Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

השוואה בין שתי שיטות מייצגות להתמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם לתאי סטרומה מזנכימליים

Published: October 20, 2023 doi: 10.3791/65729
Automatic Translation
1, 2,3, 4, 2, 1,2, 2,3
1National Clinical Research Center for Child Health, The Children's Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 2Department of Nephrology, The Children's Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 3Zhejiang University School of Medicine, 4Liangzhu Laboratory, Zhejiang University

Summary

פרוטוקול זה מתאר ומשווה שתי שיטות מייצגות להבחנה של hiPSCs לתאי סטרומה מזנכימליים (MSCs). השיטה החד-שכבתית מאופיינת בעלות נמוכה יותר, תפעול פשוט יותר ובידול אוסטאוגני קל יותר. שיטת הגופים העובריים (EBs) מאופיינת בצריכת זמן נמוכה יותר.

Abstract

תאי סטרומה מזנכימליים (MSCs) הם תאי גזע פלוריפוטנטיים בוגרים הנמצאים בשימוש נרחב ברפואה רגנרטיבית. מכיוון שתאי MSC שמקורם ברקמה סומטית מוגבלים על ידי תרומה מוגבלת, שינויי איכות ובטיחות ביולוגית, בעשר השנים האחרונות חלה עלייה גדולה במאמצים לייצר MSCs מתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (hiPSCs). מאמצים קודמים ואחרונים בהתמיינות של hiPSCs ל- MSCs התרכזו סביב שתי מתודולוגיות תרבית: (1) היווצרות גופים עובריים (EBs) ו- (2) שימוש בתרבית חד-שכבתית. פרוטוקול זה מתאר שתי שיטות מייצגות אלה בהפקת MSC מ- hiPSCs. כל שיטה מציגה את יתרונותיה וחסרונותיה, לרבות זמן, עלות, יכולת התפשטות תאים, ביטוי סמני MSC ויכולת התמיינות שלהם במבחנה. פרוטוקול זה מדגים כי שתי השיטות יכולות להפיק MSCs בוגרים ופונקציונליים מ- hiPSCs. שיטת החד-שכבתית מאופיינת בעלות נמוכה יותר, תפעול פשוט יותר ובידול אוסטאוגני קל יותר, ואילו שיטת EB מאופיינת בצריכת זמן נמוכה יותר.

Introduction

תאי סטרומה מזנכימליים (MSCs) הם תאי גזע פלוריפוטנטיים בוגרים שמקורם במזודרם1. MSCs נמצאים כמעט בכל רקמות החיבור2. מאז MSCs התגלו לראשונה בשנת 1970 ובודדו בהצלחה ממח עצם בשנת 1987 על ידי Friedenstein et al.3,4,5, מגוון של רקמות סומטיות אנושיות (כולל עובריות ובוגרות) שימשו לבידוד MSCs כגון עצם, סחוס, גיד, שריר, רקמת שומן, סטרומה תומכת hematopoietic 1,2,6,7 . MSCs מפגינים יכולות שגשוג גבוהות ופלסטיות כדי להתמיין לשושלות תאים סומטיות רבות ויכולים לנדוד לרקמות פצועות ומודלקות 2,8,9. תכונות אלה הופכות MSCs למועמד פוטנציאלי לרפואה רגנרטיבית10. עם זאת, MSCs שמקורם ברקמה סומטית (st-MSCs) מוגבלים על ידי תרומה מוגבלת, יכולת שגשוג תאים מוגבלת, שינויים באיכות וחשש לבטיחות ביולוגית להעברה אפשרית של פתוגנים, אם בכלל, מהתורמים11,12.

תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (hiPSCs) נגזרים מתאים בוגרים המתכנתים מחדש עם גורמי שעתוק (Oct4, Sox2, Klf4 ו- c-Myc), שיש להם תפקידים דומים לתאי גזע עובריים13,14. הם יכולים לחדש את עצמם ויש להם את הפוטנציאל של התמיינות לכל סוג של תאים סומטיים, כולל MSCs. בהשוואה ל- st-MSCs, ל- iPSC-MSCs יש את היתרון של אספקה בלתי מוגבלת, עלות נמוכה יותר, טוהר גבוה יותר, נוחות בבקרת איכות, קל לייצור בקנה מידה ושינוי גנים 15,16,17.

בשל יתרונות אלה של iPSC-MSCs, דווח על מגוון שיטות המניעות MSC מ- iPSC. שיטות התמיינות אלה התרכזו סביב שתי מתודולוגיות תרבית: (1) היווצרות גופים עובריים (EBs) ו-(2) שימוש בתרביות חד-שכבתיות 11,18,19,20. כאן אופיינה גישה מייצגת לכל אחת משתי המתודולוגיות. כמו כן, נערכה השוואה בין שתי גישות מייצגות המבוססות על זמן, עלות, יכולת שגשוג, ביטוי סמנים ביולוגיים של MSC ויכולת התמיינות במבחנה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. תחזוקת hiPSCs

  1. הפשרת hiPSC
    1. הוציאו את התאים מהחנקן הנוזלי והפשירו במהירות תאים באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס. מעבירים את תאי ההפשרה לצינור 15 מ"ל שהוכן עם 3 מ"ל של אמצעי תחזוקה iPSC (טבלת חומרים). מערבבים בעדינות את המדיום.
    2. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות. הסר את supernatant, ובעדינות resuspend את התאים ב 1 מ"ל של אמצעי תחזוקה iPSC עם 10 מיקרומטר Y-27632 (פיפטה התאים למעלה ולמטה 2-3 פעמים).
    3. מעבירים את תרחיף התאים לצלחת תרבית רקמה בת 6 בארות המצופה בג'ל מטריצה חוץ-תאי מופחת גורם גדילה (GFR) (1:100) ו-2 מ"ל מדיום תחזוקה iPSC עם תוספת מראש של 10 מיקרומטר Y-27632 (כ-4 x 104 תאים/ס"מ2).
    4. תרבית את התאים במשך 5-6 ימים (80%-90% מפגש) ב 37 ° C, 5% CO2 עם iPSC תחזוקה מדיה לשנות מדי יום.
  2. מעבר של hiPSC
    1. הסר את אמצעי התחזוקה iPSC מלוח 6 הקידוחים. שטפו את ה-hiPSCs פעם אחת עם DPBS.
    2. הוסף 700-800 μL של תמיסת EDTA 0.48 mM ודגור במשך דקה אחת בטמפרטורת החדר (RT), ולאחר מכן הסר את תמיסת העיכול. ממשיכים לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 3-5 דקות.
    3. כאשר תאים מתעכלים ליריעות (אין לעכל תאים לתאים בודדים), יש להוסיף 1 מ"ל של מצע תחזוקה iPSC עם 10 מיקרומטר Y-27632 כדי לסיים את העיכול. בזהירות פיפטה את התאים למעלה ולמטה 2-3 פעמים.
    4. העבירו את תרחיף התא לצלחת תרבית רקמה בעלת 6 בארות המצופה בג'ל מטריצה חוץ-תאי מופחת גורם גדילה (GFR) (1:100) ו-2 מ"ל של מדיום תחזוקה iPSC עם תוספת של 10 מיקרומטר Y-27632 מראש.
      הערה: יחס המעבר נע בין 1:6 ל-1:20 (כ-4 x 104 תאים/ס"מ2), וגודל הצבירה הממוצע הוא כ-50-200 מיקרומטר.
    5. תרבית את התאים עד 80%-90% מפגש (5-6 ימים) ב 37 ° C, 5% CO2 עם iPSC תחזוקה מדיה לשנות מדי יום.

2. הבחנה בין MSCs לבין hiPSCs באמצעות היווצרות EB

הערה: השיטה נגזרת מספרות קודמת 21,22,23,24. סקירה כללית של השיטה מודגמת באיור 1. מאפייני השיטה מסוכמים בטבלה 1.

  1. הכנת המדיום
    1. הכן את מדיום הבידול של MSC על-ידי תוספת α-MEM עם 1% (v/v) GlutaMAX, 10% (v/v) FBS, 10 ng/mL FGF2 ו-5 ng/mL TGFβ.
    2. הכן את אמצעי התחזוקה של MSC על-ידי השלמת α-MEM עם 1% (v/v) GlutMAX, 10% (v/v) FBS ו-1 ng/mL FGF2.
  2. הכנת hiPSCs
    1. קווי hiPSCs תרבית (עוברים לפחות 2-3 פעמים לאחר ההפשרה) במדיום תחזוקת iPSC על צלחת תרבית רקמה בת 6 בארות המצופה בג'ל מטריצה חוץ-תאי מופחת גורם גדילה (GFR) (1:100) ב-37°C, 5% CO2 עד למפגש של 80%-90%.
  3. יום 0: היווצרות EB
    1. הסר את אמצעי התחזוקה iPSC מלוח 6 הקידוחים. שטפו את ה-hiPSCs פעם אחת עם DPBS.
    2. הוסף 700-800 μL של תמיסת 0.48 mM EDTA ודגור במשך דקה אחת ב- RT, ולאחר מכן הסר את תמיסת העיכול. ממשיכים לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 3-5 דקות.
    3. כאשר תאים מתעכלים ליריעות (אין לעכל תאים לתאים בודדים), יש להוסיף 2 מ"ל של מדיום תחזוקה iPSCs (המכיל 10 מיקרומטר מעכב רוק ו-1:100 GFR- ג'ל מטריצה חוץ-תאי) כדי לסיים את העיכול.
    4. מעבירים את התאים לצלחת חיבור נמוכה של 6 בארות. זרעו את התאים ביחס של 2 בארות של צלחת תרבית רקמה לבאר אחת של צלחת חיבור נמוכה. יש לדגור על התאים בשייקר (60 סל"ד לדקה) ב-37°C, 5% CO2 למשך 24 שעות ליצירת EBs כדוריים.
  4. יום 1-יום 7: בידול EB
    1. העבירו את ה-EBs לצינור הצנטריפוגה עם פיפטת פסטר (מבלי להרוס EBs) ותנו ל-EBs לשקוע באופן טבעי במשך 5-10 דקות ב-RT. לאחר מכן, הסר את supernatant.
    2. העבר את ה- EBs לצלחת חיבור נמוכה של 6 בארות עם 2 מ"ל של מדיום בידול MSC. תרבית את EBs על שייקר ב 37 ° C, 5% CO2 במשך 7 ימים עם שינוי בינוני פעם אחת.
  5. יום 8-יום 17: חיסון EB
    1. העבירו את ה-EBs לצינור הצנטריפוגה עם פיפטת פסטר (מבלי להרוס EBs) ותנו ל-EBs לשקוע באופן טבעי במשך 5-10 דקות. לאחר מכן, הסר את supernatant.
    2. העבר את ה- EBs לצלחת 6 בארות מצופה ג'ל מטריצה חוץ-תאית GFR עם 2 מ"ל של אמצעי תחזוקה MSC. תרבית עד 90% מפגש (~ 10 ימים) עם שינוי מדיה קבוע לאחר הידבקות התא.
  6. יום 18 - יום 27: התבגרות והתרחבות MSCs
    1. טפל בתרבית שמקורה ב- EB בתמיסת דיסוציאציה ב- 37 מעלות צלזיוס למשך 5-10 דקות (זמן העיכול משתנה עקב נוכחותם של סוגי תאים שונים).
    2. כאשר חלק מהתאים מתעכלים לתאים בודדים, הוסף 2 מ"ל של מדיום התחזוקה של MSC כדי לסיים את העיכול ולהעביר את תרחיף התא לצינור צנטריפוגה. שטפו את התאים הלא מעוכלים הנותרים פעם אחת עם DPBS ועיכלו שוב. חזור על הפעולה מספר פעמים עד שכל התאים מתעכלים לתאים בודדים. צנטריפוגה את מתלה התא ב 250 x גרם במשך 5 דקות, ולאחר מכן להסיר את supernatant.
    3. זרעו את התאים על צלחת תרבית מצופה ג'לטין (בערך 2 x 105 תאים / ס"מ2). תרבות עד 90% מפגש במדיום תחזוקת MSC עם שינוי בינוני באופן קבוע. ייעד דור תאים זה כמעבר 0 (P0) בשלב זה.
    4. על מנת להפוך MSC טהור ובשל, המשך להעביר את התאים פעמיים ביחס פיצול של 1:3 תוך כ -6 ימים. רוב התאים מציגים מורפולוגיה דמוית פיברובלסט (בצורת ציר).

3. הבחנה בין MSCs לבין hiPSCs באמצעות תרבית חד-שכבתית

הערה: השיטה נגזרת מספרות קודמת 25,26,27,28. סקירה כללית של שיטה זו מודגמת באיור 1. מאפייני השיטה מסוכמים בטבלה 1.

  1. הכנת המדיום
    1. הכן את אמצעי התחזוקה של MSC על-ידי השלמת α-MEM עם 1% (v/v) GlutMAX, 10% (v/v) FBS ו-1 ng/mL FGF2.
  2. הכנת hiPSCs
    1. קווי hiPSCs תרבית (עוברים לפחות 2-3 פעמים לאחר ההפשרה) במדיום התחזוקה iPSC על צלחת תרבית רקמה בת 6 בארות המצופה בג'ל מטריצה חוץ-תאי מופחת גורם גדילה (GFR) (1:100) ב-37°C, 5% CO2 עד למפגש של 50%-60%.
  3. יום 0-יום 13: בידול על ידי תרבויות חד-שכבתיות ישירות
    1. הסר את אמצעי התחזוקה iPSC מלוח 6 הקידוחים.
    2. הוסף ישירות 2 מ"ל של אמצעי התחזוקה והתרבות של MSC למשך 14 יום ב- 37 ° C, 5% CO2, כאשר המדיה משתנה מדי יום.
  4. יום 14 - יום 35: MSCs הבשלה על ידי מעבר חוזר
    1. טפל תרביות monolayer עם פתרון דיסוציאציה ב 37 ° C במשך 5-10 דקות (זמן העיכול משתנה עקב נוכחות של סוגי תאים שונים).
    2. כאשר התאים מתעכלים לתאים בודדים, הוסף 2 מ"ל של מדיום תחזוקה MSC כדי לסיים את העיכול ולהעביר את תרחיף התא לצינור צנטריפוגה. שטפו את התאים הלא מעוכלים הנותרים פעם אחת עם DPBS ועיכלו שוב. חזור על הפעולה מספר פעמים עד שכל התאים מתעכלים לתאים בודדים. צנטריפוגה את מתלה התא ב 250 x גרם במשך 5 דקות, ולאחר מכן להסיר את supernatant.
    3. זרעו את התאים על צלחת תרבית מצופה ג'לטין (בערך 2X10,5 תאים/ס"מ2). תרבות עד 90% מפגש במדיום תחזוקת MSC עם שינוי מדיה באופן קבוע. ייעד דור תאים זה כמעבר 0 (P0) בשלב זה.
    4. על מנת להפוך MSC טהור ובשל, המשך להעביר את התאים 6 פעמים ביחס פיצול של 1:3 תוך כ -18 ימים. רוב התאים מציגים מורפולוגיה דמוית פיברובלסט (בצורת ציר).

4. ניתוח אנטיגנים פני השטח של MSCs המניעים hiPSC על ידי ציטומטריית זרימה

הערה: בדומה לאנטיגנים פני השטח של MSCs שמקורם במח עצם, MSC אקספרס CD105, CD73 ו- CD90 המניעים hiPSCs, אך אינם מבטאים CD45, CD3429. בנוסף, hiPSCs יכולים לשמש כתאי בקרה שליליים. ניתוח אנטיגנים על פני השטח של MSCs מונעי hiPSC ו-hiPSCs לפי ציטומטריית זרימה מוצגים באיור 2.

  1. טפל ב-MSCs המונעים על ידי hiPSC עם תמיסת דיסוציאציה ב-37°C למשך 2-3 דקות. טפל ב- hiPSCs עם מגיב דיסוציאציה EDTA 0.48 mM ודגר במשך דקה אחת ב- RT, ולאחר מכן הסר את מגיב הדיסוציאציה. ממשיכים לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 3-5 דקות.
  2. כאשר התאים מתעכלים לתאים בודדים, יש להוסיף מדיום (מדיום תחזוקת MSC ל-MSC ומדיום תחזוקת iPSC ל-iPSCs) כדי לסיים את העיכול.
  3. צנטריפוגה את מתלה התא ב 350 x גרם במשך 5 דקות, ולאחר מכן להסיר את supernatant.
  4. לשטוף את התאים פעם אחת עם DPBS קר, צנטריפוגה ב 350 x גרם במשך 5 דקות, ולאחר מכן להסיר את supernatant.
  5. ספירה והשעיה מחדש של התאים בתמיסת FBS-DPBS (v/v) קרה 10% ב- 10 x 106 תאים/מ"ל ופיזור 100 μL / צינור של תרחיף תאים (1 x 106 תאים / צינור) לתוך צינורות צנטריפוגות 1.5 מ"ל.
  6. הוסף 5 μL של תמיסת חסימת קולטן Fc אנושי ל- 100 μL של השעיית תאים. יש לדגור במשך 5-10 דקות ב-RT כדי לבצע חסימה לא ספציפית.
  7. צנטריפוגה ב 350 x גרם במשך 5 דקות ולהסיר את supernatant. שטפו את התאים פעמיים בתמיסת FBS-DPBS (v/v) קרה 2%.
  8. להשהות מחדש את התאים בקור 100 μL של 2% FBS-DPBS (v/v) תמיסה.
  9. הוסף 5 μL (בדיקה אחת) של anti-CD34-FITC ו- 5 μL (בדיקה אחת) של anti-CD45-APC לתא 100 μL
    השעיה. הוסף 5 μL (בדיקה אחת) של anti-CD73-APC, 5 μL (בדיקה אחת) של anti-CD90-FITC ו- 5 μL (בדיקה אחת) של anti-CD105-PE לצינור תרחיף תאים נוסף של 100 μL. הוסף 5 μL של בקרת איזוטיפ IgG1 אנושית FITC, בקרת איזוטיפ IgG1 אנושית PE ו- APC בקרת איזוטיפ IgG1 אנושי לצינור ההשעיה השלישי של תא 100 μL. יש לדגור במשך 15-20 דקות על קרח בחושך. בינתיים, הכינו חרוזים עם כתמים בודדים.
  10. שטפו את התאים פעמיים בתמיסת FBS-DPBS (v/v) קרה 2%.
  11. הוסף 300 μL של תמיסת FBS-DPBS (v/v) קרה 2% כדי להשעות מחדש את התאים, ולסנן באמצעות מסנן רשת שינוי של 200.
  12. נתח את הדגימות באמצעות ציטומטריית זרימה. נתח את תרחיף התא המוכתם בנוגדנים לבקרת איזוטיפ וקבע שער. לאחר מכן לנתח את השעיית התא המוכתמת בנוגדני מטרה.

5. בידול אוסטאוגני של MSCs המונעים על ידי hiPSC

הערה: ל-MSCs המונעים על ידי hiPSC יש פוטנציאל התמיינות אוסטאוגני (איור 3A, B). הפרוטוקול להתמיינות אוסטאוגנית מובא להלן.

  1. הכינו מדיום השראה אוסטאוגני על ידי תוספת α-MEM עם 10% FBS, 100 ננומטר דקסמתזון, 10 מ"מ בטא-גליצרופוספט ו-100 מיקרומטר חומצה אסקורבית.
  2. זרעו 1 x 105 MSCs לתוך צלחת מצופה ג'לטין 48 בארות ותרבית עד שהוא 60%-70% מתמזג.
  3. הסר את המדיום והוסף 0.3 מ"ל של מדיום אינדוקציה אוסטאוגני. תרבית את התאים בתווך אינדוקציה אוסטאוגנית במשך 14 ימים ב 37 ° C, 5% CO2, עם שינוי מדיה כל 3 ימים.
  4. הסר את המדיום ושטוף עם DPBS פעם אחת.
  5. הוסיפו 0.3 מ"ל של 4% PFA ודגרו ב-RT למשך 30 דקות.
  6. הסר PFA. שטוף את התאים עם 0.3 מ"ל של DPBS במשך 10 דקות ב- RT וחזור על הפעולה 3 פעמים.
  7. הסר את DPBS, הוסף 0.2 מ"ל של תמיסת צביעה אדומה אליזרין, ודגר במשך 30 דקות ב- RT.
  8. הסר את תמיסת הצביעה, שטוף את התאים עם DPBS 0.3 מ"ל במשך 10 דקות ב- RT, וחזור על הפעולה 3 פעמים.
  9. שימו לב לצביעת תצהיר הסידן תחת מיקרוסקופ אור.

6. בידול אדיפוגני של MSCs המניעים hiPSC

הערה: ל-MSCs המניעים hiPSC יש פוטנציאל התמיינות אדיפוגני (איור 3C, D). הפרוטוקול להתמיינות אדיפוגנית מובא להלן.

  1. הכינו את אמצעי ההשראה האידיפוגניים על ידי תוספת α-MEM עם 10% FBS, 1 מיקרומטר דקסמתזון, 1 מיקרומטר IBMX, 10 מיקרוגרם / מ"ל אינסולין ו -100 מיקרומטר אינדומתצין. הכינו אמצעי תחזוקה אדיפוגניים על ידי תוספת α-MEM עם 10% FBS, ואינסולין 10 מיקרוגרם/מ"ל.
  2. זרע 1 x 105 MSCs לתוך צלחת מצופה ג'לטין 48 בארות ותרבית עד צפיפות התא מגיע 90%.
  3. הסר את המדיום והוסף 0.3 מ"ל של מדיום אינדוקציה אדיפוגני. המשך בתרבית התאים בתווך האינדוקציה האידיפוגנית במשך 4 ימים ב 37 ° C, 5% CO2.
  4. הסר את המדיום והוסף 0.3 מ"ל של אמצעי תחזוקה אדיפוגני. המשך בתרבית התאים בתווך התחזוקה האידיפוגנית במשך 3 ימים ב 37 ° C, 5% CO2.
  5. חזור על שלבים 6.3 ו 6.4 2-3 פעמים עד התמיינות אדיפוציט והבשלה.
  6. הסר את המדיום ושטוף עם DPBS פעם אחת.
  7. הוסיפו 0.3 מ"ל של 4% PFA ודגרו ב-RT למשך 10 דקות. יש להסיר את ה-PFA ולשטוף פעמיים עם DPBS.
  8. יש למרוח כתם Oli Red O לפי הוראות היצרן ולהתבונן בטיפות השומנים תחת מיקרוסקופ אור.

7. התמיינות כונדרוגנית של MSCs המונעים על ידי hiPSC

הערה: ל-MSCs המניעים hiPSC יש פוטנציאל התמיינות כונדרוגנית (איור 3E, F). הפרוטוקול להתמיינות כונדרוגנית מובא להלן.

  1. הכינו מדיום השראת כונדרובלסטים על ידי תוספת α-MEM עם 10% FBS, 100 ננומטר דקסמתזון, 1% אינסולין-טרנספרין-סלניום (ITS), 10 מיקרומטר חומצה אסקורבית, 1 מ"מ נתרן פירובט, 50 מיקרוגרם/מ"ל פרולין, 0.02 ננומטר גורם גדילה טרנספורמטיבי β3 (TGFβ3), וחלבון מורפוגנטי עצם 0.5 מיקרוגרם/מ"ל 6 (BMP-6).
  2. אסוף 2.5 x 105 hiPSC מונע MSCs וצנטריפוגה את התאים ב 150 x גרם במשך 5 דקות, ולאחר מכן להסיר את supernatant. להשהות את התאים ב 1 מ"ל של α-MEM ולאחר מכן צנטריפוגה ב 150 x גרם במשך 5 דקות.
  3. הסר את supernatant ולהשעות את התאים ב 0.5 מ"ל של מדיום אינדוקציה chondrogenic. צנטריפוגה את התאים ב 150 x גרם במשך 5 דקות.
  4. יש לפתוח ישירות את המכסה ואת התרבית למשך 21 יום עם שינוי אמצעי אינדוקציה כונדרוגניים כל 3 ימים בטמפרטורה של 37°C, 5% CO2. יש לסובב את צינור הצנטריפוגה בעדינות כדי להשהות את הכדוריות הכונדרוגניות (מבלי להרוס את הכדוריות הכונדרוגניות) מדי יום במהלך התמיינות כונדרוגנית.
  5. הסר את supernatant ולשטוף עם 0.5 מ"ל של PBS פעמיים.
  6. הוסף 0.3 מ"ל של 4% PFA ותקן במשך 24 שעות.
  7. פרפין להטביע את כדוריות chondrogenic, ולאחר מכן לחתוך אותם (3 מיקרומטר). צבעו את המקטעים בכחול טולוידין (1%) למשך 30 דקות.
  8. התבוננו במטריצת הכונדרוציטים החוץ תאיים תחת מיקרוסקופ אור.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בעקבות הפרוטוקול (איור 1A), hiPSCs התמינו ל-MSCs באמצעות שיטות היווצרות EB ותרבית חד-שכבתית. במהלך ההתמיינות, התאים הראו מורפולוגיות מייצגות שונות (איור 1B,C).

כפי שניתן לראות באיור 1B, מושבות hiPSCs מציגות מורפולוגיה קומפקטית טיפוסית לפני התמיינות עם גבול ברור המורכב מתאים צפופים. EBs כדוריים אחידים נוצרו לאחר ניתוק hiPSCs ותרבית במשך 24 שעות על השייקר. במהלך היום הראשון עד היום השביעי של תרבית בתווך הבידול של MSCs, הקצה החלק של EB הפך מחוספס, ונפח ה- EB גדל. מהיום ה-8 עד היום ה-17, לאחר העברת ה-EBs לפלטת 6 בארות מצופה ג'ל במטריצה חוץ-תאית GFR, EBs נדבקו בהדרגה ללוחית, ותאים חד-שכבתיים דבקים רבים התפשטו סביב ה-EBs. כאשר התאים הגיעו למפגש של 90% ביום ה-18, התאים עוכלו ונזרעו על צלחת תרבית מצופה ג'לטין. ביום ה-19 התא נדבק והראה צורה מצולעת. ברצף, התאים עברו פעמיים כאשר הם היו 90% נפגשים. ה-MSCs הנגזרים התבגרו בהדרגה והראו צורת ציר טיפוסית, והמושבה גדלה במערבולת.

כפי שניתן לראות באיור 1C, נפח התאים גדל והתפשט ברחבי המושבה לאחר החלפת מדיום התחזוקה iPSC במדיום התחזוקה MSC למשך 24 שעות. בתרבית במדיום תחזוקה MSC, התאים התרבו בהדרגה ויצרו תאים דבקים רב-שכבתיים. ביום ה-14 עוכלו התאים ונזרעו על צלחת תרבית מצופה ג'לטין. ביום ה-15 התא נדבק והראה צורה מצולעת. ברצף, התאים עברו 6 פעמים כאשר הם היו 90% נפגשים. ה-MSCs הנגזרים התבגרו בהדרגה והראו צורת ציר טיפוסית, והמושבה גדלה במערבולת.

האנטיגנים שעל פני השטח של hiPSCs ושל MSCs המונעים על ידי hiPSC נותחו על-ידי ציטומטריית זרימה (איור 2). כפי שניתן לראות באיור 2C, hiPSCs היו חיוביים עבור CD90 ושליליים עבור CD34, CD45, CD73 ו-CD105. לאחר הבחנה בין hiPSCs ל-MSCs בשתי השיטות, נהיגה MSCs הייתה חיובית עבור CD90, CD73 ו-CD105, ושלילית עבור CD34 ו-CD45 (איור 2A,B).

יכולת ההתמיינות של MSCs המונעים על ידי hiPSC נחקרה על ידי התמיינות אוסטאוגנית, אדיפוגנית וכונדרוגנית. כפי שניתן לראות באיור 3, שני MSCs מונעי hiPSC של שתי השיטות התמינו לאוסטאובלסט, אדיפוציט וכונדרוציטים. MSCs המניעים hiPSC של השיטה החד-שכבתית יצרו יותר משקעי סידן מאשר שיטת EB (איור 3B). בשתי השיטות לא היה הבדל משמעותי בהתמיינות אדיפוגנית וביכולת התמיינות כונדרוגנית (איור 3D,F).

יכולת ההתפשטות של MSCs המונעים ב-hiPSC נבחנה על ידי תרבות מעבר רציף. כפי שניתן לראות באיור 3G, ניתן להעביר את תאי ה-MSC המניעים hiPSC בשתי השיטות במשך יותר מ-20 מעברים ועדיין לשמור על יכולת התפשטות מהירה.

ההשוואה בין שתי הגישות המוצגות בטבלה 1 מבוססת על זמן התמיינות, עלות, יכולת התפשטות תאים, ביטוי סמני MSC ויכולת התמיינות שלהם במבחנה.

Figure 1
איור 1: הבחנה בין hiPSCs ל-MSCs באמצעות שיטת היווצרות EB ושיטת תרבית חד-שכבתית. (A) סכמטי המראה את ההתמיינות של hiPSCs ל-MSCs באמצעות היווצרות EB ותרבות חד-שכבתית. ייצוג מורפולוגיית תאים בפאגים מרכזיים במהלך MSCs הנובעים מ-hiPSCs באמצעות (B) היווצרות EB ו-(C) תרבית חד-שכבתית. פסי קנה מידה: 300 מיקרומטר ו- 50 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: ניתוח אנטיגנים של פני השטח של MSCs המניעים hiPSC לפי ציטומטריית זרימה. אחוזי ביטוי של אנטיגנים פני השטח של MSC ב- MSCs המונעים על ידי iPSC באמצעות (A) היווצרות EB ו- (B) תרבית חד-שכבתית. (C) hiPSCs שימשו כבקרה שלילית. סמנים שליליים של MSCs: CD34, CD45; סמנים חיוביים של MSCs: CD73, CD90 ו- CD105. סמנים שליליים של hiPSCs: CD34, CD45, CD73 ו- CD105; סמנים חיוביים hiPSCs: CD90. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: יכולת בידול והתפשטות של שלושה קווים של MSC המונעים על ידי hiPSC. (A) צביעה אדומה אליזרין של משקעי סידן של MSCs המונעים על ידי hiPSC בתווך התמיינות אוסטאוגנית למשך שבועיים. פסי קנה מידה: 300 מיקרומטר. (B) כימות צביעת S אדומה של אליזרין על ידי ניתוח ImageJ. (C) Oli אדום O צביעה של טיפות שומנים של MSCs מניעי hiPSC בתווך התמיינות אדיפוגנית למשך שבועיים. פסי קנה מידה: 300 מיקרומטר. (D) כימות של צביעת O אדומה על ידי ניתוח ImageJ. (E) צביעה כחולה טולוידין של מטריצת כונדרוציטים חוץ-תאיים. פסי קנה מידה: 300 מיקרומטר ו-150 מיקרומטר. (F) כימות של צביעה כחולה טולוידין על ידי ניתוח ImageJ. (G) חישוב זמן כפול של אוכלוסיית MSCs המונעים hiPSC. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

השוואה שיטת היווצרות EB שיטת תרביות חד-שכבתיות
זמן בידול 27 ימים 35 ימים
עלות גבוה נמוך
מהירות התפשטות מהר מהר
יכולת התפשטות מעבר ≥20 מעבר ≥20
ביטוי סמני MSC CD73 / CD90 / CD105 חיובי, CD34 / CD45 nagative CD73 / CD90 / CD105 חיובי, CD34 / CD45 nagative
יכולת בידול התמיינות אדיפוגנית, התמיינות כונדרוגנית ויכולת התמיינות אוסטאוגנית התמיינות אדיפוגנית, התמיינות כונדרוגנית ויכולת התמיינות אוסטאוגנית חזקה יותר
מבצע מסובך פשוט

טבלה 1: מאפייני שתי השיטות להבחנה בין hiPSCs ל-MSCs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בפרוטוקול זה נבדקו שתי שיטות מייצגות להבחנה בין hiPSCs ל-MSCs: 20,21,22,23,24,25,26,27,28,30. שתי השיטות היו מסוגלות לגזור MSCs מ hiPSCs. MSCs שמקורם ב-hiPSC אושרו על-ידי מורפולוגיית התא (איור 1), אנטיגנים בפני השטח (איור 2) ויכולתם להתמיין (איור 3).

שתי השיטות חלקו את אותו מדיום תחזוקה של MSC, בעוד ששיטת EB נזקקה גם למדיום בידול MSC עם TGF-β ו- FGF2. בנוסף, שיטת EB דרשה חיבור נמוך של 6 צלחות באר ושייקר מיוחד שניתן להציב באינקובטור פחמן דו חמצני. לכן, העלות של שיטת EB הייתה גבוהה מזו של שיטת monolayer18,20. שיטת EB נראתה מסובכת יותר משיטת החד-שכבתיות. עם זאת, זמן הבידול של שיטת EB היה קצר יותר, מה שמנע מעברים מרובים להעשרת MSCs.

מצאנו כי הסיבולת לתנאי הסביבה של שיטת EB הייתה חזקה יותר מזו של השיטה החד-שכבתית. שתי השיטות הושפעו ממעמד iPSC, התערבות אנושית וסביבת תרבות11,20. עם זאת, מצאנו כי יחס ההצלחה של שיטת EB היה גבוה בהרבה מזה של שיטת monolayer. שלב המפתח של שיטת EB היה שלב התמיינות EB מהיום הראשון ליום השביעי. במהלך ימים 1-7, אם EBs הופכים בהדרגה קטנים יותר או נשברים עם הרבה תאים מתים צפים בתווך התרבית או יוצרים EBs vacuolate, EBs בלתי מוסמכים אלה מתקשים להיצמד לצלחת הג'לטין ותאים דבקים מעטים, אם בכלל, זוחלים החוצה EBs. מהיום הראשון עד היום השביעי, EBs מוסמכים היו אחידים והיו מוגדלים מעט, קצוות חלקים מהם הופכים בהדרגה מחוספסים עם תאים בולטים. לאחר העברתם לצלחת הג'לטין, ה- EBs נדבקו לצלחת במהירות, ותאים חד-שכבתיים דבקים רבים התפשטו סביב ה- EBs. אם EBs מוסמכים במהלך ימים 1-7, בידול הבא קל להשיג. לעומת זאת, שיטת החד-שכבתית עלולה להיכשל בכל שלב. מהיום הראשון עד היום ה-14, תאים דבקים עלולים ליפול בטלאיים, מה שמצביע על כשל התמיינות. בדרך כלל, תאים דבקים מתרבים ויוצרים תאים דבקים רב-שכבתיים. לאחר היום ה-14, השיטה החד-שכבתית עדיין תיכשל מכיוון שמעט תאים מחוברים לצלחת. בימים 0-13 של השיטה החד-שכבתית צפינו במורפולוגיות שונות של תאים בצלחת. עם זאת, המורפולוגיה התאית של שיטת EB בימים 8-17 הייתה הומוגנית. בהשוואה לשיטה החד-שכבתית, אנו חושדים כי שיטת EB דומה יותר לתהליך ההתפתחות העוברית והיא שיטת התמיינות מתוכנתת נשלטת יותר.

בשתי השיטות ניתן להשתמש ביותר מ-20 מעברים ועדיין לשמור על יכולת התפשטות מהירה11. משקעי הסידן של התמיינות אוסטאוגנית בשיטה החד-שכבתית היו גדולים מאלה של שיטת EB. יש להשתמש בסרום ספציפי לתאי גזע כדי למנוע את ההשפעה של ציטוקינים בסרום על התמיינות. ראינו שהתאים יפסיקו להתרבות אם צפיפות התאים תהיה נמוכה מדי. לכן, לאחר ההגעה למפגש, יש להעביר את התאים ביחס פיצול של 1:3. לא נעשה שימוש באנטיביוטיקה במהלך ההבחנה; לכן, שמירה קפדנית על שיטות מעבדה טובות (GLP) היא חובה עבור מערך ניסוי זה.

לסיכום, היו יתרונות וחסרונות לכל שיטה שנבדקה בפרוטוקול זה. שתי השיטות יכולות ליצור MSC מ- hiPSCs, הבחירה מבוססת על דרישות המשתמש.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

אנו אסירי תודה לכל חברי מעבדת מאו והו, בעבר ובהווה, על הדיונים המעניינים והתרומות הגדולות לפרויקט. אנו מודים למרכז המחקר הקליני הלאומי לבריאות הילד על התמיכה הגדולה. מחקר זה נתמך כספית על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (U20A20351 לג'יאנהואה מאו, 82200784 ללידן הו), הקרן למדעי הטבע של מחוז ג'ג'יאנג בסין (No. LQ22C070004 ללידן הו).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alizarin red staining kit Beyotime Biotechnology C0148S
Anti-human-CD105 (PE) Biolegend 323206
Anti-human-CD34 (FITC) Biolegend 343503
Anti-human-CD45 (APC) Biolegend 304011
Anti-human-CD73( APC) Biolegend 344006
Anti-human-CD90 (FITC) Biolegend 328108
Ascorbic acid Solarbio A8100
BMP-6 Novoprotein C012
Carbon dioxide level shaker Crystal CO-06UC6
Compensation Beads BioLegend 424601
CryoStor CS10 STEMCELL Technology 07959
Dexamethasone Beyotime Biotechnology ST1254
DMEM/F12  medium Servicebio G4610
Fetal bovine serum HAKATA HS-FBS-500
FGF2 Stemcell 78003.1
Gelatin Sigma-Aldrich G2500-100G
GlutaMAX Gibco 35050061
human IgG1 isotype control APC BioLegend 403505
human IgG1 isotype control FITC BioLegend 403507
human IgG1 isotype control PE BioLegend 403503
Human TGF-β1 Stemcell 78067
Human TruStain FcX  BioLegend 422301
IBMX Beyotime Biotechnology ST1398
Indomethacin Solarbio SI9020
Insulin Beyotime Biotechnology P3376
iPSC maintenance medium STEMCELL Technology 85850
ITS Media Supplement Beyotime Biotechnology C0341-10mL
Matrigel, growth factor reduced BD Corning 354230
Oli Red O staining kit Beyotime Biotechnology C0158S
Proline Solarbio P0011
Sodium pyruvate ThermoFisher 11360-070
TGFβ3 Novoprotein CJ44
Toluidine blue staining kit Solarbio G2543
TrypLE Express Enzyme(1x)  Gibco 12604013
Ultra-Low Attachment 6 Well Plate Costar 3471
Versene Gibco 15040-66
Y-27632 Stemcell 72304
α-MEM Hyclone SH30265
β-glycerophosphate Solarbio G8100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Weng, Z., et al. Mesenchymal stem/stromal cell senescence: Hallmarks, mechanisms, and combating strategies. Stem Cells Translational Medicine. 11 (4), 356-371 (2022).
  2. Soliman, H., et al. Multipotent stromal cells: One name, multiple identities. Cell Stem Cell. 28 (10), 1690-1707 (2021).
  3. Friedenstein, A. J., Chailakhyan, R. K., Gerasimov, U. V. Bone marrow osteogenic stem cells: in vitro cultivation and transplantation in diffusion chambers. Cell and Tissue Kinetics. 20 (3), 263-272 (1987).
  4. Friedenstein, A. J., et al. Precursors for fibroblasts in different populations of hematopoietic cells as detected by the in vitro colony assay method. Experimental Hematology. 2 (2), 83-92 (1974).
  5. Friedenstein, A. J., Gorskaja, J. F., Kulagina, N. N. Fibroblast precursors in normal and irradiated mouse hematopoietic organs. Experimental Hematology. 4 (5), 267-274 (1976).
  6. El Agha, E., et al. Mesenchymal stem cells in fibrotic disease. Cell Stem Cell. 21 (2), 166-177 (2017).
  7. Mushahary, D., Spittler, A., Kasper, C., Weber, V., Charwat, V. Isolation, cultivation, and characterization of human mesenchymal stem cells. Cytometry A. 93 (1), 19-31 (2018).
  8. Ullah, M., Liu, D. D., Thakor, A. S. Mesenchymal stromal cell homing: Mechanisms and strategies for improvement. iScience. 15, 421-438 (2019).
  9. Regmi, S., et al. Enhanced viability and function of mesenchymal stromal cell spheroids is mediated via autophagy induction. Autophagy. 17 (10), 2991-3010 (2021).
  10. Hoang, D. M., et al. Stem cell-based therapy for human diseases. Signal Transduction and Targeted Therapy. 7 (1), 272 (2022).
  11. Jiang, B., et al. Concise review: Mesenchymal stem cells derived from human pluripotent cells, an unlimited and quality-controllable source for therapeutic applications. Stem Cells. 37 (5), 572-581 (2019).
  12. Soontararak, S., et al. Mesenchymal stem cells (MSC) derived from induced pluripotent stem cells (iPSC) equivalent to adipose-derived MSC in promoting intestinal healing and microbiome normalization in mouse inflammatory bowel disease model. Stem Cells Translational Medicine. 7 (6), 456-467 (2018).
  13. Di Baldassarre, A., Cimetta, E., Bollini, S., Gaggi, G., Ghinassi, B. Human-induced pluripotent stem cell technology and cardiomyocyte generation: Progress and clinical applications. Cells. 7 (6), 48 (2018).
  14. Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress. Nature Reviews. Drug Discovery. 16 (2), 115-130 (2017).
  15. Levy, O., et al. Shattering barriers toward clinically meaningful MSC therapies. Science Advances. 6 (30), eaba6884 (2020).
  16. Zhao, C., Ikeya, M. Generation and applications of induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells International. 2018, 9601623 (2018).
  17. Path, G., Perakakis, N., Mantzoros, C. S., Seufert, J. Stem cells in the treatment of diabetes mellitus - Focus on mesenchymal stem cells. Metabolism. 90, 1-15 (2019).
  18. Zhou, Y., et al. One-step derivation of functional mesenchymal stem cells from human pluripotent stem cells. Bio-Protocol. 8 (22), e3080 (2018).
  19. Hua, Z., et al. Low-intensity pulsed ultrasound promotes osteogenic potential of iPSC-derived MSCs but fails to simplify the iPSC-EB-MSC differentiation process. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 841778 (2022).
  20. Dupuis, V., Oltra, E. Methods to produce induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells: Mesenchymal stem cells from induced pluripotent stem cells. World Journal of Stem Cells. 13 (8), 1094-1111 (2021).
  21. Zhang, W., et al. Aging stem cells. A Werner syndrome stem cell model unveils heterochromatin alterations as a driver of human aging. Science. 348 (6239), 1160-1163 (2015).
  22. Liu, G. H., et al. Modelling Fanconi anemia pathogenesis and therapeutics using integration-free patient-derived iPSCs. Nature Communications. 5, 4330 (2014).
  23. Kubben, N., et al. Repression of the antioxidant NRF2 pathway in premature aging. Cell. 165 (6), 1361-1374 (2016).
  24. Duan, S., et al. PTEN deficiency reprogrammes human neural stem cells towards a glioblastoma stem cell-like phenotype. Nature Communications. 6, 10068 (2015).
  25. Zhang, J., et al. Exosomes released from human induced pluripotent stem cells-derived MSCs facilitate cutaneous wound healing by promoting collagen synthesis and angiogenesis. Journal of Translational Medicine. 13, 49 (2015).
  26. Hu, G. W., et al. Exosomes secreted by human-induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells attenuate limb ischemia by promoting angiogenesis in mice. Stem Cell Research & Therapy. 6 (1), 10 (2015).
  27. Kang, R., et al. Mesenchymal stem cells derived from human induced pluripotent stem cells retain adequate osteogenicity and chondrogenicity but less adipogenicity. Stem Cell Research & Therapy. 6 (1), 144 (2015).
  28. Wang, L. T., et al. Differentiation of mesenchymal stem cells from human induced pluripotent stem cells results in downregulation of c-Myc and DNA replication pathways with immunomodulation toward CD4 and CD8 cells. Stem Cells. 36 (6), 903-914 (2018).
  29. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  30. Kim, S., Kim, T. M. Generation of mesenchymal stem-like cells for producing extracellular vesicles. World Journal of Stem Cells. 11 (5), 270-280 (2019).

Tags

תאי סטרומה מזנכימליים MSCs רפואה רגנרטיבית תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי האדם HiPSCs התמיינות מתודולוגיות תרבית גופים עובריים תרבית חד-שכבתית יתרונות חסרונות צריכת זמן עלות יכולת ריבוי תאים סמני MSC יכולת התמיינות במבחנה MSCs בוגרים
השוואה בין שתי שיטות מייצגות להתמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם לתאי סטרומה מזנכימליים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, F., Gao, L., Fu, X., Yan, Q.,… More

Wang, F., Gao, L., Fu, X., Yan, Q., Hu, L., Mao, J. Comparison of Two Representative Methods for Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells into Mesenchymal Stromal Cells. J. Vis. Exp. (200), e65729, doi:10.3791/65729 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter