Summary
Этот протокол описывает и сравнивает два репрезентативных метода дифференцировки ИПСК в мезенхимальные стромальные клетки (МСК). Монослойный метод характеризуется более низкой стоимостью, более простой операцией и более легкой остеогенной дифференцировкой. Метод эмбриоидных телец (ЭБ) характеризуется меньшими затратами времени.
Abstract
Мезенхимальные стромальные клетки (МСК) – это взрослые плюрипотентные стволовые клетки, которые широко используются в регенеративной медицине. Поскольку МСК, полученные из соматических тканей, ограничены ограниченным донорством, вариациями качества и биобезопасностью, в последние 10 лет наблюдается значительный рост усилий по получению МСК из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (ИПСК). Прошлые и недавние усилия по дифференцировке ИПСК в МСК были сосредоточены вокруг двух методологий культивирования: (1) формирование эмбриоидных телец (ЭБ) и (2) использование монослойной культуры. В этом протоколе описаны эти два репрезентативных метода получения МСК из ИПСК. Каждый метод имеет свои преимущества и недостатки, включая время, стоимость, способность клеток к пролиферации, экспрессию маркеров МСК и их способность к дифференцировке in vitro. Этот протокол демонстрирует, что оба метода могут извлекать зрелые и функциональные МСК из ИПСК. Монослойный метод характеризуется более низкой стоимостью, более простой операцией и более легкой остеогенной дифференцировкой, в то время как метод EB характеризуется меньшими затратами времени.
Introduction
Мезенхимальные стромальные клетки (МСК) представляют собой взрослые плюрипотентные стволовые клетки, полученные из мезодермы1. МСК присутствуют практически во всех соединительных тканях2. С тех пор, как МСК были впервые обнаружены в 1970-х годах и успешно выделены из костного мозга в 1987 году Friedenstein et al.3,4,5, для выделения МСК использовались различные соматические ткани человека (включая эмбриональные и взрослые), такие как кости, хрящи, сухожилия, мышцы, жировая ткань и поддерживающая кроветворение строма 1,2,6,7 . МСК демонстрируют высокую пролиферативную способность и пластичность дифференцироваться во многие линии соматических клеток и могут мигрировать в поврежденные и воспаленные ткани 2,8,9. Эти свойства делают МСК потенциальным кандидатом для регенеративной медицины10. Тем не менее, МСК, полученные из соматической ткани (st-МСК), ограничены ограниченным донорством, ограниченной способностью клеток к пролиферации, вариациями качества и опасениями по поводу биобезопасности в отношении возможной передачи патогенов, если таковые имеются, от доноров11,12.
Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки человека (ИПСК) получают из взрослых клеток, перепрограммированных транскрипционными факторами (Oct4, Sox2, Klf4 и c-Myc), которые выполняют те же функции, что и эмбриональные стволовые клетки13,14. Они могут самообновляться и обладают потенциалом дифференцировки в любой тип соматических клеток, включая МСК. По сравнению с st-МСК, ИПСК-МСК имеет преимущество неограниченного предложения, более низкой стоимости, более высокой чистоты, удобства в контроле качества, простоты масштабирования производства и модификации генов 15,16,17.
В связи с этими преимуществами ИПСК-МСК сообщалось о различных методах, приводящих к получению МСК из ИПСК. Эти методы дифференциации были сосредоточены вокруг двух методологий культивирования: (1) формирование эмбриоидных телец (БЭ) и (2) использование монослойных культур 11,18,19,20. В данной работе был охарактеризован репрезентативный подход для каждой из двух методологий. Кроме того, были проведены сравнения между двумя репрезентативными подходами, основанными на времени, стоимости, пролиферативной способности, экспрессии биомаркеров МСК и способности к дифференцировке in vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Поддержание ИПСК
- Размораживание ИПСК
- Выньте клетки из жидкого азота и быстро разморозьте клетки на водяной бане с температурой 37 °C. Переложите размораживающие ячейки в пробирку объемом 15 мл, приготовленную с 3 мл поддерживающей среды для ИПСК (таблица материалов). Аккуратно перемешайте средство.
- Центрифуга при 300 x g в течение 5 мин. Удалите надосадочную жидкость и осторожно ресуспендируйте клетки в 1 мл поддерживающей среды для поддержания ИПСК с 10 мкМ Y-27632 (пипетками вверх и вниз 2-3 раза).
- Перенесите клеточную суспензию в 6-луночный планшет для культуры тканей, покрытый гелем внеклеточного матрикса с пониженным фактором роста (СКФ) (1:100) и 2 мл поддерживающей среды для ИПСК с заранее добавленным 10 мкМ Y-27632 (примерно 4 x 10,4 клетки/см2).
- Культивируйте клетки в течение 5-6 дней (80%-90% конфлюенция) при 37 °C, 5%CO2 с поддерживающей средой для ИПСК меняются каждый день.
- Пассаж ИПСК
- Извлеките поддерживающую среду iPSC из 6-луночного планшета. Промойте ИПСК один раз с помощью DPBS.
- Добавьте 700-800 мкл 0,48 мМ раствора ЭДТА и инкубируйте в течение 1 мин при комнатной температуре (RT), затем удалите раствор для сбраживания. Продолжайте инкубировать при температуре 37 °C в течение 3-5 мин.
- Когда клетки расщепляются на листы (не переваривайте клетки на отдельные клетки), добавьте 1 мл поддерживающей среды iPSC с 10 мкМ Y-27632 для прекращения расщепления. Осторожно пипетируйте ячейки вверх и вниз 2-3 раза.
- Перенесите клеточную суспензию в 6-луночный планшет для культуры тканей, покрытый гелем внеклеточного матрикса с пониженным фактором роста (СКФ) (1:100) и 2 мл поддерживающей среды для ИПСК с заранее добавленным 10 мкМ Y-27632.
ПРИМЕЧАНИЕ: Коэффициент проходки колеблется от 1:6 до 1:20 (около 4 x 104 клеток/см2), а средний размер агрегации составляет примерно 50-200 мкм. - Культивирование клеток до 80%-90% слияния (5-6 дней) при 37 °C, 5%CO2 при смене поддерживающих сред ИПСК каждый день.
2. Дифференциация МСК от ИПСК через образование БЭ
ПРИМЕЧАНИЕ: Метод основан на предыдущей литературе 21,22,23,24. Обзор метода показан на рисунке 1. Характеристики метода сведены в таблицу 1.
- Приготовление среды
- Приготовьте среду для дифференцировки МСК, добавив α-MEM 1% (v/v) GlutaMAX, 10% (v/v) FBS, 10 нг/мл FGF2 и 5 нг/мл TGFβ.
- Приготовьте поддерживающую среду для МСК, добавив α-MEM 1% (v/v) GlutMAX, 10% (v/v) FBS и 1 нг/мл FGF2.
- Приготовление ИПСК
- Линии культивирования ИПСК (прохождение не менее 2-3 раз после размораживания) в поддерживающей среде ИПСК на 6-луночном планшете для культуры тканей, покрытом гелем внеклеточного матрикса с пониженным фактором роста (СКФ) (1:100) при 37 °C, 5%СО2 до слияния 80%-90%.
- День 0: Формирование EB
- Извлеките поддерживающую среду iPSC из 6-луночного планшета. Промойте ИПСК один раз с помощью DPBS.
- Добавьте 700-800 мкл 0,48 мМ раствора ЭДТА и инкубируйте в течение 1 мин при RT, затем удалите раствор для сбраживания. Продолжайте инкубировать при температуре 37 °C в течение 3-5 мин.
- Когда клетки расщепляются на листы (не переваривайте клетки на отдельные клетки), добавьте 2 мл поддерживающей среды ИПСК (содержащей ингибитор породы 10 мкМ и гель внеклеточного матрикса 1:100), чтобы прекратить пищеварение.
- Перенесите ячейки на 6-луночную пластину с низким креплением. Засевают клетки в соотношении 2 лунки планшета для культуры тканей к 1 лунке низкой пластины для прикрепления. Инкубируют клетки в шейкере (60 об/мин) при температуре 37 °C, 5%CO2 в течение 24 ч до образования сферических ЭБ.
- День 1-7: дифференциация БЭ
- Переложите ЭП в центрифужную пробирку с помощью пипетки Пастера (не разрушая ЭП) и дайте ЭП естественным образом осаждиться в течение 5-10 мин при РТ. Затем удалите надосадочную жидкость.
- Перенесите ЭБ на 6-луночную планшет с низким креплением с 2 мл дифференцирующей среды МСК. Культивирование БЭ на шейкере при 37 °C, 5% CO2 в течение 7 дней с однократной сменой среды.
- День 8-17: Прививка БЭ
- Переложите БЭ в центрифужную пробирку с помощью пипетки Пастера (не разрушая ЭП) и дайте БЭ естественным образом осаждиться в течение 5-10 минут. Затем удалите надосадочную жидкость.
- Перенесите ЭБ на 6-луночный планшет, покрытый гелем во внеклеточном матриксе СКФ, с 2 мл поддерживающей среды МСК. Культивирование до 90% слияния (~10 дней) с регулярной сменой сред после адгезии клеток.
- День 18-День 27: созревание и расширение МСК
- Культуру, полученную из ЭБ, обработать раствором диссоциации при 37 °C в течение 5-10 мин (время расщепления варьируется в зависимости от наличия различных типов клеток).
- Когда часть клеток расщепляется в отдельные клетки, добавляют 2 мл поддерживающей среды МСК для прекращения разложения и переносят клеточную суспензию в центрифужную пробирку. Оставшиеся непереваренные клетки один раз промыть DPBS и снова переварить. Повторяйте несколько раз, пока все клетки не переварятся в отдельные клетки. Центрифугируйте клеточную суспензию при 250 x g в течение 5 мин, затем удалите надосадочную жидкость.
- Высейте клетки на культуральную пластину, покрытую желатином (примерно 2 x 10,5 клеток/см2). Культивирование до 90% слияния в поддерживающей среде МСК с регулярной сменой среды. Обозначим это поколение ячеек как проход 0 (P0) в этой точке.
- Для того, чтобы сделать МСК чистым и зрелым, продолжайте пропускать клетки дважды в соотношении 1:3 примерно через 6 дней. Большинство клеток имеют фибробластоподобную морфологию (веретенообразную).
3. Дифференциация МСК от ИПСК с помощью монослойной культуры
ПРИМЕЧАНИЕ: Метод основан на предыдущей литературе 25,26,27,28. Обзор этого метода проиллюстрирован на рисунке 1. Характеристики метода сведены в таблицу 1.
- Приготовление среды
- Приготовьте поддерживающую среду для МСК, добавив α-MEM 1% (v/v) GlutMAX, 10% (v/v) FBS и 1 нг/мл FGF2.
- Приготовление ИПСК
- Культивирование линий ИПСК (пассаж не менее 2-3 раз после размораживания) в поддерживающей среде ИПСК на 6-луночном планшете для культуры тканей, покрытом гелем внеклеточного матрикса с пониженным фактором роста (СКФ) (1:100) при 37 °C, 5%СО2 до слияния 50%-60%.
- День 0-День 13: Дифференциация по прямым однослойным культурам
- Извлеките поддерживающую среду iPSC из 6-луночного планшета.
- Непосредственно добавьте 2 мл поддерживающей среды МСК и культивирование в течение 14 дней при 37 °C, 5%CO2, при ежедневной смене среды.
- День 14-35: созревание МСК при повторном прохождении
- Обрабатывают монослойные культуры раствором диссоциации при температуре 37 °C в течение 5-10 мин (время расщепления варьируется в зависимости от наличия разных типов клеток).
- Когда клетки расщепляются на отдельные клетки, добавьте 2 мл поддерживающей среды МСК, чтобы прекратить пищеварение, и перенесите клеточную суспензию в центрифужную пробирку. Оставшиеся непереваренные клетки один раз промыть DPBS и снова переварить. Повторяйте несколько раз, пока все клетки не переварятся в отдельные клетки. Центрифугируйте клеточную суспензию при 250 x g в течение 5 мин, затем удалите надосадочную жидкость.
- Высейте клетки в культуральную чашку, покрытую желатином (примерно 2 x 105 клеток/см2). Культивирование до 90% слияния в поддерживающей среде МСК с регулярной сменой среды. Обозначим это поколение ячеек как проход 0 (P0) в этой точке.
- Для того, чтобы сделать МСК чистым и зрелым, продолжайте пассировать клетки 6 раз в соотношении 1:3 примерно через 18 дней. Большинство клеток имеют фибробластоподобную морфологию (веретенообразную).
4. Анализ поверхностных антигенов МСК, индуцирующих МСК, методом проточной цитометрии
ПРИМЕЧАНИЕ: Подобно поверхностным антигенам МСК, полученных из костного мозга, МСК, индуцирующие МСК, экспрессируют CD105, CD73 и CD90, но не экспрессируют CD45, CD3429. Кроме того, ИПСК могут быть использованы в качестве клеток негативного контроля. Анализ поверхностных антигенов МСК и ИПСК, управляемых ИПСК, методом проточной цитометрии представлен на рисунке 2.
- Обрабатывают МСК, приводящие ИПСК, раствором для диссоциации при 37 °C в течение 2-3 мин. Обработайте ИПСК 0,48 мМ диссоциационным реагентом ЭДТА и инкубируйте в течение 1 мин при ЛТ, затем удалите диссоциационный реагент. Продолжайте инкубировать при температуре 37 °C в течение 3-5 мин.
- Когда клетки расщепляются в отдельные клетки, добавьте среду (поддерживающую среду МСК к МСК и поддерживающую среду ИПСК к ИПСК), чтобы прекратить пищеварение.
- Центрифугируют клеточную суспензию при 350 x g в течение 5 мин, затем удаляют надосадочную жидкость.
- Промойте клетки один раз холодной DPBS, центрифугируйте при 350 x g в течение 5 мин, а затем удалите надосадочную жидкость.
- Подсчитайте и ресуспендируйте клетки в холодном 10% растворе FBS-DPBS (v/v) в концентрации 10 x 106 клеток/мл и распределите 100 мкл/пробирку клеточной суспензии (1 x 106 клеток/пробирка) в центрифужные пробирки по 1,5 мл.
- Добавьте 5 мкл раствора, блокирующего Fc-рецепторы человека, к 100 мкл клеточной суспензии. Инкубируют в течение 5-10 мин при РТ для выполнения неспецифической блокады.
- Центрифугу при 350 х г в течение 5 мин и удалить надосадочную жидкость. Промойте клетки дважды холодным 2% раствором FBS-DPBS (v/v).
- Повторно суспендировать ячейки в холодном 100 мкл 2% раствора FBS-DPBS (v/v).
- Добавьте 5 мкл (1 тест) анти-CD34-FITC и 5 мкл (1 тест) анти-CD45-APC к клетке объемом 100 мкл
Суспензия. Добавьте 5 мкл (1 тест) анти-CD73-APC, 5 мкл (1 тест) анти-CD90-FITC и 5 мкл (1 тест) анти-CD105-PE в еще одну 100-мкл клеточную суспензионную пробирку. Добавьте 5 мкл FITC для контроля изотипа IgG1 человека, контрольного полиэтиленового полиэтилена для контроля изотипа IgG1 человека и APC для контроля изотипа IgG1 человека в третью суспензионную пробирку на 100 мкл. Выдерживают 15-20 мин на льду в темноте. Тем временем подготовьте одинарные бусины. - Промойте клетки дважды холодным 2% раствором FBS-DPBS (v/v).
- Добавьте 300 мкл холодного 2% раствора FBS-DPBS (v/v) для ресуспендирования ячеек и отфильтруйте через сетчатый фильтр 200 меш.
- Проанализируйте образцы с помощью проточной цитометрии. Анализируют клеточную суспензию, окрашенную антителами к контролю изотипа, и устанавливают ворота. Затем анализируют клеточную суспензию, окрашенную антителами-мишенями.
5. Остеогенная дифференцировка МСК, индуцирующих ПСК
ПРИМЕЧАНИЕ: МСК, индуцирующие hiPSC, обладают потенциалом остеогенной дифференцировки (рис. 3A, B). Протокол остеогенной дифференцировки приведен ниже.
- Приготовьте остеогенную индукционную среду, добавив α-МЭМ 10% FBS, 100 нМ дексаметазона, 10 мМ бета-глицерофосфата и 100 мкМ аскорбиновой кислоты.
- Высейте 1 x 105 МСК в покрытую желатином 48-луночную планшет и культивируйте до тех пор, пока она не станет сливающейся на 60%-70%.
- Удалите среду и добавьте 0,3 мл остеогенной индукционной среды. Культивирование клеток в остеогенной индукционной среде в течение 14 дней при 37 °C, 5%CO2, со сменой среды каждые 3 дня.
- Удалите средство и промойте DPBS один раз.
- Добавьте 0,3 мл 4% PFA и инкубируйте при RT в течение 30 мин.
- Удалите PFA. Промыть клетки 0,3 мл ДПБС в течение 10 мин при РТ и повторить 3 раза.
- Удалить DPBS, добавить 0,2 мл раствора для окрашивания ализарина красного и инкубировать в течение 30 мин при RT.
- Раствор для окрашивания удалить, промыть клетки 0,3 мл DPBS в течение 10 мин при RT и повторить 3 раза.
- Наблюдайте за окрашиванием отложений кальция под световым микроскопом.
6. Адипогенная дифференцировка МСК, индуцирующих ПСК
ПРИМЕЧАНИЕ: МСК, управляемые ИПСК, обладают потенциалом адипогенной дифференцировки (рис. 3C, D). Протокол адипогенной дифференцировки приведен ниже.
- Подготовьте адипогенную индукционную среду, добавив α-МЭМ 10% FBS, 1 мкМ дексаметазона, 1 мкМ IBMX, 10 мкг/мл инсулина и 100 мкМ индометацина. Подготовьте адипогенную поддерживающую среду, добавив α-MEM с 10% FBS и инсулином 10 мкг/мл.
- Высевают 1 x 10,5 МСК в покрытую желатином 48-луночную планшет и культивируют до тех пор, пока плотность клеток не достигнет 90%.
- Удалите среду и добавьте 0,3 мл адипогенной индукционной среды. Продолжают культивировать клетки в адипогенной индукционной среде в течение 4 дней при 37 °C, 5% CO2.
- Удалите среду и добавьте 0,3 мл поддерживающей адипогенной среды. Продолжают культивировать клетки в адипогенной поддерживающей среде в течение 3 дней при 37 °C, 5% CO2.
- Повторите шаги 6.3 и 6.4 2-3 раза до дифференцировки и созревания адипоцитов.
- Удалите средство и промойте DPBS один раз.
- Добавьте 0,3 мл 4% PFA и инкубируйте при RT в течение 10 мин. Удалите PFA и промойте 2 раза DPBS.
- Нанесите краситель Oli Red O в соответствии с инструкцией производителя и наблюдайте за липидными каплями под световым микроскопом.
7. Хондрогенная дифференцировка МСК, управляемых ПССК
ПРИМЕЧАНИЕ: МСК, индуцирующие hiPSC, обладают хондрогенным дифференцировочным потенциалом (рис. 3E, F). Протокол хондрогенной дифференцировки приведен ниже.
- Приготовьте индукционную среду хондроббластов, добавив α-MEM 10% FBS, 100 нМ дексаметазона, 1% инсулин-трансферрин-селен (ITS), 10 мкМ аскорбиновой кислоты, 1 мМ пирувата натрия, 50 мкг/мл пролина, 0,02 нМ трансформирующего фактора роста β3 (TGFβ3) и 0,5 мкг/мл костного морфогенетического белка 6 (BMP-6).
- Соберите 2,5 x 105 МСК, приводящих ИПСК, и центрифугируйте клетки при 150 x g в течение 5 мин, затем удалите надосадочную жидкость. Суспендируйте клетки в 1 мл α-MEM, а затем центрифугируйте при 150 x g в течение 5 минут.
- Удалить надосадочную жидкость и суспендировать клетки в 0,5 мл хондрогенной индукционной среды. Центрифугируйте клетки при 150 x g в течение 5 мин.
- Непосредственно отвинтите крышку и культивируйте в течение 21 дня с хондрогенной индукционной средой, меняя каждые 3 дня при 37 °C, 5%CO2. Осторожно щелкайте центрифужной пробиркой, чтобы подвешивать хондрогенные гранулы (не разрушая хондрогенные гранулы) каждый день во время хондрогенной дифференцировки.
- Удалите надосадочную жидкость и дважды промойте 0,5 мл PBS.
- Добавьте 0,3 мл 4% PFA и зафиксируйте на 24 ч.
- Парафин встраивают в хондрогенные гранулы, а затем рассекают их (3 мкм). Окрасьте срезы толуидиновым синим (1%) в течение 30 мин.
- Понаблюдайте за внеклеточным матриксом хондроцитов под световым микроскопом.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В соответствии с протоколом (рис. 1А) ИПСК дифференцировали в МСК методами формирования ЭБ и монослойного культивирования. Во время дифференцировки клетки демонстрировали различную репрезентативную морфологию (рис. 1B, C).
Как показано на рисунке 1B, колонии ИПСК демонстрируют типичную компактную морфологию до дифференцировки с четкой границей, состоящей из плотно упакованных клеток. Однородные сферические ЭБ образуются после диссоциации и культивирования ИПСК в течение 24 ч на шейкере. В течение 1-7 суток культивирования в среде дифференцировки МСК гладкий край БЭ становился шероховатым, а объем БЭ увеличивался. С 8-го по 17-й день, после переноса БЭ на 6-луночную пластину с гель-покрытием из внеклеточного матрикса СКФ, БЭ постепенно прикреплялись к пластине, и многие адгезивные монослойные клетки распространялись вокруг ЭБ. Когда клетки достигали 90% слияния на 18-й день, клетки переваривали и высевали на культуральную пластину, покрытую желатином. На 19-е сутки клетка срослась и приобрела многоугольную форму. Последовательно клетки проходили дважды, когда они сливались на 90%. Полученные МСК постепенно созревали и приобретали типичную веретенообразную форму, а колония росла в завихре.
Как показано на рисунке 1С, объем клеток увеличился и распространился по колонии после замены поддерживающей среды ИПСК на поддерживающую среду МСК в течение 24 ч. При культивировании в поддерживающей среде МСК клетки постепенно пролиферировали и образовали многослойные адгезивные клетки. На 14-й день клетки переваривали и высевали на культуральную пластину, покрытую желатином. На 15-е сутки клетка склеилась и приобрела многоугольную форму. Последовательно клетки пассажировали 6 раз, когда они сливались на 90%. Полученные МСК постепенно созревали и приобретали типичную веретенообразную форму, а колония росла в завихре.
Поверхностные антигены ИПСК и МСК, индуцирующие ИПСК, анализировали методом проточной цитометрии (рис. 2). Как показано на рисунке 2C, ИПСК были положительными для CD90 и отрицательными для CD34, CD45, CD73 и CD105. После дифференцировки ИПСК в МСК с помощью обоих методов контрольные МСК были положительными для CD90, CD73 и CD105 и отрицательными для CD34 и CD45 (рис. 2A,B).
Дифференцировочную способность МСК, индуцирующих ИПСК, исследовали методом остеогенной, адипогенной и хондрогенной дифференцировки. Как показано на рисунке 3, оба МСК, управляемые ИПСК двух методов, дифференцировались на остеобласт, адипоцит и хондроцит. МСК, управляемые ИПСК монослойного метода, образовали больше отложений кальция, чем метод ЭБ (рис. 3B). Эти два метода не выявили существенных различий в адипогенной дифференцировке и хондрогенной дифференцировке (рис. 3D, F).
Способность МСК к пролиферации МСК, управляемых ИПСК, изучали с помощью культуры непрерывного пассажа. Как показано на рисунке 3G, МСК, управляемые ПССК обоих методов, могут пассажироваться более 20 пассажей и при этом сохранять способность к быстрой пролиферации.
Сравнение двух подходов, приведенных в таблице 1 , основано на времени дифференцировки, стоимости, способности клеток к пролиферации, экспрессии маркеров МСК и их способности к дифференцировке in vitro.
Рисунок 1: Дифференциация ИПСК в МСК с помощью метода формирования ЭБ и метода монослойного культивирования. (A) Схема, показывающая дифференцировку ИПСК в МСК с помощью образования ЭБ и культивирования монослоя. Морфология репрезентации клеток на ключевых фагах при получении МСК из ИПСК путем образования (В) ЭБ и (С) монослойной культуры. Масштабные линейки: 300 мкм и 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Анализ поверхностных антигенов МСК, управляемых ИПСК, методом проточной цитометрии. Процентное соотношение экспрессии поверхностных антигенов МСК в МСК, индуцирующих ИПСК, с помощью (А) образования БЭ и (В) монослойной культуры. (В) ИПСК использовали в качестве отрицательного контроля. Отрицательные маркеры МСК: CD34, CD45; Положительные маркеры МСК: CD73, CD90 и CD105. отрицательные маркеры ИПСК: CD34, CD45, CD73 и CD105; Положительные маркеры ИПСК: CD90. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Трехлинейная дифференцировка и способность к пролиферации МСК, индуцирующих ИПСК. (А) Окрашивание ализариновым красным кальциевых отложений МСК, индуцирующих ИПСК, в среде остеогенной дифференцировки в течение 2 недель. Масштабные линейки: 300 мкм. (B) Количественная оценка окрашивания ализариновым красным S с помощью анализа ImageJ. (C) Окрашивание олипо-красным О липидных капель МСК, индуцирующих ИПСК, в среде адипогенной дифференцировки в течение 2 недель. Масштабные линейки: 300 мкм. (D) Количественная оценка окрашивания Oli Red O с помощью анализа ImageJ. (E) Окрашивание толуидиновым синим внеклеточного матрикса хондроцитов. Масштабные линейки: 300 мкм и 150 мкм. (F) Количественная оценка окрашивания толуидиновым синим методом анализа ImageJ. (G) расчет времени удвоения популяции МСК, приводящих к ИПСК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
| Сравнение | Метод формирования ЭБ | Метод монослойных культур |
| Время дифференциации | 27 дней | 35 дней |
| Стоить | Высокий | Низкий |
| Скорость распространения | Быстрый | Быстрый |
| Способность к распространению | Проезд ≥20 | Проезд ≥20 |
| Экспрессия маркеров МСК | CD73/CD90/CD105 положительный,CD34/CD45 нагативный | CD73/CD90/CD105 положительный,CD34/CD45 нагативный |
| Возможность дифференциации | Адипогенная дифференцировка, хондрогенная дифференцировка и остеогенная дифференцировка | Адипогенная дифференцировка, хондрогенная дифференцировка и более сильная остеогенная дифференцировка |
| Операция | Сложный | Простой |
Таблица 1: Характеристика двух методов дифференцировки ИПСК в МСК.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В данном протоколе были рассмотрены два репрезентативных метода дифференцировки ИПСК в МСК 20,21,22,23,24,25,26,27,28,30. Оба метода были способны выводить МСК из ИПСК. МСК, полученные из ИПСК, были подтверждены морфологией клеток (рис. 1), поверхностными антигенами (рис. 2) и их способностью к дифференцировке (рис. 3).
Оба метода использовали одну и ту же поддерживающую среду МСК, в то время как метод EB также требовал среды дифференцировки МСК с TGF-β и FGF2. Кроме того, метод ЭБ требовал небольшого крепления 6-луночных планшетов и специального шейкера, который можно поместить в углекислотный инкубатор. Поэтому стоимость метода ЭБ была выше, чем у однослойного метода18,20. Метод ЭБ казался более сложным, чем метод однослойного. Однако время дифференциации метода ЭБ было короче, что позволило избежать многократных пассажей для обогащения МСК.
Мы обнаружили, что устойчивость к условиям окружающей среды метода ЭБ была выше, чем у метода монослоя. На оба метода влияли статус ИПСК, вмешательство человека и культуральная среда11,20. Тем не менее, мы обнаружили, что коэффициент успеха метода ЭБ был намного выше, чем у метода монослоя. Ключевым этапом метода БЭ была стадия дифференцировки БЭ с 1-го по 7-е сутки. В течение 1-7 дней, если БЭ постепенно уменьшаются в размерах или разрушаются с большим количеством плавающих мертвых клеток в питательной среде или образуют вакуолятные ЭБ, эти неквалифицированные БЭ испытывают трудности с прилипанием к желатиновой пластине и мало, если вообще есть, адгезивных клеток, выползающих из ЭБ. С 1-го по 7-й день квалифицированные БЭ были однородными и слегка увеличенными, гладкие края которых постепенно становились шероховатыми с выступающими клетками. После переноса на желатиновую пластину ЭБ быстро прилипали к пластине, и вокруг ЭБ распространялось много адгезивных монослойных клеток. Если EB квалифицированы в течение 1-7 дней, последующая дифференциация может быть легко достигнута. В отличие от этого, однослойный метод может потерпеть неудачу на любом этапе. С 1-го по 14-й день адгезивные клетки могут отпадать участками, что указывает на сбой дифференцировки. В норме адгезивные клетки размножаются и образуют многослойные адгезивные клетки. После 14-го дня однослойный метод по-прежнему не работает, потому что к чашке прикреплено мало клеток. В течение 0-13 дней монослойного метода мы наблюдали различную морфологию клеток в чашке. Однако морфология клеток методом БЭ на 8-17 сутки была однородной. По сравнению с монослойным методом, мы подозреваем, что метод ЭБ больше похож на процесс эмбрионального развития и является более контролируемым методом программируемой дифференцировки.
Оба метода могут быть использованы для более чем 20 проходов и при этом сохранять способность к быстрой пролиферации11. Кальциевые отложения остеогенной дифференцировки при монослойном методе были больше, чем при ЭБ-методе. Необходимо использовать сыворотку, специфичную для стволовых клеток, чтобы избежать влияния цитокинов в сыворотке на дифференцировку. Мы заметили, что клетки перестают размножаться, если плотность клеток слишком низкая. Так, после достижения слияния клетки необходимо пассировать в соотношении 1:3. При дифференцировке антибиотики не применялись; Поэтому строгое соблюдение надлежащей лабораторной практики (GLP) является обязательным для этой экспериментальной установки.
В заключение, были свои преимущества и недостатки для каждого метода, протестированного в этом протоколе. Оба метода могут генерировать МСК из ИПСК, выбор основан на требованиях пользователя.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы чрезвычайно благодарны всем членам Лаборатории Мао и Ху, бывшим и нынешним, за интересные дискуссии и большой вклад в проект. Мы благодарны Национальному клиническому исследовательскому центру детского здоровья за огромную поддержку. Это исследование было проведено при финансовой поддержке Национального фонда естественных наук Китая (U20A20351 Цзяньхуа Мао, 82200784 Лидань Ху), Фонда естественных наук провинции Чжэцзян Китая (No. LQ22C070004 Лидань Ху).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alizarin red staining kit | Beyotime Biotechnology | C0148S | |
| Anti-human-CD105 (PE) | Biolegend | 323206 | |
| Anti-human-CD34 (FITC) | Biolegend | 343503 | |
| Anti-human-CD45 (APC) | Biolegend | 304011 | |
| Anti-human-CD73( APC) | Biolegend | 344006 | |
| Anti-human-CD90 (FITC) | Biolegend | 328108 | |
| Ascorbic acid | Solarbio | A8100 | |
| BMP-6 | Novoprotein | C012 | |
| Carbon dioxide level shaker | Crystal | CO-06UC6 | |
| Compensation Beads | BioLegend | 424601 | |
| CryoStor CS10 | STEMCELL Technology | 07959 | |
| Dexamethasone | Beyotime Biotechnology | ST1254 | |
| DMEM/F12 medium | Servicebio | G4610 | |
| Fetal bovine serum | HAKATA | HS-FBS-500 | |
| FGF2 | Stemcell | 78003.1 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G2500-100G | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | |
| human IgG1 isotype control APC | BioLegend | 403505 | |
| human IgG1 isotype control FITC | BioLegend | 403507 | |
| human IgG1 isotype control PE | BioLegend | 403503 | |
| Human TGF-β1 | Stemcell | 78067 | |
| Human TruStain FcX | BioLegend | 422301 | |
| IBMX | Beyotime Biotechnology | ST1398 | |
| Indomethacin | Solarbio | SI9020 | |
| Insulin | Beyotime Biotechnology | P3376 | |
| iPSC maintenance medium | STEMCELL Technology | 85850 | |
| ITS Media Supplement | Beyotime Biotechnology | C0341-10mL | |
| Matrigel, growth factor reduced | BD Corning | 354230 | |
| Oli Red O staining kit | Beyotime Biotechnology | C0158S | |
| Proline | Solarbio | P0011 | |
| Sodium pyruvate | ThermoFisher | 11360-070 | |
| TGFβ3 | Novoprotein | CJ44 | |
| Toluidine blue staining kit | Solarbio | G2543 | |
| TrypLE Express Enzyme(1x) | Gibco | 12604013 | |
| Ultra-Low Attachment 6 Well Plate | Costar | 3471 | |
| Versene | Gibco | 15040-66 | |
| Y-27632 | Stemcell | 72304 | |
| α-MEM | Hyclone | SH30265 | |
| β-glycerophosphate | Solarbio | G8100 |
References
- Weng, Z., et al. Mesenchymal stem/stromal cell senescence: Hallmarks, mechanisms, and combating strategies. Stem Cells Translational Medicine. 11 (4), 356-371 (2022).
- Soliman, H., et al. Multipotent stromal cells: One name, multiple identities. Cell Stem Cell. 28 (10), 1690-1707 (2021).
- Friedenstein, A. J., Chailakhyan, R. K., Gerasimov, U. V. Bone marrow osteogenic stem cells: in vitro cultivation and transplantation in diffusion chambers. Cell and Tissue Kinetics. 20 (3), 263-272 (1987).
- Friedenstein, A. J., et al. Precursors for fibroblasts in different populations of hematopoietic cells as detected by the in vitro colony assay method. Experimental Hematology. 2 (2), 83-92 (1974).
- Friedenstein, A. J., Gorskaja, J. F., Kulagina, N. N. Fibroblast precursors in normal and irradiated mouse hematopoietic organs. Experimental Hematology. 4 (5), 267-274 (1976).
- El Agha, E., et al. Mesenchymal stem cells in fibrotic disease. Cell Stem Cell. 21 (2), 166-177 (2017).
- Mushahary, D., Spittler, A., Kasper, C., Weber, V., Charwat, V. Isolation, cultivation, and characterization of human mesenchymal stem cells. Cytometry A. 93 (1), 19-31 (2018).
- Ullah, M., Liu, D. D., Thakor, A. S. Mesenchymal stromal cell homing: Mechanisms and strategies for improvement. iScience. 15, 421-438 (2019).
- Regmi, S., et al. Enhanced viability and function of mesenchymal stromal cell spheroids is mediated via autophagy induction. Autophagy. 17 (10), 2991-3010 (2021).
- Hoang, D. M., et al. Stem cell-based therapy for human diseases. Signal Transduction and Targeted Therapy. 7 (1), 272 (2022).
- Jiang, B., et al. Concise review: Mesenchymal stem cells derived from human pluripotent cells, an unlimited and quality-controllable source for therapeutic applications. Stem Cells. 37 (5), 572-581 (2019).
- Soontararak, S., et al. Mesenchymal stem cells (MSC) derived from induced pluripotent stem cells (iPSC) equivalent to adipose-derived MSC in promoting intestinal healing and microbiome normalization in mouse inflammatory bowel disease model. Stem Cells Translational Medicine. 7 (6), 456-467 (2018).
- Di Baldassarre, A., Cimetta, E., Bollini, S., Gaggi, G., Ghinassi, B. Human-induced pluripotent stem cell technology and cardiomyocyte generation: Progress and clinical applications. Cells. 7 (6), 48 (2018).
- Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress. Nature Reviews. Drug Discovery. 16 (2), 115-130 (2017).
- Levy, O., et al. Shattering barriers toward clinically meaningful MSC therapies. Science Advances. 6 (30), eaba6884 (2020).
- Zhao, C., Ikeya, M. Generation and applications of induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells International. 2018, 9601623 (2018).
- Path, G., Perakakis, N., Mantzoros, C. S., Seufert, J. Stem cells in the treatment of diabetes mellitus - Focus on mesenchymal stem cells. Metabolism. 90, 1-15 (2019).
- Zhou, Y., et al. One-step derivation of functional mesenchymal stem cells from human pluripotent stem cells. Bio-Protocol. 8 (22), e3080 (2018).
- Hua, Z., et al. Low-intensity pulsed ultrasound promotes osteogenic potential of iPSC-derived MSCs but fails to simplify the iPSC-EB-MSC differentiation process. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 841778 (2022).
- Dupuis, V., Oltra, E. Methods to produce induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells: Mesenchymal stem cells from induced pluripotent stem cells. World Journal of Stem Cells. 13 (8), 1094-1111 (2021).
- Zhang, W., et al. Aging stem cells. A Werner syndrome stem cell model unveils heterochromatin alterations as a driver of human aging. Science. 348 (6239), 1160-1163 (2015).
- Liu, G. H., et al. Modelling Fanconi anemia pathogenesis and therapeutics using integration-free patient-derived iPSCs. Nature Communications. 5, 4330 (2014).
- Kubben, N., et al. Repression of the antioxidant NRF2 pathway in premature aging. Cell. 165 (6), 1361-1374 (2016).
- Duan, S., et al. PTEN deficiency reprogrammes human neural stem cells towards a glioblastoma stem cell-like phenotype. Nature Communications. 6, 10068 (2015).
- Zhang, J., et al. Exosomes released from human induced pluripotent stem cells-derived MSCs facilitate cutaneous wound healing by promoting collagen synthesis and angiogenesis. Journal of Translational Medicine. 13, 49 (2015).
- Hu, G. W., et al. Exosomes secreted by human-induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells attenuate limb ischemia by promoting angiogenesis in mice. Stem Cell Research & Therapy. 6 (1), 10 (2015).
- Kang, R., et al. Mesenchymal stem cells derived from human induced pluripotent stem cells retain adequate osteogenicity and chondrogenicity but less adipogenicity. Stem Cell Research & Therapy. 6 (1), 144 (2015).
- Wang, L. T., et al. Differentiation of mesenchymal stem cells from human induced pluripotent stem cells results in downregulation of c-Myc and DNA replication pathways with immunomodulation toward CD4 and CD8 cells. Stem Cells. 36 (6), 903-914 (2018).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Kim, S., Kim, T. M. Generation of mesenchymal stem-like cells for producing extracellular vesicles. World Journal of Stem Cells. 11 (5), 270-280 (2019).
