Summary
Questo protocollo descrive e confronta due metodi rappresentativi per differenziare le hiPSC in cellule stromali mesenchimali (MSC). Il metodo monostrato è caratterizzato da un costo inferiore, da un funzionamento più semplice e da una più facile differenziazione osteogenica. Il metodo dei corpi embrioidi (EBs) è caratterizzato da un minor consumo di tempo.
Abstract
Le cellule stromali mesenchimali (MSC) sono cellule staminali pluripotenti adulte che sono state ampiamente utilizzate nella medicina rigenerativa. Poiché le MSC derivate da tessuti somatici sono limitate da donazioni limitate, variazioni di qualità e biosicurezza, negli ultimi 10 anni si è assistito a un grande aumento degli sforzi per generare MSC da cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC). Gli sforzi passati e recenti nella differenziazione delle hiPSC in MSC sono stati incentrati su due metodologie di coltura: (1) la formazione di corpi embrioidi (EB) e (2) l'uso di colture monostrato. Questo protocollo descrive questi due metodi rappresentativi per derivare le MSC dalle hiPSC. Ogni metodo presenta i suoi vantaggi e svantaggi, tra cui il tempo, il costo, la capacità di proliferazione cellulare, l'espressione dei marcatori MSC e la loro capacità di differenziazione in vitro. Questo protocollo dimostra che entrambi i metodi possono derivare MSC mature e funzionali dalle hiPSC. Il metodo monostrato è caratterizzato da un costo inferiore, da un funzionamento più semplice e da una più facile differenziazione osteogenica, mentre il metodo EB è caratterizzato da un minor consumo di tempo.
Introduction
Le cellule stromali mesenchimali (MSC) sono cellule staminali pluripotenti adulte derivate dal mesoderma1. Le MSC sono presenti in quasi tutti i tessuti connettivi2. Da quando le MSC sono state scoperte per la prima volta negli anni '70 e isolate con successo dal midollo osseo nel 1987 da Friedenstein et al.3,4,5, una varietà di tessuti somatici umani (inclusi fetali e adulti) sono stati utilizzati per isolare le MSC come ossa, cartilagine, tendini, muscoli, tessuto adiposo e stroma di supporto ematopoietico 1,2,6,7. Le MSC dimostrano elevate capacità proliferative e plasticità per differenziarsi in molte linee cellulari somatiche e potrebbero migrare verso tessuti danneggiati e infiammati 2,8,9. Queste proprietà rendono le MSC un potenziale candidato per la medicina rigenerativa10. Tuttavia, le MSC derivate da tessuti somatici (st-MSC) sono limitate da una donazione limitata, da una limitata capacità proliferativa cellulare, da variazioni di qualità e da preoccupazioni di biosicurezza per la possibile trasmissione di agenti patogeni, se presenti, dai donatori11,12.
Le cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC) derivano dalla riprogrammazione di cellule adulte con fattori di trascrizione (Oct4, Sox2, Klf4 e c-Myc), che hanno funzioni simili a quelle delle cellule staminali embrionali13,14. Possono auto-rinnovarsi e possedere il potenziale di differenziarsi in qualsiasi tipo di cellule somatiche, comprese le MSC. Rispetto alle st-MSC, le iPSC-MSC hanno il vantaggio di una fornitura illimitata, un costo inferiore, una maggiore purezza, convenienza nel controllo di qualità, facile per la produzione su larga scala e la modificazione genica 15,16,17.
A causa di questi vantaggi delle iPSC-MSC, sono stati riportati una varietà di metodi che guidano le MSC dalle iPSC. Questi metodi di differenziazione sono stati incentrati su due metodologie di coltura: (1) la formazione di corpi embrioidi (EB) e (2) l'uso di colture monostrato 11,18,19,20. In questo caso, è stato caratterizzato un approccio rappresentativo per ciascuna delle due metodologie. Inoltre, sono stati effettuati confronti tra due approcci rappresentativi basati su tempo, costo, capacità proliferativa, espressione di biomarcatori MSC e capacità di differenziazione in vitro.
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Protocol
1. Mantenimento delle hiPSCs
- Scongelamento di hiPSC
- Estrarre le celle dall'azoto liquido e scongelarle rapidamente a bagnomaria a 37 °C. Trasferire le cellule di scongelamento in una provetta da 15 mL preparata con 3 mL di terreno di mantenimento iPSC (Tabella dei materiali). Mescolare delicatamente il mezzo.
- Centrifugare a 300 x g per 5 min. Rimuovere il surnatante e risospendere delicatamente le cellule in 1 mL di terreno di mantenimento iPSC con 10 μM Y-27632 (pipettare le cellule su e giù 2-3 volte).
- Trasferire la sospensione cellulare in una piastra di coltura tissutale a 6 pozzetti rivestita con gel di matrice extracellulare ridotto al fattore di crescita (GFR) (1:100) e 2 mL di terreno di mantenimento con 10 μM Y-27632 aggiunti in anticipo (circa 4 x 104 cellule/cm2).
- Coltivare le cellule per 5-6 giorni (confluenza 80%-90%) a 37 °C, 5% di CO2 con iPSC che cambiano terreno di mantenimento ogni giorno.
- Passaggio di hiPSC
- Rimuovere il terreno di mantenimento iPSC dalla piastra a 6 pozzetti. Lavare le hiPSC una volta con DPBS.
- Aggiungere 700-800 μL di soluzione di EDTA 0,48 mM e incubare per 1 minuto a temperatura ambiente (RT), quindi rimuovere la soluzione di digestione. Continuare l'incubazione a 37 °C per 3-5 minuti.
- Quando le cellule vengono digerite in fogli (non digerire le cellule in cellule singole), aggiungere 1 mL di terreno di mantenimento iPSC con 10 μM Y-27632 per terminare la digestione. Pipettare con cura le cellule su e giù 2-3 volte.
- Trasferire la sospensione cellulare in una piastra di coltura tissutale a 6 pozzetti rivestita con gel di matrice extracellulare ridotto al fattore di crescita (GFR) (1:100) e 2 mL di terreno di mantenimento iPSC con 10 μM Y-27632 aggiunti in anticipo.
NOTA: Il rapporto di passaggio varia da 1:6 a 1:20 (circa 4 x 104 cellule/cm2) e la dimensione media dell'aggregazione è di circa 50-200 μm. - Coltivare le cellule fino all'80%-90% di confluenza (5-6 giorni) a 37 °C, 5% di CO2 con cambio di terreno di mantenimento iPSC ogni giorno.
2. Differenziazione delle MSC dalle hiPSC attraverso la formazione di EB
NOTA: Il metodo è derivato dalla letteratura precedente 21,22,23,24. Una panoramica del metodo è illustrata nella Figura 1. Le caratteristiche del metodo sono riassunte nella Tabella 1.
- Preparazione del mezzo
- Preparare il terreno di differenziazione delle MSC integrando α-MEM con l'1% (v/v) di GlutaMAX, il 10% (v/v) di FBS, 10 ng/mL di FGF2 e 5 ng/mL di TGFβ.
- Preparare il terreno di mantenimento delle MSC integrando α-MEM con l'1% (v/v) di GlutMAX, il 10% (v/v) di FBS e 1 ng/mL di FGF2.
- Preparazione di hiPSC
- Linee di colture di hiPSCs (passaggio almeno 2-3 volte dopo lo scongelamento) in terreno di mantenimento iPSC su una piastra di coltura tissutale a 6 pozzetti rivestita con gel di matrice extracellulare ridotto al fattore di crescita (GFR) (1:100) a 37 °C, 5% di CO2 fino all'80%-90% di confluenza.
- Giorno 0: Formazione EB
- Rimuovere il terreno di mantenimento iPSC dalla piastra a 6 pozzetti. Lavare le hiPSC una volta con DPBS.
- Aggiungere 700-800 μL di soluzione di EDTA 0,48 mM e incubare per 1 minuto a RT, quindi rimuovere la soluzione di digestione. Continuare l'incubazione a 37 °C per 3-5 minuti.
- Quando le cellule vengono digerite in fogli (non digerire le cellule in singole cellule), aggiungere 2 mL di terreno di mantenimento delle iPSCs (contenente 10 μM di inibitore della roccia e 1:100 GFR- gel della matrice extracellulare) per terminare la digestione.
- Trasferire le cellule in una piastra di attacco bassa a 6 pozzetti. Seminare le cellule in un rapporto di 2 pozzetti di piastra di coltura tissutale e 1 pozzetto di piastra a basso attacco. Incubare le cellule in un agitatore (60 giri/min) a 37 °C, 5% di CO2 per 24 ore per formare EB sferici.
- Giorno 1-Giorno 7: Differenziazione EB
- Trasferire gli EB nella provetta da centrifuga con una pipetta Pasteur (senza distruggere gli EB) e lasciare sedimentare naturalmente gli EB per 5-10 minuti a RT. Quindi, rimuovere il surnatante.
- Trasferire gli EB su una piastra di attacco bassa a 6 pozzetti con 2 mL di terreno di differenziazione MSC. Coltivare gli EB sull'agitatore a 37 °C, 5% di CO2 per 7 giorni con cambio di terreno una volta.
- Giorno 8-Giorno 17: Inoculazione EB
- Trasferire gli EB nella provetta da centrifuga con una pipetta Pasteur (senza distruggere gli EB) e lasciare sedimentare naturalmente per 5-10 minuti. Quindi, rimuovere il surnatante.
- Trasferire gli EB in una piastra a 6 pozzetti rivestita di gel con matrice extracellulare GFR con 2 mL di terreno di mantenimento MSC. Coltura fino al 90% di confluenza (~10 giorni) con cambio regolare del terreno dopo l'adesione cellulare.
- Giorno 18-Giorno 27: Maturazione ed espansione delle MSC
- Trattare la coltura derivata da EB con una soluzione di dissociazione a 37 °C per 5-10 minuti (il tempo di digestione varia a causa della presenza di diversi tipi di cellule).
- Quando una parte delle cellule viene digerita in singole cellule, aggiungere 2 mL del terreno di mantenimento MSC per terminare la digestione e trasferire la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga. Lavare le cellule rimanenti non digerite una volta con DPBS e digerire di nuovo. Ripetere più volte fino a quando tutte le cellule sono digerite in singole cellule. Centrifugare la sospensione cellulare a 250 x g per 5 minuti, quindi rimuovere il surnatante.
- Seminare le cellule su una piastra di coltura ricoperta di gelatina (circa 2 x 105 cellule/cm2). Coltura fino al 90% di confluenza nel terreno di mantenimento MSC con cambio regolare del terreno. Designare questa generazione di celle come passaggio 0 (P0) a questo punto.
- Per rendere le MSC pure e mature, continuare a far passare le cellule due volte con un rapporto di divisione di 1:3 in circa 6 giorni. La maggior parte delle cellule presenta una morfologia simile a quella dei fibroblasti (a forma di fuso).
3. Differenziazione delle MSC dalle hiPSC tramite coltura monostrato
NOTA: Il metodo è derivato dalla letteratura precedente 25,26,27,28. Una panoramica di questo metodo è illustrata nella Figura 1. Le caratteristiche del metodo sono riassunte nella Tabella 1.
- Preparazione del mezzo
- Preparare il terreno di mantenimento MSC integrando α-MEM con l'1% (v/v) di GlutMAX, il 10% (v/v) di FBS e 1 ng/mL di FGF2.
- Preparazione di hiPSC
- Linee di colture di hiPSCs (passaggio almeno 2-3 volte dopo lo scongelamento) nel terreno di mantenimento delle iPSC su una piastra di coltura tissutale a 6 pozzetti rivestita con gel di matrice extracellulare ridotto al fattore di crescita (GFR) (1:100) a 37 °C, 5% di CO2 fino al 50%-60% di confluenza.
- Giorno 0-Giorno 13: Differenziazione mediante colture monostrato dirette
- Rimuovere il terreno di mantenimento iPSC dalla piastra a 6 pozzetti.
- Aggiungere direttamente 2 mL del terreno di mantenimento MSC e la coltura per 14 giorni a 37 °C, 5% di CO2, cambiando il terreno ogni giorno.
- Giorno 14-Giorno 35: Maturazione delle MSC per passaggio ripetuto
- Trattare le colture monostrato con una soluzione di dissociazione a 37 °C per 5-10 minuti (il tempo di digestione varia a causa della presenza di diversi tipi di cellule).
- Quando le cellule vengono digerite in singole cellule, aggiungere 2 mL di terreno di mantenimento MSC per terminare la digestione e trasferire la sospensione cellulare nella provetta da centrifuga. Lavare le cellule rimanenti non digerite una volta con DPBS e digerire di nuovo. Ripetere più volte fino a quando tutte le cellule sono digerite in singole cellule. Centrifugare la sospensione cellulare a 250 x g per 5 minuti, quindi rimuovere il surnatante.
- Seminare le cellule su un piatto di coltura ricoperto di gelatina (circa 2 x 105 cellule/cm2). Coltura fino al 90% di confluenza nel terreno di mantenimento MSC con cambio regolare dei terreni. Designare questa generazione di celle come passaggio 0 (P0) a questo punto.
- Per rendere le MSC pure e mature, continuare a far passare le cellule 6 volte con un rapporto di divisione 1:3 in circa 18 giorni. La maggior parte delle cellule presenta una morfologia simile a quella dei fibroblasti (a forma di fuso).
4. Analisi degli antigeni di superficie delle MSC che guidano le hiPSC mediante citometria a flusso
NOTA: Analogamente agli antigeni di superficie delle MSC derivate dal midollo osseo, le MSC che guidano le hiPSC esprimono CD105, CD73 e CD90, ma non esprimono CD45, CD3429. Inoltre, le hiPSC possono essere utilizzate come cellule di controllo negativo. L'analisi degli antigeni di superficie delle MSC e delle hiPSC che guidano le hiPSC mediante citometria a flusso è mostrata nella Figura 2.
- Trattare le MSC che guidano le hiPSC con una soluzione di dissociazione a 37 °C per 2-3 minuti. Trattare le hiPSC con un reagente di dissociazione EDTA 0,48 mM e incubare per 1 minuto a RT, quindi rimuovere il reagente di dissociazione. Continuare l'incubazione a 37 °C per 3-5 minuti.
- Quando le cellule vengono digerite in singole cellule, aggiungere il terreno (terreno di mantenimento MSC alle MSC e mezzo di mantenimento iPSC alle iPSC) per terminare la digestione.
- Centrifugare la sospensione cellulare a 350 x g per 5 minuti, quindi rimuovere il surnatante.
- Lavare le cellule una volta con DPBS freddo, centrifugare a 350 x g per 5 minuti, quindi rimuovere il surnatante.
- Contare e risospendere le cellule in una soluzione fredda di FBS-DPBS al 10% (v/v) a 10 x 106 cellule/mL e distribuire 100 μL/provetta di sospensione cellulare (1 x 106 cellule/provetta) in provette da centrifuga da 1,5 mL.
- Aggiungere 5 μL di soluzione bloccante il recettore Fc umano a 100 μL di sospensione cellulare. Incubare per 5-10 minuti a RT per eseguire un blocco aspecifico.
- Centrifugare a 350 x g per 5 min e rimuovere il surnatante. Lavare le celle due volte con una soluzione fredda di FBS-DPBS (v/v) al 2%.
- Risospendere le cellule in 100 μL freddi di soluzione FBS-DPBS (v/v) al 2%.
- Aggiungere 5 μL (1 test) di anti-CD34-FITC e 5 μL (1 test) di anti-CD45-APC alla cella da 100 μL
Sospensione. Aggiungere 5 μL (1 test) di anti-CD73-APC, 5 μL (1 test) di anti-CD90-FITC e 5 μL (1 test) di anti-CD105-PE a un'altra provetta di sospensione cellulare da 100 μL. Aggiungere 5 μL di FITC per il controllo dell'isotipo delle IgG1 umane, PE per il controllo dell'isotipo delle IgG1 umane e APC per il controllo dell'isotipo delle IgG1 umane alla terza provetta di sospensione cellulare da 100 μL. Incubare per 15-20 minuti su ghiaccio al buio. Nel frattempo, prepara le perline monocoloranti. - Lavare le celle due volte con una soluzione fredda di FBS-DPBS (v/v) al 2%.
- Aggiungere 300 μL di soluzione fredda FBS-DPBS al 2% (v/v) per risospendere le celle e filtrare tramite un filtro a rete da 200 mesh.
- Analizzare i campioni utilizzando la citometria a flusso. Analizzare la sospensione cellulare colorata con anticorpi di controllo isotipo e impostare il gate. Quindi analizza la sospensione cellulare colorata con anticorpi bersaglio.
5. Differenziamento osteogenico delle MSC che guidano le hiPSC
NOTA: Le MSC che guidano le hiPSC possiedono un potenziale di differenziazione osteogenica (Figura 3A, B). Di seguito è riportato il protocollo per la differenziazione osteogenica.
- Preparare il terreno di induzione osteogenico integrando α-MEM con il 10% di FBS, 100 nM di desametasone, 10 mM di beta-glicerofosfato e 100 μM di acido ascorbico.
- Seminare 1 x 105 MSC in una piastra a 48 pozzetti ricoperta di gelatina e coltivare fino a quando non è confluente al 60%-70%.
- Rimuovere il terreno e aggiungere 0,3 mL di terreno di induzione osteogenica. Coltura delle cellule in un terreno di induzione osteogenica per 14 giorni a 37 °C, 5% di CO2 , con cambio di terreno ogni 3 giorni.
- Rimuovere il mezzo e lavare con DPBS una volta.
- Aggiungere 0,3 mL di PFA al 4% e incubare a RT per 30 min.
- Rimuovere il PFA. Sciacquare le cellule con 0,3 mL di DPBS per 10 minuti a RT e ripetere 3 volte.
- Rimuovere il DPBS, aggiungere 0,2 mL di soluzione colorante rossa di alizarina e incubare per 30 minuti a RT.
- Rimuovere la soluzione colorante, sciacquare le cellule con 0,3 mL di DPBS per 10 minuti a RT e ripetere 3 volte.
- Osservare la colorazione della deposizione di calcio al microscopio ottico.
6. Differenziamento adipogenico delle MSC che guidano le hiPSC
NOTA: Le MSC che guidano le hiPSC possiedono un potenziale di differenziazione adipogenica (Figura 3C, D). Di seguito è riportato il protocollo per la differenziazione adipogenica.
- Preparare il terreno di induzione adipogenica integrando α-MEM con il 10% di FBS, 1 μM di desametasone, 1 μM di IBMX, 10 μg/mL di insulina e 100 μM di indometacina. Preparare il terreno adipogenico di mantenimento integrando α-MEM con il 10% di FBS e 10 μg/mL di insulina.
- Seminare 1 x 105 MSC in una piastra a 48 pozzetti ricoperta di gelatina e coltivare fino a quando la densità cellulare non raggiunge il 90%.
- Rimuovere il terreno e aggiungere 0,3 mL di terreno di induzione adipogenica. Continuare a coltivare le cellule nel terreno di induzione adipogenica per 4 giorni a 37 °C, 5% CO2 .
- Rimuovere il terreno e aggiungere 0,3 mL di terreno adipogenico di mantenimento. Continuare a coltivare le cellule nel terreno adipogenico di mantenimento per 3 giorni a 37 °C, 5% CO2 .
- Ripetere i passaggi 6.3 e 6.4 2-3 volte fino alla differenziazione e maturazione degli adipociti.
- Rimuovere il mezzo e lavare con DPBS una volta.
- Aggiungere 0,3 mL di PFA al 4% e incubare a RT per 10 min. Rimuovere il PFA e risciacquare 2 volte con DPBS.
- Applicare la colorazione Oli Red O secondo le istruzioni del produttore e osservare le goccioline lipidiche al microscopio ottico.
7. Differenziamento condrogenico delle MSC che guidano le hiPSC
NOTA: Le MSC che guidano le hiPSC possiedono un potenziale di differenziazione condrogenica (Figura 3E, F). Di seguito è riportato il protocollo per il differenziamento condrogenico.
- Preparare il terreno di induzione del condroblasto integrando α-MEM con il 10% di FBS, 100 nM di desametasone, l'1% di insulina-transferrina-selenio (ITS), 10 μM di acido ascorbico, 1 mM di piruvato di sodio, 50 μg/mL di prolina, 0,02 nM di fattore di crescita trasformante β3 (TGFβ3) e 0,5 μg/mL di proteina morfogenetica ossea 6 (BMP-6).
- Raccogliere 2,5 x 105 MSC che guidano hiPSC e centrifugare le cellule a 150 x g per 5 minuti, quindi rimuovere il surnatante. Sospendere le cellule in 1 mL di α-MEM e poi centrifugare a 150 x g per 5 min.
- Rimuovere il surnatante e sospendere le cellule in 0,5 mL di terreno di induzione condrogenico. Centrifugare le cellule a 150 x g per 5 min.
- Svitare direttamente il coperchio e la coltura per 21 giorni con il cambio del terreno di induzione condrogenico ogni 3 giorni a 37 °C, 5% CO2 . Muovere delicatamente la provetta da centrifuga per sospendere i pellet condrogenici (senza distruggerli) ogni giorno durante la differenziazione condrogenica.
- Rimuovere il surnatante e lavare due volte con 0,5 mL di PBS.
- Aggiungere 0,3 mL di PFA al 4% e fissare per 24 ore.
- La paraffina incorpora i pellet condrogenici e quindi li seziona (3 μm). Colorare le sezioni in blu di toluidina (1%) per 30 min.
- Osservare la matrice condrocitaria extracellulare al microscopio ottico.
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Representative Results
Seguendo il protocollo (Figura 1A), le hiPSC sono state differenziate in MSC attraverso i metodi di formazione EB e di coltura monostrato. Durante il differenziamento, le cellule hanno mostrato diverse morfologie rappresentative (Figura 1B,C).
Come mostrato nella Figura 1B, le colonie di hiPSCs mostrano una tipica morfologia compatta prima della differenziazione con un bordo chiaro composto da cellule strettamente impacchettate. EB sferici uniformi si sono formati dopo la dissociazione e la coltura delle hiPSC per 24 ore sull'agitatore. Durante il giorno 1-7 di coltura nel mezzo di differenziazione delle MSC, il bordo liscio dell'EB è diventato ruvido e il volume dell'EB è cresciuto. Dal giorno 8 al giorno 17, dopo aver trasferito gli EB su una piastra a 6 pozzetti rivestita di gel con matrice extracellulare GFR, gli EB hanno gradualmente aderito alla piastra e molte cellule monostrato aderenti si sono diffuse intorno agli EB. Quando le cellule hanno raggiunto il 90% di confluenza il giorno 18, le cellule sono state digerite e seminate su una piastra di coltura rivestita di gelatina. Il giorno 19, la cellula ha aderito e ha mostrato una forma poligonale. Consecutivamente, le cellule sono state passate due volte quando erano confluenti al 90%. Le MSC derivate sono gradualmente maturate e hanno mostrato una tipica forma a fuso, e la colonia è cresciuta in un vortice.
Come mostrato nella Figura 1C, il volume delle cellule è aumentato e si è diffuso intorno alla colonia dopo aver sostituito il terreno di mantenimento iPSC con il terreno di mantenimento MSC per 24 ore. Durante la coltivazione in un terreno di mantenimento MSC, le cellule sono gradualmente proliferate e hanno formato cellule aderenti multistrato. Il giorno 14, le cellule sono state digerite e seminate su una piastra di coltura rivestita di gelatina. Il giorno 15, la cellula ha aderito e ha mostrato una forma poligonale. Consecutivamente, le cellule sono state passate 6 volte quando erano confluenti al 90%. Le MSC derivate sono gradualmente maturate e hanno mostrato una tipica forma a fuso, e la colonia è cresciuta in un vortice.
Gli antigeni di superficie delle hiPSC e delle MSC che guidano le hiPSC sono stati analizzati mediante citometria a flusso (Figura 2). Come mostrato nella Figura 2C, le hiPSC erano positive per CD90 e negative per CD34, CD45, CD73 e CD105. Dopo aver differenziato le hiPSC in MSC attraverso entrambi i metodi, le MSC di pilotaggio erano positive per CD90, CD73 e CD105 e negative per CD34 e CD45 (Figura 2A, B).
La capacità di differenziazione delle MSC che guidano le hiPSC è stata studiata mediante differenziamento osteogenico, adipogenico e condrogenico. Come mostrato nella Figura 3, entrambe le MSC che guidano le hiPSC dei due metodi si sono differenziate in osteoblasti, adipociti e condrociti. Le MSC che guidano le hiPSC del metodo monostrato hanno formato più depositi di calcio rispetto al metodo EB (Figura 3B). I due metodi non presentavano differenze significative nella differenziazione adipogenica e nella capacità di differenziazione condrogenica (Figura 3D,F).
La capacità di proliferazione delle MSC che guidano hiPSC è stata esaminata mediante coltura a passaggio continuo. Come mostrato nella Figura 3G, le MSC che guidano le hiPSC di entrambi i metodi possono essere fatte passare per più di 20 passaggi e mantenere comunque una rapida capacità di proliferazione.
Il confronto tra i due approcci mostrati nella Tabella 1 si basa sul tempo di differenziamento, il costo, la capacità di proliferazione cellulare, l'espressione dei marcatori MSC e la loro capacità di differenziazione in vitro.
Figura 1: Differenziazione delle hiPSC in MSC tramite il metodo di formazione EB e il metodo di coltura monostrato. (A) Schema che mostra la differenziazione delle hiPSC in MSC attraverso la formazione di EB e la coltura monostrato. Morfologia di rappresentazione delle cellule a fagi chiave durante la derivazione delle MSC da hiPSCs tramite (B) formazione di EB e (C) coltura monostrato. Barre graduate: 300 μm e 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: analisi degli antigeni di superficie delle MSC che guidano le hiPSC mediante citometria a flusso. Percentuali di espressione degli antigeni di superficie delle MSC nelle MSC che guidano le iPSC attraverso (A) la formazione di EB e (B) la coltura monostrato. (C) le hiPSC sono state utilizzate come controllo negativo. Marcatori negativi delle MSC: CD34, CD45; Marcatori positivi delle MSC: CD73, CD90 e CD105. marcatori negativi delle hiPSCs: CD34, CD45, CD73 e CD105; Marcatori positivi delle hiPSCs: CD90. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Differenziazione a tre linee e capacità di proliferazione delle MSC che guidano le hiPSC. (A) Colorazione rossa con alizarina di depositi di calcio di MSC che guidano hiPSC in terreno di differenziazione osteogenica per 2 settimane. Barre di scala: 300 μm. (B) Quantificazione della colorazione del rosso Alizarina S mediante analisi ImageJ. (C) Colorazione con Oli red O di goccioline lipidiche di MSC che guidano hiPSC in terreno di differenziazione adipogenica per 2 settimane. Barre di scala: 300 μm. (D) Quantificazione della colorazione di Oli Red O mediante analisi ImageJ. (E) Colorazione con blu di toluidina della matrice condrocitaria extracellulare. Barre della scala: 300 μm e 150 μm. (F) Quantificazione della colorazione con blu di toluidina mediante analisi ImageJ. (G) calcolo del tempo di raddoppio della popolazione di MSC che guidano le hiPSC. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Paragone | Metodo di formazione dell'EB | Metodo delle colture monostrato |
| Tempo di differenziazione | 27 giorni | 35 giorni |
| Costo | Alto | Basso |
| Velocità di proliferazione | Veloce | Veloce |
| Capacità di proliferazione | ≥20 passaggio | ≥20 passaggio |
| Espressione dei marcatori MSC | CD73/CD90/CD105 positivo, CD34/CD45 nagative | CD73/CD90/CD105 positivo, CD34/CD45 nagative |
| Capacità di differenziazione | Differenziamento adipogenico, differenziamento condrogenico e capacità di differenziamento osteogenico | Differenziamento adipogenico, differenziamento condrogenico e maggiore capacità di differenziamento osteogenico |
| Operazione | Complicato | Semplice |
Tabella 1: Caratteristiche dei due metodi per differenziare le hiPSC in MSC.
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Discussion
In questo protocollo, sono stati esaminati due metodi rappresentativi di differenziazione delle hiPSC in MSC: 20,21,22,23,24,25,26,27,28,30. Entrambi i metodi erano in grado di derivare le MSC dalle hiPSC. Le MSC derivate da hiPSC sono state confermate dalla morfologia cellulare (Figura 1), dagli antigeni di superficie (Figura 2) e dalla loro capacità di differenziarsi (Figura 3).
Entrambi i metodi condividevano lo stesso mezzo di mantenimento MSC, mentre il metodo EB necessitava anche di un mezzo di differenziazione MSC con TGF-β e FGF2. Inoltre, il metodo EB richiedeva un basso fissaggio di piastre a 6 pozzetti e uno speciale agitatore che può essere collocato in un incubatore ad anidride carbonica. Pertanto, il costo del metodo EB è stato superiore a quello del metodo monostrato18,20. Il metodo EB sembrava essere più complicato del metodo monostrato. Tuttavia, il tempo di differenziazione del metodo EB è stato più breve, il che ha evitato passaggi multipli per arricchire le MSC.
Abbiamo scoperto che la tolleranza alle condizioni ambientali del metodo EB era più forte di quella del metodo monostrato. Entrambi i metodi sono stati influenzati dallo stato delle iPSC, dall'interferenza umana e dall'ambiente di coltura11,20. Tuttavia, abbiamo scoperto che il rapporto di successo del metodo EB era molto più alto di quello del metodo monostrato. La fase chiave del metodo EB è stata la fase di differenziazione EB dal giorno 1 al giorno 7. Durante i giorni 1-7, se gli EB diventano gradualmente più piccoli o rotti con molte cellule morte fluttuanti nel terreno di coltura o formano EB vacuolati, questi EB non qualificati hanno difficoltà ad aderire alla piastra di gelatina e poche, se non nessuna, cellule aderenti strisciano fuori dagli EB. Dal giorno 1 al giorno 7, gli EB qualificati erano uniformi e leggermente ingranditi, i cui bordi lisci diventavano gradualmente ruvidi con cellule sporgenti. Dopo essere stati trasferiti sulla piastra di gelatina, gli EB hanno aderito rapidamente alla piastra e molte cellule monostrato aderenti si sono diffuse intorno agli EB. Se gli EB sono qualificati durante i giorni 1-7, la differenziazione successiva è facile da ottenere. Al contrario, il metodo monostrato potrebbe fallire in qualsiasi momento. Dal giorno 1 al giorno 14, le cellule aderenti possono cadere a chiazze, indicando un fallimento della differenziazione. Normalmente, le cellule aderenti proliferano e formano cellule aderenti multistrato. Dopo il 14° giorno, il metodo monostrato fallirebbe ancora perché poche cellule sono attaccate al piatto. Durante i giorni 0-13 del metodo monostrato, abbiamo osservato varie morfologie cellulari nel piatto. Tuttavia, la morfologia cellulare del metodo EB nei giorni 8-17 è risultata omogenea. Rispetto al metodo monostrato, sospettiamo che il metodo EB sia più simile al processo di sviluppo embrionale e sia un metodo di differenziazione programmata più controllabile.
Entrambi i metodi potrebbero essere utilizzati per più di 20 passaggi e mantenere comunque una rapida capacità di proliferazione11. I depositi di calcio di differenziazione osteogenica nel metodo monostrato erano superiori a quelli del metodo EB. Deve essere utilizzato un siero specifico per le cellule staminali per evitare l'effetto delle citochine nel siero sulla differenziazione. Abbiamo osservato che le cellule smettevano di proliferare se la densità cellulare era troppo bassa. Quindi, dopo aver raggiunto la confluenza, le cellule devono essere fatte passare con un rapporto di divisione 1:3. Nessun antibiotico è stato utilizzato durante la differenziazione; pertanto, la stretta osservanza delle buone pratiche di laboratorio (BPL) è obbligatoria per questa configurazione sperimentale.
In conclusione, c'erano vantaggi e svantaggi per ogni metodo testato in questo protocollo. Entrambi i metodi possono generare MSC da hiPSC, la scelta si basa sulle esigenze dell'utente.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Siamo estremamente grati a tutti i membri del Mao and Hu Lab, passati e presenti, per le interessanti discussioni e i grandi contributi al progetto. Siamo grati al National Clinical Research Center for Child Health per il grande supporto. Questo studio è stato sostenuto finanziariamente dalla National Natural Science Foundation of China (U20A20351 a Jianhua Mao, 82200784 a Lidan Hu), dalla Natural Science Foundation of Zhejiang Province of China (No. LQ22C070004 a Lidan Hu).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alizarin red staining kit | Beyotime Biotechnology | C0148S | |
| Anti-human-CD105 (PE) | Biolegend | 323206 | |
| Anti-human-CD34 (FITC) | Biolegend | 343503 | |
| Anti-human-CD45 (APC) | Biolegend | 304011 | |
| Anti-human-CD73( APC) | Biolegend | 344006 | |
| Anti-human-CD90 (FITC) | Biolegend | 328108 | |
| Ascorbic acid | Solarbio | A8100 | |
| BMP-6 | Novoprotein | C012 | |
| Carbon dioxide level shaker | Crystal | CO-06UC6 | |
| Compensation Beads | BioLegend | 424601 | |
| CryoStor CS10 | STEMCELL Technology | 07959 | |
| Dexamethasone | Beyotime Biotechnology | ST1254 | |
| DMEM/F12 medium | Servicebio | G4610 | |
| Fetal bovine serum | HAKATA | HS-FBS-500 | |
| FGF2 | Stemcell | 78003.1 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G2500-100G | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | |
| human IgG1 isotype control APC | BioLegend | 403505 | |
| human IgG1 isotype control FITC | BioLegend | 403507 | |
| human IgG1 isotype control PE | BioLegend | 403503 | |
| Human TGF-β1 | Stemcell | 78067 | |
| Human TruStain FcX | BioLegend | 422301 | |
| IBMX | Beyotime Biotechnology | ST1398 | |
| Indomethacin | Solarbio | SI9020 | |
| Insulin | Beyotime Biotechnology | P3376 | |
| iPSC maintenance medium | STEMCELL Technology | 85850 | |
| ITS Media Supplement | Beyotime Biotechnology | C0341-10mL | |
| Matrigel, growth factor reduced | BD Corning | 354230 | |
| Oli Red O staining kit | Beyotime Biotechnology | C0158S | |
| Proline | Solarbio | P0011 | |
| Sodium pyruvate | ThermoFisher | 11360-070 | |
| TGFβ3 | Novoprotein | CJ44 | |
| Toluidine blue staining kit | Solarbio | G2543 | |
| TrypLE Express Enzyme(1x) | Gibco | 12604013 | |
| Ultra-Low Attachment 6 Well Plate | Costar | 3471 | |
| Versene | Gibco | 15040-66 | |
| Y-27632 | Stemcell | 72304 | |
| α-MEM | Hyclone | SH30265 | |
| β-glycerophosphate | Solarbio | G8100 |
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