio | A8100 | |
| BMP-6 | Novoprotein | C012 | |
| Carbon dioxide level shaker | Crystal | CO-06UC6 | |
| Compensation Beads | BioLegend | 424601 | |
| CryoStor CS10 | STEMCELL Technology | 07959 | |
| Dexamethasone | Beyotime Biotechnology | ST1254 | |
| DMEM/F12 medium | Servicebio | G4610 | |
| Fetal bovine serum | HAKATA | HS-FBS-500 | |
| FGF2 | Stemcell | 78003.1 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G2500-100G | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | |
| human IgG1 isotype control APC | BioLegend | 403505 | |
| human IgG1 isotype control FITC | BioLegend | 403507 | |
| human IgG1 isotype control PE | BioLegend | 403503 | |
| Human TGF-β1 | Stemcell | 78067 | |
| Human TruStain FcX | BioLegend | 422301 | |
| IBMX | Beyotime Biotechnology | ST1398 | |
| Indomethacin | Solarbio | SI9020 | |
| Insulin | Beyotime Biotechnology | P3376 | |
| iPSC maintenance medium | STEMCELL Technology | 85850 | |
| ITS Media Supplement | Beyotime Biotechnology | C0341-10mL | |
| Matrigel, growth factor reduced | BD Corning | 354230 | |
| Oli Red O staining kit | Beyotime Biotechnology | C0158S | |
| Proline | Solarbio | P0011 | |
| Sodium pyruvate | ThermoFisher | 11360-070 | |
| TGFβ3 | Novoprotein | CJ44 | |
| Toluidine blue staining kit | Solarbio | G2543 | |
| TrypLE Express Enzyme(1x) | Gibco | 12604013 | |
| Ultra-Low Attachment 6 Well Plate | Costar | 3471 | |
| Versene | Gibco | 15040-66 | |
| Y-27632 | Stemcell | 72304 | |
| α-MEM | Hyclone | SH30265 | |
| β-glycerophosphate | Solarbio | G8100 |
References
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