Summary
Dieses Protokoll beschreibt und vergleicht zwei repräsentative Methoden zur Differenzierung von hiPSCs in mesenchymale Stromazellen (MSCs). Die Monolayer-Methode zeichnet sich durch geringere Kosten, einfachere Bedienung und leichtere osteogene Differenzierung aus. Die Methode der Embryoidkörper (EBs) zeichnet sich durch einen geringeren Zeitaufwand aus.
Abstract
Mesenchymale Stromazellen (MSCs) sind adulte pluripotente Stammzellen, die in der regenerativen Medizin weit verbreitet sind. Da MSCs aus somatischem Gewebe durch begrenzte Spende, Qualitätsschwankungen und Biosicherheit eingeschränkt sind, haben in den letzten 10 Jahren die Bemühungen, MSCs aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) zu erzeugen, stark zugenommen. Frühere und neuere Bemühungen zur Differenzierung von hiPSCs in MSCs konzentrierten sich auf zwei Kulturmethoden: (1) die Bildung von Embryoidkörpern (EBs) und (2) die Verwendung von Monolayer-Kulturen. Dieses Protokoll beschreibt diese beiden repräsentativen Methoden zur Ableitung von MSC aus hiPSCs. Jede Methode hat ihre Vor- und Nachteile, einschließlich Zeit, Kosten, Zellproliferationsfähigkeit, der Expression von MSC-Markern und ihrer Fähigkeit zur Differenzierung in vitro. Dieses Protokoll zeigt, dass beide Methoden reife und funktionelle MSCs aus hiPSCs ableiten können. Die Monolayer-Methode zeichnet sich durch geringere Kosten, einfachere Bedienung und leichtere osteogene Differenzierung aus, während sich die EB-Methode durch einen geringeren Zeitaufwand auszeichnet.
Introduction
Mesenchymale Stromazellen (MSCs) sind aus dem Mesoderm gewonnene adulte pluripotente Stammzellen1. MSCs sind in fast allen Bindegeweben vorhanden2. Seit MSCs in den 1970er Jahren entdeckt und 1987 von Friedenstein et al.3,4,5 erfolgreich aus dem Knochenmark isoliert wurden, wurde eine Vielzahl von menschlichen somatischen (einschließlich fetaler und adulter) Gewebe wie Knochen, Knorpel, Sehnen, Muskeln, Fettgewebe und hämatopoetisches unterstützendes Stroma zur Isolierung von MSCs verwendet 1,2,6,7 . MSCs zeigen eine hohe proliferative Fähigkeit und Plastizität, sich in viele somatische Zelllinien zu differenzieren und könnten in verletztes und entzündetes Gewebe migrieren 2,8,9. Diese Eigenschaften machen MSCs zu einem potenziellen Kandidaten für die regenerative Medizin10. Aus somatischem Gewebe gewonnene MSCs (st-MSCs) sind jedoch durch eine begrenzte Spende, eine begrenzte Zellproliferationskapazität, Qualitätsschwankungen und Bedenken hinsichtlich der biologischen Sicherheit hinsichtlich einer möglichen Übertragung von Krankheitserregern, falls vorhanden, von den Spendern eingeschränkt11,12.
Humane induzierte pluripotente Stammzellen (hiPSCs) werden aus adulten Zellen gewonnen, die mit Transkriptionsfaktoren (Oct4, Sox2, Klf4 und c-Myc) reprogrammiert werden, die ähnliche Funktionen wie embryonale Stammzellen haben13,14. Sie können sich selbst erneuern und besitzen das Potenzial, sich in jede Art von somatischen Zellen, einschließlich MSCs, zu differenzieren. Im Vergleich zu st-MSCs haben iPSC-MSCs den Vorteil einer unbegrenzten Versorgung, niedrigerer Kosten, höherer Reinheit, Bequemlichkeit bei der Qualitätskontrolle, einfacher Produktion und Genmodifikation 15,16,17.
Aufgrund dieser Vorteile von iPSC-MSCs wurde über eine Vielzahl von Methoden berichtet, mit denen MSC aus iPSC gesteuert wird. Diese Differenzierungsmethoden basieren auf zwei Kulturmethoden: (1) der Bildung von Embryoidkörpern (EBs) und (2) der Verwendung von Monolayerkulturen 11,18,19,20. In dieser Arbeit wurde ein repräsentativer Ansatz für jede der beiden Methoden charakterisiert. Darüber hinaus wurden Vergleiche zwischen zwei repräsentativen Ansätzen basierend auf Zeit, Kosten, Proliferationsfähigkeit, Expression von MSC-Biomarkern und Differenzierungsfähigkeit in vitro durchgeführt.
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Protocol
1. Wartung von hiPSCs
- Auftauen von hiPSC
- Nehmen Sie die Zellen aus dem flüssigen Stickstoff und tauen Sie die Zellen in einem 37 °C warmen Wasserbad schnell auf. Die auftauenden Zellen werden in ein 15-ml-Röhrchen überführt, das mit 3 ml iPSC-Erhaltungsmedium vorbereitet ist (Materialtabelle). Mischen Sie das Medium vorsichtig.
- Bei 300 x g 5 min zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen vorsichtig in 1 ml iPSC-Erhaltungsmedium mit 10 μM Y-27632 (Pitaptieren Sie die Zellen 2-3 Mal nach oben und unten).
- Die Zellsuspension wird in eine 6-Well-Gewebekulturplatte überführt, die mit Wachstumsfaktor-reduziertem (GFR)-extrazellulärem Matrixgel (1:100) und 2 ml iPSC-Erhaltungsmedium mit 10 μM Y-27632 beschichtet ist (ca. 4 x 10,4 Zellen/cm2).
- Kultivieren Sie die Zellen 5-6 Tage lang (80%-90% Konfluenz) bei 37 °C, 5% CO2 mit iPSC-Erhaltungsmedien wechseln Sie täglich.
- Passage von hiPSC
- Entfernen Sie das iPSC-Wartungsmedium von der 6-Well-Platte. Waschen Sie die hiPSCs einmal mit DPBS.
- 700-800 μl 0,48 mM EDTA-Lösung zugeben und 1 Minute bei Raumtemperatur (RT) inkubieren, dann die Aufschlusslösung entfernen. Bei 37 °C Temperatur 3-5 Minuten weiter inkubieren.
- Wenn die Zellen in Blätter aufgeschlossen werden (Zellen nicht in einzelne Zellen zerlegen), fügen Sie 1 ml iPSC-Erhaltungsmedium mit 10 μM Y-27632 hinzu, um den Aufschluss zu beenden. Pipettieren Sie die Zellen vorsichtig 2-3 Mal nach oben und unten.
- Überführen Sie die Zellsuspension in eine 6-Well-Gewebekulturplatte, die mit Wachstumsfaktor-reduziertem (GFR)-extrazellulärem Matrixgel (1:100) und 2 ml iPSC-Erhaltungsmedium beschichtet ist, wobei 10 μM Y-27632 im Voraus hinzugefügt wurden.
ANMERKUNG: Das Durchgangsverhältnis reicht von 1:6 bis 1:20 (ca. 4 x 104 Zellen/cm2), und die mittlere Aggregationsgröße beträgt ca. 50-200 μm. - Kultivieren Sie die Zellen bis zu 80%-90% Konfluenz (5-6 Tage) bei 37 °C, 5% CO2 mit täglich wechselnden iPSC-Erhaltungsmedien.
2. Differenzierung von MSCs von hiPSCs durch EB-Bildung
ANMERKUNG: Die Methode ist aus der bisherigen Literatur 21,22,23,24 abgeleitet. Eine Übersicht über die Methode ist in Abbildung 1 dargestellt. Die Merkmale der Methode sind in Tabelle 1 zusammengefasst.
- Aufbereitung des Mediums
- Bereiten Sie das MSC-Differenzierungsmedium vor, indem Sie α-MEM mit 1 % (v/v) GlutaMAX, 10 % (v/v) FBS, 10 ng/ml FGF2 und 5 ng/ml TGFβ supplementieren.
- Bereiten Sie das MSC-Erhaltungsmedium vor, indem Sie α-MEM mit 1 % (v/v) GlutMAX, 10 % (v/v) FBS und 1 ng/ml FGF2 ergänzen.
- Präparation von hiPS-Zellen
- Kultur hiPS-Linien (Passage mindestens 2-3 mal nach dem Auftauen) in iPSC-Erhaltungsmedium auf einer 6-Well-Gewebekulturplatte, die mit Wachstumsfaktor-reduziertem (GFR)-extrazellulärem Matrixgel (1:100) bei 37 °C, 5% CO2 bis 80%-90% Konfluenz beschichtet ist.
- Tag 0: EB-Bildung
- Entfernen Sie das iPSC-Wartungsmedium von der 6-Well-Platte. Waschen Sie die hiPSCs einmal mit DPBS.
- 700-800 μl 0,48 mM EDTA-Lösung zugeben und 1 Minute bei RT inkubieren, dann die Aufschlusslösung entfernen. Bei 37 °C Temperatur 3-5 Minuten weiter inkubieren.
- Wenn Zellen in Blätter aufgeschlossen werden (Zellen nicht in einzelne Zellen verdauen), fügen Sie 2 ml iPS-Erhaltungsmedium (mit 10 μM Rock-Inhibitor und 1:100 GFR-Gel für extrazelluläre Matrix) hinzu, um die Verdauung zu beenden.
- Übertragen Sie die Zellen auf eine 6-Well-Platte mit niedrigem Anhang. Säen Sie die Zellen in einem Verhältnis von 2 Vertiefungen der Gewebekulturplatte zu 1 Vertiefung der Platte mit niedriger Anhaftung. Die Zellen werden in einem Schüttler (60 U/min) bei 37 °C und 5 %CO2 für 24 h inkubiert, um sphärische EBs zu bilden.
- Tag 1-Tag 7: EB-Differenzierung
- Übertragen Sie die EBs mit einer Pasteurpipette in das Zentrifugenröhrchen (ohne EBs zu zerstören) und lassen Sie die EBs 5-10 Minuten lang bei RT auf natürliche Weise sedimentieren. Entfernen Sie dann den Überstand.
- Übertragen Sie die EBs auf eine 6-Well-Platte mit niedrigem Aufsatz mit 2 ml MSC-Differenzierungsmedium. Kultivieren Sie die EBs auf dem Schüttler bei 37 °C, 5 %CO2 für 7 Tage mit einmal Mediumwechsel.
- Tag 8-Tag 17: EB-Impfung
- Überführen Sie die EBs mit einer Pasteurpipette in das Zentrifugenröhrchen (ohne EBs zu zerstören) und lassen Sie die EBs 5-10 Minuten lang auf natürliche Weise sedimentieren. Entfernen Sie dann den Überstand.
- Überführen Sie die EBs auf eine gelbeschichtete 6-Well-Platte mit GFR-extrazellulärer Matrix und 2 ml MSC-Erhaltungsmedium. Kultur bis 90% Konfluenz (~10 Tage) mit regelmäßigem Medienwechsel nach Zelladhäsion.
- Tag 18-Tag 27: Reifung und Expansion der MSCs
- Behandeln Sie die EB-abgeleitete Kultur mit einer Dissoziationslösung bei 37 °C für 5-10 Minuten (die Aufschlusszeit variiert aufgrund des Vorhandenseins verschiedener Zelltypen).
- Wenn ein Teil der Zellen in Einzelzellen aufgeschlossen ist, fügen Sie 2 ml des MSC-Erhaltungsmediums hinzu, um den Aufschluss zu beenden, und überführen Sie die Zellsuspension in ein Zentrifugenröhrchen. Waschen Sie die verbleibenden unverdauten Zellen einmal mit DPBS und verdauen Sie sie erneut. Wiederholen Sie dies mehrmals, bis alle Zellen in einzelne Zellen zerlegt sind. Die Zellsuspension wird 5 min lang bei 250 x g zentrifugiert, dann der Überstand entfernt.
- Die Zellen werden auf eine mit Gelatine beschichtete Kulturplatte (ca. 2 x 105 Zellen/cm2) ausgesät. Kultivierung bis zu 90% Konfluenz im MSC-Erhaltungsmedium mit regelmäßigem Mediumwechsel. Bezeichnen Sie diese Zellgeneration an dieser Stelle als Durchgang 0 (P0).
- Um MSC rein und reif zu machen, fahren Sie fort, die Zellen zweimal in einem Split-Verhältnis von 1:3 in etwa 6 Tagen zu passieren. Die meisten Zellen weisen eine fibroblastenartige Morphologie (spindelförmig) auf.
3. Differenzierung von MSCs von hiPSCs mittels Monolayer-Kultur
ANMERKUNG: Die Methode ist aus der bisherigen Literaturabgeleitet 25,26,27,28. Eine Übersicht über diese Methode ist in Abbildung 1 dargestellt. Die Merkmale der Methode sind in Tabelle 1 zusammengefasst.
- Aufbereitung des Mediums
- Bereiten Sie das MSC-Erhaltungsmedium vor, indem Sie α-MEM mit 1 % (v/v) GlutMAX, 10 % (v/v) FBS und 1 ng/ml FGF2 supplementieren.
- Präparation von hiPS-Zellen
- Kultur hiPS-Linien (Passage mindestens 2-3 mal nach dem Auftauen) im iPSC-Erhaltungsmedium auf einer 6-Well-Gewebekulturplatte, die mit Wachstumsfaktor-reduziertem (GFR)-extrazellulärem Matrixgel (1:100) bei 37 °C, 5 %CO2 bis 50 % -60 % Konfluenz beschichtet ist.
- Tag 0-Tag 13: Differenzierung durch direkte Monolayer-Kulturen
- Entfernen Sie das iPSC-Wartungsmedium von der 6-Well-Platte.
- 2 ml des MSC-Erhaltungsmediums und der Kultur 14 Tage lang bei 37 °C und 5 % CO2 direkt zugeben, wobei das Medium täglich gewechselt wird.
- Tag 14-Tag 35: Reifung der MSCs durch wiederholte Passage
- Behandeln Sie die Monolayer-Kulturen mit einer Dissoziationslösung bei 37 °C für 5-10 min (die Aufschlusszeit variiert aufgrund des Vorhandenseins verschiedener Zelltypen).
- Wenn die Zellen in Einzelzellen verdaut sind, fügen Sie 2 ml MSC-Erhaltungsmedium hinzu, um den Aufschluss zu beenden, und überführen Sie die Zellsuspension in das Zentrifugenröhrchen. Waschen Sie die verbleibenden unverdauten Zellen einmal mit DPBS und verdauen Sie sie erneut. Wiederholen Sie dies mehrmals, bis alle Zellen in einzelne Zellen zerlegt sind. Die Zellsuspension wird 5 min lang bei 250 x g zentrifugiert, dann der Überstand entfernt.
- Die Zellen werden auf eine mit Gelatine beschichtete Kulturschale (ca. 2 x 105 Zellen/cm2) ausgesät. Kultur bis zu 90% Konfluenz im MSC-Erhaltungsmedium mit regelmäßigem Medienwechsel. Bezeichnen Sie diese Zellgeneration an dieser Stelle als Durchgang 0 (P0).
- Um MSC rein und reif zu machen, fahren Sie fort, die Zellen 6 Mal in einem Split-Verhältnis von 1:3 in etwa 18 Tagen zu passieren. Die meisten Zellen weisen eine fibroblastenartige Morphologie (spindelförmig) auf.
4. Analyse von Oberflächenantigenen von hiPSC-treibenden MSCs mittels Durchflusszytometrie
ANMERKUNG: Ähnlich wie die Oberflächenantigene von MSCs aus dem Knochenmark exprimieren hiPSCs-treibende MSCs CD105, CD73 und CD90, aber nicht CD45, CD3429. Darüber hinaus können hiPS-Zellen als Negativkontrollzellen verwendet werden. Die Analyse von Oberflächenantigenen von hiPSC-treibenden MSCs und hiPSCs mittels Durchflusszytometrie ist in Abbildung 2 dargestellt.
- Die hiPSC-treibenden MSCs werden mit einer Dissoziationslösung bei 37 °C für 2-3 min behandelt. Behandeln Sie die hiPSCs mit 0,48 mM EDTA-Dissoziationsreagenz und inkubieren Sie 1 min bei RT, dann entfernen Sie das Dissoziationsreagenz. Bei 37 °C Temperatur 3-5 Minuten weiter inkubieren.
- Wenn die Zellen in Einzelzellen verdaut sind, fügen Sie Medium hinzu (MSC-Erhaltungsmedium zu MSCs und iPSC-Erhaltungsmedium zu iPSCs), um den Aufschluss zu beenden.
- Die Zellsuspension wird 5 min lang bei 350 x g zentrifugiert, dann der Überstand entfernt.
- Die Zellen werden einmal mit kaltem DPBS gewaschen, 5 min lang bei 350 x g zentrifugiert und dann der Überstand entfernt.
- Die Zellen werden in einer kalten 10%igen FBS-DPBS-Lösung (v/v) bei 10 x 106 Zellen/ml gezählt und resuspendiert und 100 μl/Röhrchen Zellsuspension (1 x 106 Zellen/Röhrchen) in 1,5 ml-Zentrifugenröhrchen verteilt.
- 5 μl humane Fc-Rezeptor-blockierende Lösung zu 100 μl Zellsuspension hinzufügen. Inkubieren Sie 5-10 Minuten bei RT, um eine unspezifische Blockierung durchzuführen.
- Bei 350 x g 5 min zentrifugieren und den Überstand entfernen. Waschen Sie die Zellen zweimal mit einer kalten 2%igen FBS-DPBS (v/v)-Lösung.
- Resuspendieren Sie die Zellen in kalter 100 μl 2%iger FBS-DPBS (v/v)-Lösung.
- 5 μl (1 Test) anti-CD34-FITC und 5 μl (1 Test) anti-CD45-APC in die 100-μl-Zelle geben
Federung. 5 μl (1 Test) Anti-CD73-APC, 5 μl (1 Test) anti-CD90-FITC und 5 μl (1 Test) anti-CD105-PE in ein weiteres 100-μl-Zellsuspensionsröhrchen geben. Geben Sie 5 μl humanes IgG1-Isotyp-Kontroll-FITC, humanes IgG1-Isotyp-Kontroll-PE und humanes IgG1-Isotyp-Kontroll-APC in das dritte 100-μl-Zellsuspensionsröhrchen. 15-20 Minuten auf Eis im Dunkeln inkubieren. Bereiten Sie in der Zwischenzeit Einzelfärbungsperlen vor. - Waschen Sie die Zellen zweimal mit einer kalten 2%igen FBS-DPBS (v/v)-Lösung.
- Fügen Sie 300 μl kalte 2%ige FBS-DPBS-Lösung (v/v) hinzu, um die Zellen zu resuspendieren, und filtern Sie über einen 200-Mesh-Siebfilter.
- Analysieren Sie die Proben mittels Durchflusszytometrie. Analysieren Sie die Zellsuspension, die mit Isotyp-Kontrollantikörpern und Set-Gate gefärbt wurde. Anschließend analysieren Sie die mit Zielantikörpern gefärbte Zellsuspension.
5. Osteogene Differenzierung von hiPSC-treibenden MSCs
HINWEIS: Die hiPSC-treibenden MSCs besitzen ein osteogenes Differenzierungspotenzial (Abbildung 3A, B). Das Protokoll für die osteogene Differenzierung ist unten angegeben.
- Bereiten Sie das osteogene Induktionsmedium vor, indem Sie α-MEM mit 10 % FBS, 100 nM Dexamethason, 10 mM Beta-Glycerophosphat und 100 μM Ascorbinsäure ergänzen.
- 1 x 105 MSCs in eine mit Gelatine beschichtete 48-Well-Platte aussäen und kultivieren, bis sie zu 60 % bis 70 % konfluent ist.
- Entfernen Sie das Medium und fügen Sie 0,3 ml osteogenes Induktionsmedium hinzu. Die Zellen werden 14 Tage lang in einem osteogenen Induktionsmedium bei 37 °C, 5 % CO2 , mit einem Medienwechsel alle 3 Tage kultiviert.
- Entfernen Sie das Medium und waschen Sie es einmal mit DPBS.
- Fügen Sie 0,3 ml 4%iges PFA hinzu und inkubieren Sie 30 Minuten lang bei RT.
- PFA entfernen. Spülen Sie die Zellen mit 0,3 ml DPBS für 10 Minuten bei RT und wiederholen Sie den Vorgang 3 Mal.
- Entfernen Sie das DPBS, fügen Sie 0,2 ml Alizarinrot-Färbelösung hinzu und inkubieren Sie 30 Minuten lang bei RT.
- Entfernen Sie die Färbelösung, spülen Sie die Zellen mit 0,3 ml DPBS für 10 Minuten bei RT und wiederholen Sie den Vorgang 3 Mal.
- Beobachten Sie die Färbung der Kalziumablagerung unter dem Lichtmikroskop.
6. Adipogene Differenzierung von hiPSC-treibenden MSCs
HINWEIS: Die hiPSC-treibenden MSCs besitzen ein adipogenes Differenzierungspotenzial (Abbildung 3C, D). Das Protokoll für die adipogene Differenzierung ist unten angegeben.
- Bereiten Sie ein adipogenes Induktionsmedium vor, indem Sie α-MEM mit 10 % FBS, 1 μM Dexamethason, 1 μM IBMX, 10 μg/ml Insulin und 100 μM Indometacin supplementieren. Bereiten Sie adipogenes Erhaltungsmedium vor, indem Sie α-MEM mit 10 % FBS und 10 μg/ml Insulin ergänzen.
- 1 x 105 MSCs in eine mit Gelatine beschichtete 48-Well-Platte aussäen und kultivieren, bis die Zelldichte 90 % erreicht.
- Entfernen Sie das Medium und fügen Sie 0,3 ml adipogenes Induktionsmedium hinzu. Die Zellen werden 4 Tage lang im adipogenen Induktionsmedium bei 37 °C, 5 %CO2 kultiviert.
- Entfernen Sie das Medium und fügen Sie 0,3 ml adipogenes Erhaltungsmedium hinzu. Die Kultivierung der Zellen im adipogenen Erhaltungsmedium wird 3 Tage lang bei 37 °C, 5 %CO2 fortgesetzt.
- Wiederholen Sie die Schritte 6.3 und 6.4 2-3 Mal bis zur Differenzierung und Reifung der Adipozyten.
- Entfernen Sie das Medium und waschen Sie es einmal mit DPBS.
- Fügen Sie 0,3 ml 4% PFA hinzu und inkubieren Sie 10 Minuten lang bei RT. Entfernen Sie die PFA und spülen Sie sie 2 Mal mit DPBS ab.
- Tragen Sie die Oli Red O Färbung gemäß den Anweisungen des Herstellers auf und beobachten Sie die Lipidtröpfchen unter dem Lichtmikroskop.
7. Chondrogene Differenzierung von hiPSC-treibenden MSCs
HINWEIS: Die hiPSC-treibenden MSCs besitzen ein chondrogenes Differenzierungspotenzial (Abbildung 3E, F). Das Protokoll für die chondrogene Differenzierung ist unten angegeben.
- Bereiten Sie das Chondroblast-Induktionsmedium vor, indem Sie α-MEM mit 10 % FBS, 100 nM Dexamethason, 1 % Insulintransferrin-Selen (ITS), 10 μM Ascorbinsäure, 1 mM Natriumpyruvat, 50 μg/ml Prolin, 0,02 nM transformierendem Wachstumsfaktor β3 (TGFβ3) und 0,5 μg/ml knochenmorphogenetischem Protein 6 (BMP-6) supplementieren.
- Sammeln Sie 2,5 x 105 HiPSC-treibende MSCs und zentrifugieren Sie die Zellen 5 Minuten lang bei 150 x g , dann entfernen Sie den Überstand. Die Zellen werden in 1 ml α-MEM suspendiert und dann 5 Minuten lang bei 150 x g zentrifugiert.
- Entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie die Zellen in 0,5 ml chondrogenem Induktionsmedium. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 150 x g für 5 Minuten.
- Deckel direkt abschrauben und 21 Tage lang mit chondrogenem Induktionsmedienwechsel alle 3 Tage bei 37 °C, 5 % CO2 kultivieren. Schnippen Sie das Zentrifugenröhrchen vorsichtig, um die chondrogenen Pellets (ohne chondrogene Pellets zu zerstören) jeden Tag während der chondrogenen Differenzierung zu suspendieren.
- Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie ihn zweimal mit 0,5 ml PBS.
- Fügen Sie 0,3 ml 4% PFA hinzu und fixieren Sie es 24 Stunden lang.
- Paraffin bettet die chondrogenen Pellets ein und schneidet sie dann (3 μm). Die Partien 30 Minuten lang mit Toluidinblau (1%) einfärben.
- Beobachten Sie die extrazelluläre Chondrozytenmatrix unter dem Lichtmikroskop.
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Representative Results
In Anlehnung an das Protokoll (Abbildung 1A) wurden hiPSCs mit Hilfe der EB-Bildung und der Monolayer-Kulturmethode in MSCs differenziert. Während der Differenzierung zeigten die Zellen unterschiedliche repräsentative Morphologien (Abbildung 1B,C).
Wie in Abbildung 1B dargestellt, zeigen die hiPS-Kolonien vor der Differenzierung eine typische kompakte Morphologie mit einem klaren Rand, der aus dicht gepackten Zellen besteht. Gleichmäßige sphärische EBs bildeten sich nach der Dissoziation und Kultivierung von hiPSCs für 24 Stunden auf dem Shaker. Während Tag 1 bis Tag 7 der Kultur im MSC-Differenzierungsmedium wurde die glatte Kante von EB rau und das EB-Volumen wurde größer. Von Tag 8 bis Tag 17, nach dem Transfer der EBs auf eine gelbeschichtete 6-Well-Platte mit GFR-extrazellulärer Matrix, hafteten EBs allmählich an der Platte, und viele adhärente Monolayer-Zellen verteilten sich um die EBs. Als die Zellen an Tag 18 eine Konfluenz von 90 % erreichten, wurden die Zellen verdaut und auf einer mit Gelatine beschichteten Kulturplatte ausgesät. Am 19. Tag klebte die Zelle und zeigte eine polygonale Form. Nacheinander wurden die Zellen zweimal passiert, wenn sie zu 90% konfluent waren. Die abgeleiteten MSCs reiften allmählich heran und zeigten eine typische Spindelform, und die Kolonie wuchs in einem Wirbel.
Wie in Abbildung 1C gezeigt, nahm das Volumen der Zellen zu und breitete sich in der Kolonie aus, nachdem das iPSC-Erhaltungsmedium 24 Stunden lang durch das MSC-Erhaltungsmedium ersetzt wurde. Während der Kultivierung in einem MSC-Erhaltungsmedium vermehrten sich die Zellen allmählich und bildeten mehrschichtige adhärente Zellen. Am 14. Tag wurden die Zellen verdaut und auf einer mit Gelatine beschichteten Kulturplatte ausgesät. Am 15. Tag klebte die Zelle und zeigte eine polygonale Form. Konsekutiv wurden die Zellen 6 Mal passiert, wenn sie zu 90% konfluent waren. Die abgeleiteten MSCs reiften allmählich heran und zeigten eine typische Spindelform, und die Kolonie wuchs in einem Wirbel.
Die Oberflächenantigene von hiPSCs und hiPSC-treibenden MSCs wurden mittels Durchflusszytometrie analysiert (Abbildung 2). Wie in Abbildung 2C gezeigt, waren hiPSCs positiv für CD90 und negativ für CD34, CD45, CD73 und CD105. Nach der Differenzierung von hiPSCs in MSCs mit beiden Methoden waren die treibenden MSCs positiv für CD90, CD73 und CD105 und negativ für CD34 und CD45 (Abbildung 2A,B).
Die Differenzierungsfähigkeit von hiPSC-treibenden MSCs wurde durch osteogene, adipogene und chondrogene Differenzierung untersucht. Wie in Abbildung 3 dargestellt, unterschieden sich die beiden hiPSC-treibenden MSCs der beiden Methoden in Osteoblasten, Adipozyten und Chondrozyten. Die hiPSC-treibenden MSCs der Monolayer-Methode bildeten mehr Kalziumablagerungen als die EB-Methode (Abbildung 3B). Die beiden Methoden wiesen keinen signifikanten Unterschied in der adipogenen Differenzierung und der chondrogenen Differenzierungsfähigkeit auf (Abbildung 3D,F).
Die Proliferationsfähigkeit von hiPSC-treibenden MSCs wurde mittels kontinuierlicher Passagekultur untersucht. Wie in Abbildung 3G gezeigt, können die hiPSC-treibenden MSCs beider Methoden für mehr als 20 Passagen durchgelassen werden und behalten dennoch eine schnelle Proliferationsfähigkeit bei.
Der Vergleich zwischen den beiden in Tabelle 1 gezeigten Ansätzen basiert auf der Differenzierungszeit, den Kosten, der Zellproliferationsfähigkeit, der Expression der MSC-Marker und ihrer Differenzierungsfähigkeit in vitro.
Abbildung 1: Differenzierung von hiPSCs in MSCs mittels EB-Formationsmethode und Monolayer-Kulturmethode. (A) Schematische Darstellung der Differenzierung von hiPSCs in MSCs mittels EB-Bildung und Monolayer-Kultur. Darstellung der Morphologie von Zellen an Schlüsselphagen während der MSCs-Ableitung aus hiPSCs durch (B) EB-Bildung und (C) Monolayer-Kultur. Maßstabsleisten: 300 μm und 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Analyse von HiPSC-treibenden MSC-Oberflächenantigenen mittels Durchflusszytometrie. Expression von MSC-Oberflächenantigenen in iPSC-treibenden MSCs durch (A) EB-Bildung und (B) Monolayer-Kultur. (C) hiPS-Zellen wurden als Negativkontrolle verwendet. MSCs negative Marker: CD34, CD45; MSCs positive Marker: CD73, CD90 und CD105. hiPSCs negative Marker: CD34, CD45, CD73 und CD105; hiPS-positive Marker: CD90. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Dreilinien-Differenzierungs- und Proliferationsfähigkeit von hiPSC-treibenden MSCs. (A) Alizarin-Rotfärbung von Kalziumablagerungen von hiPSC-treibenden MSCs in osteogenem Differenzierungsmedium für 2 Wochen. Maßstabsbalken: 300 μm. (B) Quantifizierung der Alizarinrot-S-Färbung durch ImageJ-Analyse. (C) Olirot-O-Färbung von Lipidtröpfchen von hiPSC-treibenden MSCs in adipogenem Differenzierungsmedium für 2 Wochen. Maßstabsbalken: 300 μm. (D) Quantifizierung der Oli Red O-Färbung durch ImageJ-Analyse. (E) Toluidinblau-Färbung der extrazellulären Chondrozytenmatrix. Maßstabsbalken: 300 μm und 150 μm. (F) Quantifizierung der Toluidinblau-Färbung durch ImageJ-Analyse. (G) Berechnung der Verdopplungszeit von hiPSC-treibenden MSCs. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Vergleich | EB-Formationsmethode | Methode der Monolayer-Kulturen |
| Differenzierungszeit | 27 Tage | 35 Tage |
| Kosten | Hoch | Niedrig |
| Geschwindigkeit der Verbreitung | Schnell | Schnell |
| Proliferationsfähigkeit | ≥20 Durchgang | ≥20 Durchgang |
| Expression von MSC-Markern | CD73/CD90/CD105 positiv,CD34/CD45 nagativ | CD73/CD90/CD105 positiv,CD34/CD45 nagativ |
| Fähigkeit zur Differenzierung | Adipogene Differenzierung, chondrogene Differenzierung und osteogene Differenzierungsfähigkeit | Adipogene Differenzierung, chondrogene Differenzierung und stärkere osteogene Differenzierungsfähigkeit |
| Operation | Kompliziert | Einfach |
Tabelle 1: Charakteristika der beiden Methoden zur Differenzierung von hiPSCs in MSCs.
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Discussion
In diesem Protokoll wurden zwei repräsentative Methoden zur Differenzierung von hiPSCs in MSCs untersucht 20,21,22,23,24,25,26,27,28,30. Beide Methoden waren in der Lage, MSCs aus hiPSCs abzuleiten. Die hiPSC-abgeleiteten MSCs wurden durch die Zellmorphologie (Abbildung 1), die Oberflächenantigene (Abbildung 2) und ihre Fähigkeit zur Differenzierung (Abbildung 3) bestätigt.
Beide Methoden teilten sich das gleiche MSC-Erhaltungsmedium, während die EB-Methode zusätzlich ein MSC-Differenzierungsmedium mit TGF-β und FGF2 benötigte. Darüber hinaus erforderte die EB-Methode eine geringe Befestigung von 6-Well-Platten und einen speziellen Shaker, der in einem Kohlendioxid-Inkubator platziert werden kann. Daher waren die Kosten des EB-Verfahrens höher als die des Monolayer-Verfahrens18,20. Die EB-Methode schien komplizierter zu sein als die Monolayer-Methode. Die Differenzierungszeit der EB-Methode war jedoch kürzer, wodurch mehrere Passagen zur Anreicherung von MSCs vermieden wurden.
Wir stellten fest, dass die Toleranz gegenüber Umgebungsbedingungen der EB-Methode stärker war als die der Monolayer-Methode. Beide Methoden wurden durch den iPSC-Status, menschliche Eingriffe und die Kulturumgebung beeinflusst11,20. Wir stellten jedoch fest, dass die Erfolgsquote der EB-Methode viel höher war als die der Monolayer-Methode. Die Schlüsselphase der EB-Methode war die EB-Differenzierungsphase von Tag 1 bis Tag 7. An den Tagen 1-7, wenn EBs allmählich kleiner werden oder mit vielen schwebenden toten Zellen im Kulturmedium gebrochen werden oder vakuoolate EBs bilden, haben diese unqualifizierten EBs Schwierigkeiten, an der Gelatineplatte zu haften, und es kriechen wenige, wenn überhaupt, adhärente Zellen aus den EBs heraus. Von Tag 1 bis Tag 7 waren die qualifizierten EBs einheitlich und leicht vergrößert, wobei die glatten Kanten allmählich rau wurden und Zellen hervorstanden. Nach dem Transfer auf die Gelatineplatte haften die EBs schnell an der Platte, und viele anhaftende Monolayer-Zellen verteilen sich um die EBs. Wenn EBs an den Tagen 1-7 qualifiziert werden, ist eine anschließende Differenzierung leicht zu erreichen. Im Gegensatz dazu könnte die Monolayer-Methode in jeder Phase versagen. Von Tag 1 bis Tag 14 können adhärente Zellen in Flecken abfallen, was auf ein Versagen der Differenzierung hinweist. Normalerweise vermehren sich adhärente Zellen und bilden mehrschichtige adhärente Zellen. Nach dem 14. Tag würde die Monolayer-Methode immer noch scheitern, weil nur wenige Zellen an der Schale haften. An den Tagen 0-13 der Monolayer-Methode beobachteten wir verschiedene Zellmorphologien in der Schale. Die Zellmorphologie der EB-Methode an den Tagen 8-17 war jedoch homogen. Verglichen mit der Monolayer-Methode vermuten wir, dass die EB-Methode dem embryonalen Entwicklungsprozess ähnlicher ist und eine besser kontrollierbare programmierte Differenzierungsmethode ist.
Beide Methoden konnten für mehr als 20 Passagen verwendet werden und behielten dennoch eine schnelle Proliferationsfähigkeitbei 11. Die Kalziumablagerungen der osteogenen Differenzierung waren bei der Monolayer-Methode höher als bei der EB-Methode. Stammzellspezifisches Serum muss verwendet werden, um die Wirkung von Zytokinen im Serum auf die Differenzierung zu vermeiden. Wir beobachteten, dass die Zellen aufhörten, sich zu vermehren, wenn die Zelldichte zu gering war. Nach dem Erreichen der Konfluenz müssen die Zellen also in einem Split-Verhältnis von 1:3 durchlaufen werden. Bei der Differenzierung wurden keine Antibiotika eingesetzt; Daher ist die strikte Einhaltung der Guten Laborpraxis (GLP) für diesen Versuchsaufbau zwingend erforderlich.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass es für jede in diesem Protokoll getestete Methode Vor- und Nachteile gab. Beide Methoden können MSC aus hiPSCs erzeugen, die Wahl richtet sich nach den Anforderungen des Benutzers.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Wir sind allen ehemaligen und gegenwärtigen Mitgliedern des Mao- und Hu-Labors sehr dankbar für die interessanten Diskussionen und die großartigen Beiträge zum Projekt. Wir danken dem National Clinical Research Center for Child Health für die großartige Unterstützung. Diese Studie wurde finanziell unterstützt von der National Natural Science Foundation of China (U20A20351 an Jianhua Mao, 82200784 an Lidan Hu), der Natural Science Foundation der chinesischen Provinz Zhejiang (No. LQ22C070004 an Lidan Hu).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alizarin red staining kit | Beyotime Biotechnology | C0148S | |
| Anti-human-CD105 (PE) | Biolegend | 323206 | |
| Anti-human-CD34 (FITC) | Biolegend | 343503 | |
| Anti-human-CD45 (APC) | Biolegend | 304011 | |
| Anti-human-CD73( APC) | Biolegend | 344006 | |
| Anti-human-CD90 (FITC) | Biolegend | 328108 | |
| Ascorbic acid | Solarbio | A8100 | |
| BMP-6 | Novoprotein | C012 | |
| Carbon dioxide level shaker | Crystal | CO-06UC6 | |
| Compensation Beads | BioLegend | 424601 | |
| CryoStor CS10 | STEMCELL Technology | 07959 | |
| Dexamethasone | Beyotime Biotechnology | ST1254 | |
| DMEM/F12 medium | Servicebio | G4610 | |
| Fetal bovine serum | HAKATA | HS-FBS-500 | |
| FGF2 | Stemcell | 78003.1 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G2500-100G | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | |
| human IgG1 isotype control APC | BioLegend | 403505 | |
| human IgG1 isotype control FITC | BioLegend | 403507 | |
| human IgG1 isotype control PE | BioLegend | 403503 | |
| Human TGF-β1 | Stemcell | 78067 | |
| Human TruStain FcX | BioLegend | 422301 | |
| IBMX | Beyotime Biotechnology | ST1398 | |
| Indomethacin | Solarbio | SI9020 | |
| Insulin | Beyotime Biotechnology | P3376 | |
| iPSC maintenance medium | STEMCELL Technology | 85850 | |
| ITS Media Supplement | Beyotime Biotechnology | C0341-10mL | |
| Matrigel, growth factor reduced | BD Corning | 354230 | |
| Oli Red O staining kit | Beyotime Biotechnology | C0158S | |
| Proline | Solarbio | P0011 | |
| Sodium pyruvate | ThermoFisher | 11360-070 | |
| TGFβ3 | Novoprotein | CJ44 | |
| Toluidine blue staining kit | Solarbio | G2543 | |
| TrypLE Express Enzyme(1x) | Gibco | 12604013 | |
| Ultra-Low Attachment 6 Well Plate | Costar | 3471 | |
| Versene | Gibco | 15040-66 | |
| Y-27632 | Stemcell | 72304 | |
| α-MEM | Hyclone | SH30265 | |
| β-glycerophosphate | Solarbio | G8100 |
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