Summary
Dit protocol beschrijft en vergelijkt twee representatieve methoden voor het differentiëren van hiPSC's in mesenchymale stromale cellen (MSC's). De monolaagmethode wordt gekenmerkt door lagere kosten, eenvoudigere bediening en gemakkelijkere osteogene differentiatie. De embryoïde lichamen (EB's) methode wordt gekenmerkt door een lager tijdsverbruik.
Abstract
Mesenchymale stromale cellen (MSC's) zijn volwassen pluripotente stamcellen die op grote schaal worden gebruikt in de regeneratieve geneeskunde. Aangezien somatische weefsel-afgeleide MSC's worden beperkt door beperkte donatie, kwaliteitsvariaties en bioveiligheid, is er de afgelopen 10 jaar een grote toename geweest in de inspanningen om MSC's te genereren uit door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's). Eerdere en recente inspanningen in de differentiatie van hiPSC's in MSC's waren gecentreerd rond twee kweekmethodologieën: (1) de vorming van embryoïde lichamen (EB's) en (2) het gebruik van monolaagcultuur. Dit protocol beschrijft deze twee representatieve methoden voor het afleiden van MSC uit hiPSC's. Elke methode heeft zijn voor- en nadelen, waaronder tijd, kosten, celproliferatievermogen, de expressie van MSC-markers en hun vermogen tot differentiatie in vitro. Dit protocol toont aan dat beide methoden volwassen en functionele MSC's kunnen afleiden uit hiPSC's. De monolaagmethode wordt gekenmerkt door lagere kosten, eenvoudigere bediening en gemakkelijkere osteogene differentiatie, terwijl de EB-methode wordt gekenmerkt door een lager tijdsverbruik.
Introduction
Mesenchymale stromale cellen (MSC's) zijn van mesoderm afgeleide volwassen pluripotentestamcellen1. MSC's zijn aanwezig in bijna alle bindweefsels2. Sinds MSC's voor het eerst werden ontdekt in de jaren 1970 en met succes werden geïsoleerd uit het beenmerg in 1987 door Friedenstein et al.3,4,5, is een verscheidenheid aan menselijke somatische (inclusief foetale en volwassen) weefsels gebruikt voor het isoleren van MSC's zoals bot, kraakbeen, pezen, spieren, vetweefsel en hematopoëtisch ondersteunend stroma 1,2,6,7 . MSC's vertonen een hoog proliferatief vermogen en plasticiteit om te differentiëren in vele somatische cellijnen en kunnen migreren naar beschadigde en ontstoken weefsels 2,8,9. Deze eigenschappen maken MSC's een potentiële kandidaat voor regeneratieve geneeskunde10. Van somatisch weefsel afgeleide MSC's (st-MSC's) worden echter beperkt door beperkte donatie, beperkte celproliferatieve capaciteit, kwaliteitsvariaties en bezorgdheid over de bioveiligheid voor mogelijke overdracht van pathogenen, indien aanwezig, van de donoren 11,12.
Humane geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's) zijn afgeleid van volwassen cellen die herprogrammeren met transcriptiefactoren (Oct4, Sox2, Klf4 en c-Myc), die vergelijkbare functies hebben als embryonale stamcellen13,14. Ze kunnen zichzelf vernieuwen en hebben het potentieel om te differentiëren in elk type somatische cellen, inclusief MSC's. Vergeleken met st-MSC's hebben iPSC-MSC's het voordeel van onbeperkte levering, lagere kosten, hogere zuiverheid, gemak bij kwaliteitscontrole, gemakkelijk voor schaalproductie en genmodificatie 15,16,17.
Vanwege deze voordelen van iPSC-MSC's zijn er verschillende methoden gerapporteerd die MSC vanuit iPSC aansturen. Deze differentiatiemethoden zijn gecentreerd rond twee kweekmethoden: (1) de vorming van embryoïde lichamen (EB's) en (2) het gebruik van monolaagculturen 11,18,19,20. Hierin werd een representatieve benadering voor elk van de twee methodologieën gekenmerkt. Verder werd ook gebruik gemaakt van vergelijkingen tussen twee representatieve benaderingen op basis van tijd, kosten, proliferatievermogen, expressie van MSC-biomarkers en differentiatievermogen in vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. hiPSC's onderhoud
- Ontdooien van hiPSC
- Haal de cellen uit de vloeibare stikstof en ontdooi de cellen snel in een waterbad van 37 °C. Breng de ontdooicellen over in een buis van 15 ml die is voorbereid met 3 ml iPSC-onderhoudsmedium (materiaaltabel). Meng het medium voorzichtig.
- Centrifugeer op 300 x g gedurende 5 min. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen voorzichtig in 1 ml iPSC-onderhoudsmedium met 10 μM Y-27632 (pipetteer de cellen 2-3 keer op en neer).
- Breng de celsuspensie over in een weefselkweekplaat met 6 putjes bedekt met groeifactorgereduceerde (GFR)-extracellulaire matrixgel (1:100) en 2 ml iPSC-onderhoudsmedium met vooraf 10 μM Y-27632 toegevoegd (ongeveer 4 x 104 cellen/cm2).
- Kweek de cellen gedurende 5-6 dagen (80%-90% samenvloeiing) bij 37 °C, 5% CO2 met iPSC-onderhoudsmedia die elke dag worden ververst.
- Passage van hiPSC
- Verwijder het iPSC-onderhoudsmedium van de plaat met 6 putjes. Was de hiPSC's één keer met DPBS.
- Voeg 700-800 μL 0,48 mM EDTA-oplossing toe en incubeer gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur (RT) en verwijder vervolgens de digestieoplossing. Blijf 3-5 minuten incuberen bij een temperatuur van 37 °C.
- Wanneer cellen worden verteerd tot vellen (verteer cellen niet tot afzonderlijke cellen), voeg dan 1 ml iPSC-onderhoudsmedium toe met 10 μM Y-27632 om de spijsvertering te beëindigen. Pipeteer de cellen voorzichtig 2-3 keer op en neer.
- Breng de celsuspensie over in een weefselkweekplaat met 6 putjes die is gecoat met groeifactorgereduceerde (GFR)-extracellulaire matrixgel (1:100) en 2 ml iPSC-onderhoudsmedium waaraan vooraf 10 μM Y-27632 is toegevoegd.
OPMERKING: De passaging-verhouding varieert van 1:6 tot 1:20 (ongeveer 4 x 104 cellen/cm2), en de gemiddelde aggregatiegrootte is ongeveer 50-200 μm. - Kweek de cellen tot 80%-90% confluentie (5-6 dagen) bij 37 °C, 5% CO2 met iPSC-onderhoudsmedia die elke dag worden ververst.
2. Differentiatie van MSC's van hiPSC's via EB-vorming
OPMERKING: De methode is afgeleid van eerdere literatuur 21,22,23,24. Een overzicht van de methode wordt geïllustreerd in figuur 1. De kenmerken van de methode zijn samengevat in tabel 1.
- Bereiding van het medium
- Bereid MSC-differentiatiemedium voor door α-MEM aan te vullen met 1% (v/v) GlutaMAX, 10% (v/v) FBS, 10 ng/ml FGF2 en 5 ng/ml TGFβ.
- Bereid MSC-onderhoudsmedium voor door α-MEM aan te vullen met 1% (v/v) GlutMAX, 10% (v/v) FBS en 1 ng/ml FGF2.
- Voorbereiding van hiPSC's
- Kweek hiPSC-lijnen (passage ten minste 2-3 keer na ontdooiing) in iPSC-onderhoudsmedium op een weefselkweekplaat met 6 putjes bedekt met groeifactorgereduceerde (GFR)-extracellulaire matrixgel (1:100) bij 37 °C, 5% CO2 tot 80%-90% confluentie.
- Dag 0: EB-vorming
- Verwijder het iPSC-onderhoudsmedium van de plaat met 6 putjes. Was de hiPSC's één keer met DPBS.
- Voeg 700-800 μL 0,48 mM EDTA-oplossing toe en incubeer gedurende 1 minuut bij RT, verwijder vervolgens de digestieoplossing. Blijf 3-5 minuten incuberen bij een temperatuur van 37 °C.
- Wanneer cellen worden verteerd tot vellen (verteer cellen niet in afzonderlijke cellen), voeg dan 2 ml iPSC's onderhoudsmedium toe (met 10 μM Rock-remmer en 1:100 GFR-extracellulaire matrixgel) om de spijsvertering te beëindigen.
- Breng de cellen over naar een lage bevestigingsplaat met 6 putjes. Zaai de cellen in een verhouding van 2 putjes weefselkweekplaat tot 1 putje lage bevestigingsplaat. Incubeer de cellen in een shaker (60 rpm/min) bij 37 °C, 5% CO2 gedurende 24 uur om bolvormige EB's te vormen.
- Dag 1 - Dag 7: EB-differentiatie
- Breng de EB's over naar de centrifugebuis met een pasteurpipet (zonder EB's te vernietigen) en laat de EB's op natuurlijke wijze bezinken gedurende 5-10 minuten bij RT. Verwijder vervolgens het supernatant.
- Breng de EB's over naar een 6-wells lage bevestigingsplaat met 2 ml MSC-differentiatiemedium. Kweek de EB's op de shaker bij 37 °C, 5% CO2 gedurende 7 dagen met eenmaal gemiddelde verandering.
- Dag 8 - Dag 17: EB-inenting
- Breng de EB's over naar de centrifugebuis met een pasteurpipet (zonder EB's te vernietigen) en laat de EB's 5-10 minuten op natuurlijke wijze bezinken. Verwijder vervolgens het supernatant.
- Breng de EB's over naar een GFR-extracellulaire matrix-gelgecoate plaat met 6 putjes en 2 ml MSC-onderhoudsmedium. Kweek tot 90% confluentie (~10 dagen) met regelmatige mediaverandering na celadhesie.
- Dag 18 - Dag 27: MSC's rijping en expansie
- Behandel de EB-afgeleide kweek met een dissociatieoplossing bij 37 °C gedurende 5-10 minuten (de verteringstijd varieert door de aanwezigheid van verschillende celtypen).
- Wanneer een deel van de cellen is verteerd tot afzonderlijke cellen, voeg dan 2 ml van het MSC-onderhoudsmedium toe om de vertering te beëindigen en breng de celsuspensie over naar een centrifugebuis. Was de resterende onverteerde cellen eenmaal met DPBS en verteer opnieuw. Herhaal dit meerdere keren totdat alle cellen zijn verteerd tot enkele cellen. Centrifugeer de celsuspensie bij 250 x g gedurende 5 minuten en verwijder vervolgens het supernatant.
- Zaai de cellen op een met gelatine beklede kweekplaat (ongeveer 2 x 105 cellen/cm2). Kweek tot 90% samenvloeiing in MSC-onderhoudsmedium met regelmatige verandering van medium. Wijs deze generatie cellen op dit punt aan als doorgang 0 (P0).
- Om MSC zuiver en rijp te maken, moet u de cellen twee keer passeren in een splitverhouding van 1:3 in ongeveer 6 dagen. De meeste cellen vertonen een fibroblastachtige morfologie (spoelvormig).
3. Differentiatie van MSC's van hiPSC's via monolayercultuur
OPMERKING: De methode is afgeleid van eerdere literatuur 25,26,27,28. Een overzicht van deze methode wordt geïllustreerd in figuur 1. De kenmerken van de methode zijn samengevat in tabel 1.
- Bereiding van het medium
- Bereid het MSC-onderhoudsmedium voor door α-MEM aan te vullen met 1% (v/v) GlutMAX, 10% (v/v) FBS en 1 ng/ml FGF2.
- Voorbereiding van hiPSC's
- Kweek hiPSC-lijnen (passage ten minste 2-3 keer na ontdooiing) in het iPSC-onderhoudsmedium op een weefselkweekplaat met 6 putjes bedekt met groeifactorgereduceerde (GFR)-extracellulaire matrixgel (1:100) bij 37 °C, 5% CO2 tot 50%-60% confluentie.
- Dag 0-Dag 13: Differentiatie door directe monolaagculturen
- Verwijder het iPSC-onderhoudsmedium van de plaat met 6 putjes.
- Voeg direct 2 ml van het MSC-onderhoudsmedium toe en kweek gedurende 14 dagen bij 37 °C, 5% CO2 , waarbij het medium elke dag wordt ververst.
- Dag 14 - Dag 35: MSC's rijping door herhaalde passage
- Behandel de monolaagculturen met een dissociatieoplossing bij 37 °C gedurende 5-10 minuten (de verteringstijd varieert door de aanwezigheid van verschillende celtypen).
- Wanneer de cellen zijn verteerd tot afzonderlijke cellen, voegt u 2 ml MSC-onderhoudsmedium toe om de spijsvertering te beëindigen en brengt u de celsuspensie over naar de centrifugebuis. Was de resterende onverteerde cellen eenmaal met DPBS en verteer opnieuw. Herhaal dit meerdere keren totdat alle cellen zijn verteerd tot enkele cellen. Centrifugeer de celsuspensie bij 250 x g gedurende 5 minuten en verwijder vervolgens het supernatant.
- Zaai de cellen op een met gelatine beklede kweekschaal (ongeveer 2 x 105 cellen/cm2). Kweek tot 90% samenvloeiing in MSC-onderhoudsmedium met regelmatige mediawissels. Wijs deze generatie cellen op dit punt aan als doorgang 0 (P0).
- Om MSC zuiver en rijp te maken, moet u de cellen 6 keer passeren in een splitverhouding van 1:3 in ongeveer 18 dagen. De meeste cellen vertonen een fibroblastachtige morfologie (spoelvormig).
4. Oppervlakte-antigenenanalyse van hiPSC-aansturende MSC's door middel van flowcytometrie
OPMERKING: Vergelijkbaar met de oppervlakte-antigenen van van beenmerg afgeleide MSC's, brengen hiPSC's die MSC aansturen CD105, CD73 en CD90 tot expressie, maar brengen ze CD45, CD3429 niet tot expressie. Bovendien kunnen hiPSC's worden gebruikt als negatieve controlecellen. Oppervlakte-antigenenanalyse van hiPSC-aansturende MSC's en hiPSC's door middel van flowcytometrie wordt weergegeven in figuur 2.
- Behandel de hiPSC-rijdende MSC's gedurende 2-3 minuten met een dissociatieoplossing bij 37 °C. Behandel de hiPSC's met 0,48 mM EDTA-dissociatiereagens en incubeer gedurende 1 minuut bij RT, verwijder vervolgens het dissociatiereagens. Blijf 3-5 minuten incuberen bij een temperatuur van 37 °C.
- Wanneer de cellen zijn verteerd tot afzonderlijke cellen, voegt u medium toe (MSC-onderhoudsmedium aan MSC's en iPSC-onderhoudsmedium aan iPSC's) om de spijsvertering te beëindigen.
- Centrifugeer de celsuspensie op 350 x g gedurende 5 minuten en verwijder vervolgens het supernatant.
- Was de cellen eenmaal met koud DPBS, centrifugeer gedurende 5 minuten op 350 x g en verwijder vervolgens het supernatant.
- Tel en resuspendeer de cellen in koude 10% FBS-DPBS (v/v)-oplossing bij 10 x 106 cellen/ml en verdeel 100 μL/buisje celsuspensie (1 x 106 cellen/buisje) in centrifugebuisjes van 1,5 ml.
- Voeg 5 μL humane Fc-receptorblokkerende oplossing toe aan 100 μL celsuspensie. Incubeer gedurende 5-10 minuten bij RT om niet-specifieke blokkering uit te voeren.
- Centrifugeer gedurende 5 minuten op 350 x g en verwijder het supernatant. Was de cellen twee keer met een koude 2% FBS-DPBS (v/v) oplossing.
- Resuspendeer de cellen in koude 100 μL 2% FBS-DPBS (v/v)-oplossing.
- Voeg 5 μL (1 test) anti-CD34-FITC en 5 μL (1 test) anti-CD45-APC toe aan de 100 μL cel
Suspensie. Voeg 5 μL (1 test) anti-CD73-APC, 5 μL (1 test) anti-CD90-FITC en 5 μL (1 test) anti-CD105-PE toe aan nog een 100 μL celsuspensiebuis. Voeg 5 μL humane IgG1-isotypecontrole FITC, humane IgG1-isotypecontrole PE en humane IgG1-isotypecontrole APC toe aan de derde 100 μL-celsuspensiebuis. Incubeer gedurende 15-20 minuten op ijs in het donker. Bereid ondertussen enkelvoudige kleurkralen voor. - Was de cellen twee keer met een koude 2% FBS-DPBS (v/v) oplossing.
- Voeg 300 μL koude 2% FBS-DPBS (v/v)-oplossing toe om de cellen te resuspenderen en filtreer via een zeeffilter met 200 mazen.
- Analyseer de monsters met behulp van flowcytometrie. Analyseer de celsuspensie gekleurd met antilichamen voor isotypecontrole en stel de poort in. Analyseer vervolgens de celsuspensie die is gekleurd met doelantilichamen.
5. Osteogene differentiatie van hiPSC-rijdende MSC's
OPMERKING: De hiPSC-rijdende MSC's bezitten osteogeen differentiatiepotentieel (Figuur 3A, B). Het protocol voor osteogene differentiatie wordt hieronder gegeven.
- Bereid osteogeen inductiemedium voor door α-MEM aan te vullen met 10% FBS, 100 nM dexamethason, 10 mM bèta-glycerofosfaat en 100 μM ascorbinezuur.
- Zaai 1 x 105 MSC's in een met gelatine beklede plaat met 48 putjes en kweek tot het 60%-70% samenvloeiend is.
- Verwijder het medium en voeg 0,3 ml osteogeen inductiemedium toe. Kweek de cellen gedurende 14 dagen in een osteogeen inductiemedium bij 37 °C, 5% CO2, waarbij de media om de 3 dagen worden vervangen.
- Verwijder het medium en was één keer met DPBS.
- Voeg 0,3 ml 4% PFA toe en incubeer 30 minuten bij RT.
- PFA verwijderen. Spoel de cellen met 0,3 ml DPBS gedurende 10 minuten bij RT en herhaal 3 keer.
- Verwijder de DPBS, voeg 0,2 ml Alizarine rode kleuroplossing toe en incubeer gedurende 30 minuten bij RT.
- Verwijder de kleuroplossing, spoel de cellen met 0,3 ml DPBS gedurende 10 minuten bij RT en herhaal 3 keer.
- Observeer de kleuring van calciumafzetting onder een lichtmicroscoop.
6. Adipogene differentiatie van hiPSC-rijdende MSC's
OPMERKING: De hiPSC-sturende MSC's bezitten een adipogeen differentiatiepotentieel (Figuur 3C, D). Het protocol voor adipogene differentiatie wordt hieronder gegeven.
- Preparare adipogeen inductiemedium door α-MEM aan te vullen met 10% FBS, 1 μM dexamethason, 1 μM IBMX, 10 μg/ml insuline en 100 μM indomethacine. Bereid het adipogene onderhoudsmedium voor door α-MEM aan te vullen met 10% FBS en 10 μg/ml insuline.
- Zaai 1 x 105 MSC's in een met gelatine beklede plaat met 48 putjes en kweek tot de celdichtheid 90% bereikt.
- Verwijder het medium en voeg 0,3 ml adipogeen inductiemedium toe. Ga door met het kweken van de cellen in het adipogene inductiemedium gedurende 4 dagen bij 37 °C, 5% CO2.
- Verwijder het medium en voeg 0,3 ml adipogeen onderhoudsmedium toe. Ga door met het kweken van de cellen in het adipogene onderhoudsmedium gedurende 3 dagen bij 37 °C, 5% CO2.
- Herhaal stap 6.3 en 6.4 2-3 keer totdat de differentiatie en rijping van de adipocyten zijn verstreken.
- Verwijder het medium en was één keer met DPBS.
- Voeg 0,3 ml 4% PFA toe en incubeer gedurende 10 minuten bij RT. Verwijder de PFA en spoel 2 keer met DPBS.
- Breng Oli Red O-beits aan volgens de instructies van de fabrikant en observeer de lipidedruppeltjes onder een lichtmicroscoop.
7. Chondrogene differentiatie van hiPSC-rijdende MSC's
OPMERKING: De hiPSC-sturende MSC's bezitten chondrogene differentiatiepotentiaal (Figuur 3E, F). Het protocol voor chondrogene differentiatie wordt hieronder gegeven.
- Bereid chondroblast-inductiemedium voor door α-MEM aan te vullen met 10% FBS, 100 nM dexamethason, 1% insuline-transferrine-selenium (ITS), 10 μM ascorbinezuur, 1 mM natriumpyruvaat, 50 μg/ml proline, 0,02 nM transformerende groeifactor β3 (TGFβ3) en 0,5 μg/ml botmorfogenetisch eiwit 6 (BMP-6).
- Verzamel 2,5 x 105 hiPSC-aangedreven MSC's en centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten bij 150 x g en verwijder vervolgens het supernatant. Suspendeer de cellen in 1 ml α-MEM en centrifugeer vervolgens gedurende 5 minuten op 150 x g .
- Verwijder het supernatans en suspendeer de cellen in 0,5 ml chondrogenisch inductiemedium. Centrifugeer de cellen op 150 x g gedurende 5 min.
- Schroef het deksel direct los en kweek gedurende 21 dagen met chondrogene inductiemedia vervang elke 3 dagen bij 37 °C, 5% CO2. Draai zachtjes met de centrifugebuis om de chondrogene pellets elke dag tijdens de chondrogene differentiatie op te schorten (zonder chondrogene pellets te vernietigen).
- Verwijder het supernatans en was tweemaal met 0,5 ml PBS.
- Voeg 0,3 ml 4% PFA toe en fixeer gedurende 24 uur.
- Paraffine sluit de chondrogene pellets in en snijd ze vervolgens in stukken (3 μm). Kleur de secties gedurende 30 minuten in toluïdineblauw (1%).
- Observeer de extracellulaire chondrocytenmatrix onder een lichtmicroscoop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Volgens het protocol (Figuur 1A) werden hiPSC's gedifferentieerd in MSC's via de EB-vormings- en monolaagkweekmethoden. Tijdens de differentiatie vertoonden de cellen verschillende representatieve morfologieën (Figuur 1B,C).
Zoals te zien is in figuur 1B, vertonen de hiPSC-kolonies een typische compacte morfologie vóór differentiatie met een duidelijke grens die bestaat uit dicht opeengepakte cellen. Uniforme bolvormige EB's gevormd na hiPSC's die gedurende 24 uur op de shaker dissociëren en cultureren. Tijdens dag 1 tot dag 7 van de kweek in het differentiatiemedium van MSC's werd de gladde rand van EB ruw en werd het volume van EB groot. Van dag 8 tot dag 17, na het overbrengen van de EB's naar een GFR-extracellulaire matrix gel-gecoate 6-wells plaat, hechtten EB's zich geleidelijk aan de plaat en verspreidden veel aanhangende monolaagcellen zich rond de EB's. Toen de cellen op dag 18 90% confluentie bereikten, werden de cellen verteerd en gezaaid op een met gelatine beklede kweekplaat. Op dag 19 hechtte de cel zich en vertoonde een veelhoekige vorm. Achtereenvolgens werden de cellen twee keer gepasseerd toen ze voor 90% samenvloeiend waren. De afgeleide MSC's rijpten geleidelijk en vertoonden een typische spoelvorm, en de kolonie groeide in een werveling.
Zoals te zien is in figuur 1C, nam het volume van de cellen toe en verspreidde het zich over de kolonie na het vervangen van het iPSC-onderhoudsmedium door het MSC-onderhoudsmedium gedurende 24 uur. Terwijl ze werden gekweekt in een MSC-onderhoudsmedium, vermenigvuldigden de cellen zich geleidelijk en vormden ze meerlagige aanhangende cellen. Op dag 14 werden de cellen verteerd en gezaaid op een met gelatine beklede kweekplaat. Op dag 15 hechtte de cel zich en vertoonde een veelhoekige vorm. Achtereenvolgens werden de cellen 6 keer gepasseerd toen ze voor 90% samenvloeiend waren. De afgeleide MSC's rijpten geleidelijk en vertoonden een typische spoelvorm, en de kolonie groeide in een werveling.
De oppervlakte-antigenen van hiPSC's en hiPSC-sturende MSC's werden geanalyseerd door middel van flowcytometrie (Figuur 2). Zoals te zien is in figuur 2C, waren hiPSC's positief voor CD90 en negatief voor CD34, CD45, CD73 en CD105. Na het differentiëren van hiPSC's in MSC's via beide methoden, waren de sturende MSC's positief voor CD90, CD73 en CD105, en negatief voor CD34 en CD45 (Figuur 2A,B).
Het differentiatievermogen van hiPSC-rijdende MSC's werd onderzocht door osteogene, adipogene en chondrogene differentiatie. Zoals te zien is in figuur 3, differentieerden beide hiPSC-sturende MSC's van de twee methoden zich in osteoblast, adipocyt en chondrocyt. De hiPSC-sturende MSC's van de monolaagmethode vormden meer calciumafzettingen dan de EB-methode (Figuur 3B). De twee methoden hadden geen significant verschil in adipogene differentiatie en chondrogene differentiatiecapaciteit (Figuur 3D,F).
Het proliferatievermogen van hiPSC-rijdende MSC's werd onderzocht door middel van een continue passagecultuur. Zoals te zien is in figuur 3G, kunnen de hiPSC-sturende MSC's van beide methoden meer dan 20 passages worden gepasseerd en behouden ze toch een snel proliferatievermogen.
De vergelijking tussen de twee benaderingen in tabel 1 is gebaseerd op differentiatietijd, kosten, celproliferatievermogen, expressie van MSC-markers en hun differentiatievermogen in vitro.
Figuur 1: Differentiëring van hiPSC's in MSC's via EB-vormingsmethode en monolaagcultuurmethode. (A) Schema van de differentiatie van hiPSC's in MSC's via EB-vorming en monolaagcultuur. Representatiemorfologie van cellen op belangrijke fagen tijdens MSC's afleiding van hiPSC's via (B) EB-vorming en (C) monolaagcultuur. Schaalbalken: 300 μm en 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: hiPSC-aansturende MSC's oppervlakte-antigenenanalyse door middel van flowcytometrie. Expressiepercentages van MSC-oppervlakteantigenen in iPSC-sturende MSC's via (A) EB-vorming en (B) monolaagcultuur. (C) hiPSC's werden gebruikt als negatieve controle. MSC's negatieve markers: CD34, CD45; MSC's positieve markers: CD73, CD90 en CD105. hiPSC's negatieve markers: CD34, CD45, CD73 en CD105; hiPSC's positieve markers: CD90. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Drielijns differentiatie en proliferatievermogen van hiPSC-sturende MSC's. (A) Alizarinerode kleuring van calciumafzettingen van hiPSC-rijdende MSC's in osteogeen differentiatiemedium gedurende 2 weken. Schaalbalken: 300 μm. (B) Kwantificering van Alizarinerode S-kleuring door ImageJ-analyse. (C) Olirode O-kleuring van lipidedruppeltjes van hiPSC-rijdende MSC's in adipogeen differentiatiemedium gedurende 2 weken. Schaalbalken: 300 μm. (D) Kwantificering van Oli Red O-kleuring door ImageJ-analyse. (E) Toluïdineblauwe kleuring van extracellulaire chondrocytenmatrix. Schaalbalken: 300 μm en 150 μm. (F) Kwantificering van toluïdineblauwkleuring door middel van ImageJ-analyse. (G) berekening van de populatieverdubbeling van de populatie van hiPSC-rijdende MSC's. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Vergelijking | EB-vormingsmethode | Monolayer culturen methode |
| Differentiatie tijd | 27 dagen | 35 dagen |
| Kosten | Hoog | Laag |
| Proliferatie snelheid | Snel | Snel |
| Proliferatie vermogen | ≥20 doorgang | ≥20 doorgang |
| Expressie van MSC-markers | CD73/CD90/CD105 positief, CD34/CD45 nagatief | CD73/CD90/CD105 positief, CD34/CD45 nagatief |
| Mogelijkheid tot differentiatie | Adipogene differentiatie, chondrogene differentiatie en osteogene differentiatie | Adipogene differentiatie, chondrogene differentiatie en sterker osteogeen differentiatievermogen |
| Operatie | Gecompliceerd | Eenvoudig |
Tabel 1: Kenmerken van de twee methoden voor het differentiëren van hiPSC's in MSC's.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit protocol werden twee representatieve methoden onderzocht om hiPSC's te differentiëren in MSC's: 20,21,22,23,24,25,26,27,28,30. Beide methoden waren in staat om MSC's af te leiden uit hiPSC's. De hiPSC-afgeleide MSC's werden bevestigd door celmorfologie (Figuur 1), oppervlakte-antigenen (Figuur 2) en hun vermogen om te differentiëren (Figuur 3).
Beide methoden deelden hetzelfde MSC-onderhoudsmedium, terwijl de EB-methode ook een MSC-differentiatiemedium nodig had met TGF-β en FGF2. Bovendien vereiste de EB-methode een lage bevestiging van 6 putplaten en een speciale shaker die in een kooldioxide-incubator kan worden geplaatst. Daarom waren de kosten van de EB-methode hoger dan die van de monolaagmethode18,20. De EB-methode leek ingewikkelder dan de monolayer-methode. De differentiatietijd van de EB-methode was echter korter, waardoor meerdere passages om MSC's te verrijken werden vermeden.
We ontdekten dat de tolerantie voor omgevingsomstandigheden van de EB-methode sterker was dan die van de monolaagmethode. Beide methoden werden beïnvloed door de iPSC-status, menselijke tussenkomst en kweekomgeving11,20. We ontdekten echter dat de succesratio van de EB-methode veel hoger was dan die van de monolayer-methode. De belangrijkste fase van de EB-methode was de EB-differentiatiefase van dag 1 tot dag 7. Tijdens dag 1-7, als EB's geleidelijk kleiner worden of breken met veel zwevende dode cellen in het kweekmedium of vacuolaat-EB's vormen, hebben deze ongekwalificeerde EB's moeite om zich aan de gelatineplaat te hechten en kruipen er weinig of geen aanhangende cellen uit de EB's. Van dag 1 tot dag 7 waren gekwalificeerde EB's uniform en zouden ze iets vergroot zijn, waarvan de gladde randen geleidelijk ruw werden met uitstekende cellen. Nadat ze op de gelatineplaat waren overgebracht, hechtten de EB's zich snel aan de plaat en verspreidden veel aanhangende monolaagcellen zich rond de EB's. Als EB's tijdens dag 1-7 worden gekwalificeerd, is latere differentiatie gemakkelijk te bereiken. Daarentegen kan de monolaagmethode in elk stadium mislukken. Van dag 1 tot dag 14 kunnen aanhangende cellen in vlekken afvallen, wat wijst op een falen van differentiatie. Normaal gesproken vermenigvuldigen aanhangende cellen zich en vormen ze meerlagige aanhangende cellen. Na dag 14 zou de monolayer-methode nog steeds mislukken omdat er weinig cellen aan de schotel vastzitten. Tijdens dag 0-13 van de monolaagmethode observeerden we verschillende celmorfologie in de schaal. De celmorfologie van de EB-methode op dag 8-17 was echter homogeen. In vergelijking met de monolayer-methode vermoeden we dat de EB-methode meer lijkt op het embryonale ontwikkelingsproces en een meer controleerbare geprogrammeerde differentiatiemethode is.
Beide methoden kunnen voor meer dan 20 passages worden gebruikt en behouden toch een snel proliferatievermogen11. De calciumafzettingen van osteogene differentiatie in de monolaagmethode waren groter dan die van de EB-methode. Stamcelspecifiek serum moet worden gebruikt om het effect van cytokines in het serum op differentiatie te voorkomen. We zagen dat de cellen zouden stoppen met prolifereren als de celdichtheid te laag was. Dus na het bereiken van samenvloeiing moeten de cellen worden gepasseerd in een splitsingsverhouding van 1:3. Tijdens de differentiatie werden geen antibiotica gebruikt; daarom is strikte naleving van goede laboratoriumpraktijken (GLP) verplicht voor deze experimentele opstelling.
Concluderend waren er voor- en nadelen voor elke methode die in dit protocol werd getest. Beide methoden kunnen MSC genereren uit hiPSC's, de keuze is gebaseerd op de wensen van de gebruiker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We zijn alle leden van het Mao en Hu Lab, vroeger en nu, enorm dankbaar voor de interessante discussies en geweldige bijdragen aan het project. We zijn het National Clinical Research Center for Child Health dankbaar voor de geweldige steun. Deze studie werd financieel ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (U20A20351 aan Jianhua Mao, 82200784 aan Lidan Hu), de Natural Science Foundation van de provincie Zhejiang in China (nr. LQ22C070004 naar Lidan Hu).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alizarin red staining kit | Beyotime Biotechnology | C0148S | |
| Anti-human-CD105 (PE) | Biolegend | 323206 | |
| Anti-human-CD34 (FITC) | Biolegend | 343503 | |
| Anti-human-CD45 (APC) | Biolegend | 304011 | |
| Anti-human-CD73( APC) | Biolegend | 344006 | |
| Anti-human-CD90 (FITC) | Biolegend | 328108 | |
| Ascorbic acid | Solarbio | A8100 | |
| BMP-6 | Novoprotein | C012 | |
| Carbon dioxide level shaker | Crystal | CO-06UC6 | |
| Compensation Beads | BioLegend | 424601 | |
| CryoStor CS10 | STEMCELL Technology | 07959 | |
| Dexamethasone | Beyotime Biotechnology | ST1254 | |
| DMEM/F12 medium | Servicebio | G4610 | |
| Fetal bovine serum | HAKATA | HS-FBS-500 | |
| FGF2 | Stemcell | 78003.1 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G2500-100G | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | |
| human IgG1 isotype control APC | BioLegend | 403505 | |
| human IgG1 isotype control FITC | BioLegend | 403507 | |
| human IgG1 isotype control PE | BioLegend | 403503 | |
| Human TGF-β1 | Stemcell | 78067 | |
| Human TruStain FcX | BioLegend | 422301 | |
| IBMX | Beyotime Biotechnology | ST1398 | |
| Indomethacin | Solarbio | SI9020 | |
| Insulin | Beyotime Biotechnology | P3376 | |
| iPSC maintenance medium | STEMCELL Technology | 85850 | |
| ITS Media Supplement | Beyotime Biotechnology | C0341-10mL | |
| Matrigel, growth factor reduced | BD Corning | 354230 | |
| Oli Red O staining kit | Beyotime Biotechnology | C0158S | |
| Proline | Solarbio | P0011 | |
| Sodium pyruvate | ThermoFisher | 11360-070 | |
| TGFβ3 | Novoprotein | CJ44 | |
| Toluidine blue staining kit | Solarbio | G2543 | |
| TrypLE Express Enzyme(1x) | Gibco | 12604013 | |
| Ultra-Low Attachment 6 Well Plate | Costar | 3471 | |
| Versene | Gibco | 15040-66 | |
| Y-27632 | Stemcell | 72304 | |
| α-MEM | Hyclone | SH30265 | |
| β-glycerophosphate | Solarbio | G8100 |
References
- Weng, Z., et al. Mesenchymal stem/stromal cell senescence: Hallmarks, mechanisms, and combating strategies. Stem Cells Translational Medicine. 11 (4), 356-371 (2022).
- Soliman, H., et al. Multipotent stromal cells: One name, multiple identities. Cell Stem Cell. 28 (10), 1690-1707 (2021).
- Friedenstein, A. J., Chailakhyan, R. K., Gerasimov, U. V. Bone marrow osteogenic stem cells: in vitro cultivation and transplantation in diffusion chambers. Cell and Tissue Kinetics. 20 (3), 263-272 (1987).
- Friedenstein, A. J., et al. Precursors for fibroblasts in different populations of hematopoietic cells as detected by the in vitro colony assay method. Experimental Hematology. 2 (2), 83-92 (1974).
- Friedenstein, A. J., Gorskaja, J. F., Kulagina, N. N. Fibroblast precursors in normal and irradiated mouse hematopoietic organs. Experimental Hematology. 4 (5), 267-274 (1976).
- El Agha, E., et al. Mesenchymal stem cells in fibrotic disease. Cell Stem Cell. 21 (2), 166-177 (2017).
- Mushahary, D., Spittler, A., Kasper, C., Weber, V., Charwat, V. Isolation, cultivation, and characterization of human mesenchymal stem cells. Cytometry A. 93 (1), 19-31 (2018).
- Ullah, M., Liu, D. D., Thakor, A. S. Mesenchymal stromal cell homing: Mechanisms and strategies for improvement. iScience. 15, 421-438 (2019).
- Regmi, S., et al. Enhanced viability and function of mesenchymal stromal cell spheroids is mediated via autophagy induction. Autophagy. 17 (10), 2991-3010 (2021).
- Hoang, D. M., et al. Stem cell-based therapy for human diseases. Signal Transduction and Targeted Therapy. 7 (1), 272 (2022).
- Jiang, B., et al. Concise review: Mesenchymal stem cells derived from human pluripotent cells, an unlimited and quality-controllable source for therapeutic applications. Stem Cells. 37 (5), 572-581 (2019).
- Soontararak, S., et al. Mesenchymal stem cells (MSC) derived from induced pluripotent stem cells (iPSC) equivalent to adipose-derived MSC in promoting intestinal healing and microbiome normalization in mouse inflammatory bowel disease model. Stem Cells Translational Medicine. 7 (6), 456-467 (2018).
- Di Baldassarre, A., Cimetta, E., Bollini, S., Gaggi, G., Ghinassi, B. Human-induced pluripotent stem cell technology and cardiomyocyte generation: Progress and clinical applications. Cells. 7 (6), 48 (2018).
- Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress. Nature Reviews. Drug Discovery. 16 (2), 115-130 (2017).
- Levy, O., et al. Shattering barriers toward clinically meaningful MSC therapies. Science Advances. 6 (30), eaba6884 (2020).
- Zhao, C., Ikeya, M. Generation and applications of induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells International. 2018, 9601623 (2018).
- Path, G., Perakakis, N., Mantzoros, C. S., Seufert, J. Stem cells in the treatment of diabetes mellitus - Focus on mesenchymal stem cells. Metabolism. 90, 1-15 (2019).
- Zhou, Y., et al. One-step derivation of functional mesenchymal stem cells from human pluripotent stem cells. Bio-Protocol. 8 (22), e3080 (2018).
- Hua, Z., et al. Low-intensity pulsed ultrasound promotes osteogenic potential of iPSC-derived MSCs but fails to simplify the iPSC-EB-MSC differentiation process. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 841778 (2022).
- Dupuis, V., Oltra, E. Methods to produce induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells: Mesenchymal stem cells from induced pluripotent stem cells. World Journal of Stem Cells. 13 (8), 1094-1111 (2021).
- Zhang, W., et al. Aging stem cells. A Werner syndrome stem cell model unveils heterochromatin alterations as a driver of human aging. Science. 348 (6239), 1160-1163 (2015).
- Liu, G. H., et al. Modelling Fanconi anemia pathogenesis and therapeutics using integration-free patient-derived iPSCs. Nature Communications. 5, 4330 (2014).
- Kubben, N., et al. Repression of the antioxidant NRF2 pathway in premature aging. Cell. 165 (6), 1361-1374 (2016).
- Duan, S., et al. PTEN deficiency reprogrammes human neural stem cells towards a glioblastoma stem cell-like phenotype. Nature Communications. 6, 10068 (2015).
- Zhang, J., et al. Exosomes released from human induced pluripotent stem cells-derived MSCs facilitate cutaneous wound healing by promoting collagen synthesis and angiogenesis. Journal of Translational Medicine. 13, 49 (2015).
- Hu, G. W., et al. Exosomes secreted by human-induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells attenuate limb ischemia by promoting angiogenesis in mice. Stem Cell Research & Therapy. 6 (1), 10 (2015).
- Kang, R., et al. Mesenchymal stem cells derived from human induced pluripotent stem cells retain adequate osteogenicity and chondrogenicity but less adipogenicity. Stem Cell Research & Therapy. 6 (1), 144 (2015).
- Wang, L. T., et al. Differentiation of mesenchymal stem cells from human induced pluripotent stem cells results in downregulation of c-Myc and DNA replication pathways with immunomodulation toward CD4 and CD8 cells. Stem Cells. 36 (6), 903-914 (2018).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Kim, S., Kim, T. M. Generation of mesenchymal stem-like cells for producing extracellular vesicles. World Journal of Stem Cells. 11 (5), 270-280 (2019).
