Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

मेसेनकाइमल स्ट्रोमल कोशिकाओं में मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं के भेदभाव के लिए दो प्रतिनिधि तरीकों की तुलना

Published: October 20, 2023 doi: 10.3791/65729
Automatic Translation
1, 2,3, 4, 2, 1,2, 2,3
1National Clinical Research Center for Child Health, The Children's Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 2Department of Nephrology, The Children's Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 3Zhejiang University School of Medicine, 4Liangzhu Laboratory, Zhejiang University

Summary

यह प्रोटोकॉल mesenchymal stromal कोशिकाओं (MSCs) में hiPSCs अंतर के लिए दो प्रतिनिधि तरीकों का वर्णन करता है और तुलना करता है. मोनोलेयर विधि को कम लागत, सरल संचालन और आसान ओस्टोजेनिक भेदभाव की विशेषता है। भ्रूण निकायों (ईबी) विधि को कम समय की खपत की विशेषता है।

Abstract

मेसेनकाइमल स्ट्रोमल कोशिकाएं (एमएससी) वयस्क प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल हैं जिनका पुनर्योजी चिकित्सा में व्यापक रूप से उपयोग किया गया है। चूंकि दैहिक ऊतक-व्युत्पन्न एमएससी सीमित दान, गुणवत्ता भिन्नताओं और जैव सुरक्षा द्वारा प्रतिबंधित हैं, पिछले 10 वर्षों में मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (एचआईपीएससी) से एमएससी उत्पन्न करने के प्रयासों में काफी वृद्धि देखी गई है। एमएससी में एचआईपीएससी के भेदभाव में पिछले और हाल के प्रयास दो संस्कृति पद्धतियों के आसपास केंद्रित हैं: (1) भ्रूण निकायों (ईबी) का गठन और (2) मोनोलेयर संस्कृति का उपयोग। यह प्रोटोकॉल hiPSCs से MSC प्राप्त करने में इन दो प्रतिनिधि तरीकों का वर्णन करता है। प्रत्येक विधि अपने फायदे और नुकसान प्रस्तुत करती है, जिसमें समय, लागत, सेल प्रसार क्षमता, एमएससी मार्करों की अभिव्यक्ति और इन विट्रो में भेदभाव की उनकी क्षमता शामिल है। यह प्रोटोकॉल दर्शाता है कि दोनों विधियां एचआईपीएससी से परिपक्व और कार्यात्मक एमएससी प्राप्त कर सकती हैं। मोनोलेयर विधि को कम लागत, सरल संचालन और आसान ओस्टोजेनिक भेदभाव की विशेषता है, जबकि ईबी विधि को कम समय की खपत की विशेषता है।

Introduction

मेसेनकाइमल स्ट्रोमल कोशिकाएं (एमएससी) मेसोडर्म-व्युत्पन्न वयस्क प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल1 हैं। एमएससी लगभग सभी संयोजी ऊतकों में मौजूद हैं2. चूंकि MSCs को पहली बार 1970 के दशक में खोजा गया था और 1987 में फ्राइडेनस्टीन एट अल 3,4,5 द्वारा अस्थि मज्जा से सफलतापूर्वक अलग किया गया था, इसलिए विभिन्न प्रकार के मानव दैहिक (भ्रूण और वयस्क सहित) ऊतकों का उपयोग एमएससी जैसे हड्डी, उपास्थि, कण्डरा, मांसपेशियों, वसा ऊतक, और हेमटोपोइएटिक-सहायक स्ट्रोमा 1,2,6,7 को अलग करने के लिए किया गया है. एमएससी कई दैहिक सेल वंशावली में अंतर करने के लिए उच्च प्रोलिफेरेटिव क्षमताओं और प्लास्टिसिटी का प्रदर्शन करते हैं और घायल और सूजन वाले ऊतकों 2,8,9 में पलायन कर सकते हैं। ये गुण एमएससी को पुनर्योजी चिकित्सा10 के लिए एक संभावित उम्मीदवार बनाते हैं। हालांकि, दैहिक ऊतक-व्युत्पन्न एमएससी (एसटी-एमएससी) सीमित दान, सीमित सेल प्रोलिफेरेटिव क्षमता, गुणवत्ता भिन्नताओं, और रोगजनकों के संभावित संचरण के लिए जैव सुरक्षा चिंता, यदि कोई हो, दाताओं11,12 से प्रतिबंधित हैं।

मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (hiPSCs) प्रतिलेखन कारकों (Oct4, Sox2, Klf4, और c-Myc) के साथ वयस्क कोशिकाओं reprogramming से ली गई है, जो भ्रूण स्टेम कोशिकाओं13,14 के रूप में समान कार्य है. वे आत्म-नवीनीकरण कर सकते हैं और एमएससी सहित किसी भी प्रकार की दैहिक कोशिकाओं में अंतर करने की क्षमता रखते हैं। एसटी-एमएससी की तुलना में, आईपीएससी-एमएससी में असीमित आपूर्ति, कम लागत, उच्च शुद्धता, गुणवत्ता नियंत्रण में सुविधा, पैमाने पर उत्पादन और जीन संशोधन 15,16,17 के लिए आसान का लाभ है।

IPSC-MSCs के इन फायदों के कारण, IPSC से MSC ड्राइविंग तरीकों की एक किस्म की सूचना दी गई है. इन भेदभाव विधियों को दो संस्कृति पद्धतियों के आसपास केंद्रित किया गया है: (1) भ्रूण निकायों (ईबी) का गठन और (2) मोनोलेयर संस्कृतियों का उपयोग 11,18,19,20. इसमें, दो पद्धतियों में से प्रत्येक के लिए एक प्रतिनिधि दृष्टिकोण की विशेषता थी। इसके अलावा, समय, लागत, प्रोलिफेरेटिव क्षमता, एमएससी बायोमार्कर की अभिव्यक्ति और इन विट्रो में भेदभाव क्षमता के आधार पर दो प्रतिनिधि दृष्टिकोणों के बीच तुलना भी एक्सेस की गई थी।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. hiPSCs रखरखाव

  1. hiPSC का विगलन
    1. तरल नाइट्रोजन से कोशिकाओं को बाहर निकालें और जल्दी से 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में कोशिकाओं को पिघलाएं। विगलन कोशिकाओं को एक 15 एमएल ट्यूब के साथ तैयार करने के लिए स्थानांतरण 3 आईपीएससी रखरखाव माध्यम के एमएल (सामग्री की तालिका). धीरे से मध्यम मिलाएं।
    2. 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला निकालें, और धीरे में कोशिकाओं को फिर से निलंबित 1 आईपीएससी रखरखाव माध्यम के 1 एमएल 10 माइक्रोन वाई -27632 (पिपेट कोशिकाओं ऊपर और नीचे 2-3 बार).
    3. कोशिकाओं निलंबन को 6-अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट में स्थानांतरित करें जो विकास कारक कम (जीएफआर) -बाह्य मैट्रिक्स जेल (1:100) और आईपीएससी रखरखाव माध्यम के 2 एमएल के साथ 10 माइक्रोन वाई -27632 अग्रिम में जोड़ा गया (लगभग 4 एक्स 104 कोशिकाओं / सेमी2)।
    4. संस्कृति 37 डिग्री सेल्सियस पर 5-6 दिनों (80% -90% संगम) के लिए कोशिकाओं की, IPSC रखरखाव मीडिया के साथ 5% सीओ2 हर दिन बदलें.
  2. HiPSC का मार्ग
    1. 6 अच्छी तरह से थाली से IPSC रखरखाव माध्यम निकालें. डीपीबीएस के साथ एक बार hiPSCs धो लें।
    2. 0.48 एमएम ईडीटीए समाधान के 700-800 माइक्रोन जोड़ें और कमरे के तापमान (आरटी) पर 1 मिन के लिए इनक्यूबेट करें, फिर पाचन समाधान को हटा दें। 3-5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस तापमान पर सेते जारी रखें.
    3. जब कोशिकाओं को चादरों में पचा रहे हैं (एकल कोशिकाओं में कोशिकाओं को पचाने नहीं है), जोड़ें 1 आईपीएससी रखरखाव माध्यम के साथ 10 माइक्रोन Y-27632 पाचन समाप्त करने के लिए. ध्यान से कोशिकाओं ऊपर और नीचे 2-3 बार विंदुक.
    4. सेल निलंबन को 6-अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट में स्थानांतरित करें जो विकास कारक कम (जीएफआर) -बाह्य मैट्रिक्स जेल (1:100) और आईपीएससी रखरखाव माध्यम के 2 एमएल के साथ लेपित 10 माइक्रोन वाई -27632 अग्रिम में जोड़ा गया है।
      नोट: पासिंग अनुपात 1:6 से 1:20 (लगभग 4 x 104 कोशिकाओं/सेमी2) तक होता है, और औसत एकत्रीकरण आकार लगभग 50-200 माइक्रोन होता है।
    5. 37 डिग्री सेल्सियस पर 80% -90% संगम (5-6 दिन) तक कोशिकाओं की संस्कृति, आईपीएससी रखरखाव मीडिया के साथ 5% सीओ2 हर दिन बदलते हैं।

2. EB गठन के माध्यम से hiPSCs से MSCs भेदभाव

नोट: विधि पिछले साहित्य 21,22,23,24 से ली गई है। विधि का अवलोकन चित्रा 1 में सचित्र है. विधि की विशेषताओं को तालिका 1में संक्षेप में प्रस्तुत किया गया है।

  1. माध्यम की तैयारी
    1. 1% (v/v) GlutaMAX, 10% (v/v) FBS, 10 ng/mL FGF2, और 5 ng/mL TGFβ के साथ α-MEM को पूरक करके MSC भेदभाव माध्यम तैयार करें।
    2. 1% (वी / वी) ग्लूटोमैक्स, 10% (वी / वी) एफबीएस, और 1 एनजी / एमएल एफजीएफ 2 के साथ α-एमईएम को पूरक करके एमएससी रखरखाव माध्यम तैयार करें।
  2. hiPSCs की तैयारी
    1. संस्कृति hiPSCs लाइनों (पारित कम से कम 2-3 विगलन के बाद बार) एक 6 अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति था विकास कारक कम (जीएफआर) के साथ लेपित ऊतक संस्कृति प्लेट पर आईपीएससी रखरखाव माध्यम में (1:100) 37 डिग्री सेल्सियस पर, 5% सीओ2 तक 80% -90% संगम.
  3. दिन 0: EB गठन
    1. 6 अच्छी तरह से थाली से IPSC रखरखाव माध्यम निकालें. डीपीबीएस के साथ एक बार hiPSCs धो लें।
    2. 0.48 एमएम ईडीटीए समाधान के 700-800 माइक्रोन जोड़ें और आरटी पर 1 मिन के लिए इनक्यूबेट करें, फिर पाचन समाधान को हटा दें। 3-5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस तापमान पर सेते जारी रखें.
    3. जब कोशिकाओं को चादरों में पचा रहे हैं (एकल कोशिकाओं में कोशिकाओं को पचाने नहीं), आईपीएससी रखरखाव माध्यम के 2 एमएल जोड़ें (10 माइक्रोन रॉक अवरोधक और 1:100 जीएफआर-बाह्य मैट्रिक्स जेल युक्त) पाचन समाप्त करने के लिए.
    4. कोशिकाओं को 6-अच्छी तरह से कम लगाव प्लेट में स्थानांतरित करें। कम लगाव प्लेट के 1 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट के 2 कुओं के अनुपात में कोशिकाओं बीज. गोलाकार ईबी बनाने के लिए 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 पर एक प्रकार के बरतन (60 आरपीएम / मिनट) में कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  4. दिन 1-दिन 7: EB भेदभाव
    1. ईबीएस को पाश्चर विंदुक (ईबी को नष्ट किए बिना) के साथ अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित करें और आरटी पर 5-10 मिनट के लिए ईबीएस को स्वाभाविक रूप से तलछट दें। फिर, सतह पर तैरनेवाला हटा दें।
    2. ईबीएस को एमएससी भेदभाव माध्यम के 2 एमएल के साथ 6-अच्छी तरह से कम लगाव प्लेट में स्थानांतरित करें। संस्कृति 37 डिग्री सेल्सियस पर शेकर पर ईबीएस, मध्यम परिवर्तन के साथ 7 दिनों के लिए 5% सीओ2 एक बार।
  5. दिन 8-दिन 17: ईबी टीकाकरण
    1. ईबीएस को पाश्चर विंदुक (ईबी को नष्ट किए बिना) के साथ अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित करें और ईबीएस को स्वाभाविक रूप से 5-10 मिनट के लिए तलछट दें। फिर, सतह पर तैरनेवाला हटा दें।
    2. ईबीएस को जीएफआर-बाह्य मैट्रिक्स जेल-लेपित 6-अच्छी प्लेट में एमएससी रखरखाव माध्यम के 2 एमएल के साथ स्थानांतरित करें। सेल आसंजन के बाद नियमित रूप से मीडिया परिवर्तन के साथ 90% संगम (~ 10 दिन) तक संस्कृति।
  6. दिन 18-दिन 27: MSCs परिपक्वता और विस्तार
    1. 5-10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक पृथक्करण समाधान के साथ ईबी-व्युत्पन्न संस्कृति का इलाज करें (पाचन समय विभिन्न सेल प्रकारों की उपस्थिति के कारण बदलता रहता है)।
    2. जब कोशिकाओं का हिस्सा एकल कोशिकाओं में पच जाता है, तो पाचन को समाप्त करने के लिए एमएससी रखरखाव माध्यम के 2 एमएल जोड़ें और सेल निलंबन को एक अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित करें। शेष अपचित कोशिकाओं को एक बार डीपीबीएस से धोएं और फिर से पचाएं। कई बार दोहराएं जब तक कि सभी कोशिकाएं एकल कोशिकाओं में पच न जाएं। 5 मिनट के लिए 250 x ग्राम पर सेल निलंबन अपकेंद्रित्र, तो सतह पर तैरनेवाला हटा दें.
    3. एक जिलेटिन लेपित संस्कृति प्लेट (के बारे में 2 एक्स 10,5 कोशिकाओं / सेमी2) पर कोशिकाओं बीज. नियमित रूप से मध्यम परिवर्तन के साथ एमएससी रखरखाव माध्यम में 90% संगम तक संस्कृति। इस बिंदु पर कोशिकाओं की इस पीढ़ी को मार्ग 0 (P0) के रूप में नामित करें।
    4. एमएससी को शुद्ध और परिपक्व बनाने के लिए, लगभग 6 दिनों में 1: 3 विभाजन अनुपात में कोशिकाओं को दो बार पारित करना जारी रखें। अधिकांश कोशिकाएं फाइब्रोब्लास्ट जैसी आकृति विज्ञान (धुरी के आकार का) पेश करती हैं।

3. मोनोलेयर संस्कृति के माध्यम से hiPSCs से MSCs भेदभाव

नोट: विधि पिछले साहित्य25,26,27,28 से ली गई है। इस विधि का अवलोकन चित्रा 1 में सचित्र है. विधि की विशेषताओं को तालिका 1में संक्षेप में प्रस्तुत किया गया है।

  1. माध्यम की तैयारी
    1. 1% (v/v) GlutMAX, 10% (v/v) FBS, और 1 ng/mL FGF2 के साथ α-MEM को पूरक करके MSC रखरखाव माध्यम तैयार करें।
  2. hiPSCs की तैयारी
    1. संस्कृति hiPSCs लाइनों (पारित कम से कम 2-3 विगलन के बाद बार) एक 6 अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति था विकास कारक कम (जीएफआर) -बाह्य मैट्रिक्स जेल (1:100) के साथ लेपित 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 50% -60% संगम के साथ लेपित आईपीएससी रखरखाव माध्यम में.
  3. दिन 0-दिन 13: प्रत्यक्ष मोनोलेयर संस्कृतियों द्वारा भेदभाव
    1. 6 अच्छी तरह से थाली से IPSC रखरखाव माध्यम निकालें.
    2. हर दिन मीडिया परिवर्तन के साथ 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 पर 14 दिनों के लिए एमएससी रखरखाव माध्यम और संस्कृति के 2 एमएल को सीधे जोड़ें।
  4. दिन 14-दिन 35: बार-बार पारित होने से एमएससी परिपक्वता
    1. 5-10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक पृथक्करण समाधान के साथ मोनोलेयर संस्कृतियों का इलाज करें (पाचन समय विभिन्न सेल प्रकारों की उपस्थिति के कारण बदलता रहता है)।
    2. जब कोशिकाओं को एकल कोशिकाओं में पचा लिया जाता है, तो पाचन को समाप्त करने के लिए एमएससी रखरखाव माध्यम के 2 एमएल जोड़ें और सेल निलंबन को अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित करें। शेष अपचित कोशिकाओं को एक बार डीपीबीएस से धोएं और फिर से पचाएं। कई बार दोहराएं जब तक कि सभी कोशिकाएं एकल कोशिकाओं में पच न जाएं। 5 मिनट के लिए 250 x ग्राम पर सेल निलंबन अपकेंद्रित्र, तो सतह पर तैरनेवाला हटा दें.
    3. एक जिलेटिन लेपित संस्कृति पकवान (के बारे में 2 एक्स 10,5 कोशिकाओं / सेमी2) पर कोशिकाओं बीज. मीडिया परिवर्तन के साथ एमएससी रखरखाव माध्यम में 90% संगम तक संस्कृति। इस बिंदु पर कोशिकाओं की इस पीढ़ी को मार्ग 0 (P0) के रूप में नामित करें।
    4. एमएससी को शुद्ध और परिपक्व बनाने के लिए, लगभग 18 दिनों में 1:3 विभाजन अनुपात में कोशिकाओं को 6 बार पारित करना जारी रखें। अधिकांश कोशिकाएं फाइब्रोब्लास्ट जैसी आकृति विज्ञान (धुरी के आकार का) पेश करती हैं।

4. प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा hiPSC-ड्राइविंग MSCs का भूतल प्रतिजन विश्लेषण

नोट: अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न एमएससी की सतह एंटीजन के समान, हिपीएससी-ड्राइविंग एमएससी एक्सप्रेस सीडी 105, सीडी 73 और सीडी 90, लेकिन सीडी 45, सीडी 3429 व्यक्त नहीं करते हैं। इसके अलावा, hiPSCs नकारात्मक नियंत्रण कोशिकाओं के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा hiPSC-ड्राइविंग MSCs और hiPSCs की सतह प्रतिजनों विश्लेषण चित्रा 2 में दिखाया गया है.

  1. 2-3 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक पृथक्करण समाधान के साथ hiPSC ड्राइविंग MSCs का इलाज करें। 0.48 मिमी EDTA पृथक्करण अभिकर्मक के साथ hiPSCs का इलाज करें और आरटी पर 1 मिनट के लिए सेते हैं, फिर पृथक्करण अभिकर्मक को हटा दें। 3-5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस तापमान पर सेते जारी रखें.
  2. जब कोशिकाओं को एकल कोशिकाओं में पचा रहे हैं, मध्यम जोड़ें (MSCs के लिए MSC रखरखाव माध्यम और IPSC के लिए IPSC रखरखाव माध्यम) पाचन समाप्त करने के लिए.
  3. 5 मिनट के लिए 350 x ग्राम पर सेल निलंबन अपकेंद्रित्र, तो सतह पर तैरनेवाला हटा दें.
  4. ठंड DPBS, 5 मिनट के लिए 350 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र के साथ एक बार कोशिकाओं को धो लें, और फिर सतह पर तैरनेवाला हटा दें.
  5. 10 x 106 कोशिकाओं /एमएल पर ठंडे 10% एफबीएस-डीपीबीएस (वी/वी) समाधान में कोशिकाओं की गणना करें और उन्हें फिर से निलंबित करें और सेल निलंबन (1 x 10,6 कोशिकाओं/ट्यूब) के 100 माइक्रोन/ट्यूब को 1.5 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूबों में वितरित करें।
  6. सेल निलंबन के 100 माइक्रोन में मानव एफसी रिसेप्टर-अवरुद्ध समाधान के 5 माइक्रोन जोड़ें। आरटी पर 5-10 मिनट के लिए सेते nonspecific अवरुद्ध प्रदर्शन करने के लिए.
  7. 5 मिनट के लिए 350 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला हटा दें। कोशिकाओं को ठंडे 2% FBS-DPBS (v/v) समाधान से दो बार धोएं।
  8. 2% FBS-DPBS (v/v) समाधान के ठंडे 100 μL में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
  9. एंटी-सीडी 34-एफआईटीसी के 5 माइक्रोन (1 परीक्षण) और एंटी-सीडी 45-एपीसी के 5 माइक्रोन (1 परीक्षण) को 100 माइक्रोन सेल में जोड़ें
    निलंबन। एंटी-सीडी 73-एपीसी के 5 माइक्रोन (1 परीक्षण), एंटी-सीडी 90-एफआईटीसी के 5 माइक्रोन (1 परीक्षण) और एंटी-सीडी 105-पीई के 5 माइक्रोन (1 परीक्षण) को एक और 100 माइक्रोन सेल निलंबन ट्यूब में जोड़ें। तीसरे 100 माइक्रोन सेल सस्पेंशन ट्यूब में मानव IgG1 आइसोटाइप नियंत्रण FITC, मानव IgG1 आइसोटाइप नियंत्रण PE और मानव IgG1 आइसोटाइप नियंत्रण APC के 5 माइक्रोन जोड़ें। अंधेरे में बर्फ पर 15-20 मिनट के लिए सेते हैं. इस बीच, एकल धुंधला मोती तैयार.
  10. कोशिकाओं को ठंडे 2% FBS-DPBS (v/v) समाधान से दो बार धोएं।
  11. कोशिकाओं को फिर से निलंबित करने के लिए ठंडे 2% एफबीएस-डीपीबीएस (वी / वी) समाधान के 300 माइक्रोन जोड़ें, और 200 जाल स्क्रीन फिल्टर के माध्यम से फ़िल्टर करें।
  12. प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके नमूनों का विश्लेषण करें। आइसोटाइप नियंत्रण एंटीबॉडी और सेट गेट के साथ सना हुआ सेल निलंबन का विश्लेषण करें। फिर लक्ष्य एंटीबॉडी के साथ दाग सेल निलंबन का विश्लेषण.

5. hiPSC ड्राइविंग MSCs के Osteogenic भेदभाव

नोट: एचआईपीएससी-ड्राइविंग एमएससी में ओस्टोजेनिक भेदभाव क्षमता(चित्रा 3ए, बी)है। ओस्टोजेनिक भेदभाव के लिए प्रोटोकॉल नीचे दिया गया है।

  1. 10% एफबीएस, 100 एनएम डेक्सामेथासोन, 10 एमएम बीटा-ग्लिसरोफॉस्फेट और 100 माइक्रोन एस्कॉर्बिक एसिड के साथ α-एमईएम को पूरक करके ओस्टोजेनिक इंडक्शन माध्यम तैयार करें।
  2. बीज 1 x 105 एमएससी एक जिलेटिन-लेपित 48-अच्छी प्लेट और संस्कृति में जब तक कि यह 60% -70% संगम न हो।
  3. माध्यम निकालें और ओस्टोजेनिक प्रेरण माध्यम के 0.3 एमएल जोड़ें। संस्कृति 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 पर 14 दिनों के लिए एक ओस्टोजेनिक प्रेरण माध्यम मेंकोशिकाओं, मीडिया हर 3 दिनों में परिवर्तन के साथ।
  4. माध्यम निकालें और एक बार डीपीबीएस से धो लें।
  5. 4% पीएफए के 0.3 एमएल जोड़ें और 30 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं.
  6. पीएफए निकालें। आरटी पर 10 मिनट के लिए डीपीबीएस के 0.3 एमएल के साथ कोशिकाओं को कुल्ला और 3 बार दोहराएं।
  7. डीपीबीएस निकालें, एलिज़रीन लाल धुंधला समाधान के 0.2 एमएल जोड़ें, और आरटी पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  8. धुंधला समाधान निकालें, आरटी पर 10 मिनट के लिए 0.3 एमएल डीपीबीएस के साथ कोशिकाओं को कुल्ला, और 3 बार दोहराएं।
  9. एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत कैल्शियम जमाव के धुंधला निरीक्षण करें.

6. hiPSC-ड्राइविंग MSCs का एडिपोजेनिक भेदभाव

नोट: एचआईपीएससी-ड्राइविंग एमएससी में एडिपोजेनिक भेदभाव क्षमता होती है (चित्र 3सी, डी)। एडिपोजेनिक भेदभाव के लिए प्रोटोकॉल नीचे दिया गया है।

  1. 10% FBS, 1 μM डेक्सामेथासोन, 1 μM IBMX, 10 μg/mL इंसुलिन, और 100 μM इंडोमेथेसिन के साथ α-MEM को पूरक करके एडिपोजेनिक इंडक्शन माध्यम तैयार करें। 10% एफबीएस और 10 माइक्रोग्राम/एमएल इंसुलिन के साथ α-एमईएम को पूरक करके एडिपोजेनिक रखरखाव माध्यम तैयार करें।
  2. बीज 1 x 105 MSCs एक जिलेटिन-लेपित 48-अच्छी तरह से प्लेट और संस्कृति में जब तक सेल घनत्व 90% तक नहीं पहुंच जाता।
  3. माध्यम निकालें और एडिपोजेनिक प्रेरण माध्यम के 0.3 एमएल जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 पर 4 दिनों के लिए एडिपोजेनिक प्रेरण माध्यम में कोशिकाओं को संस्कृति करना जारी रखें।
  4. माध्यम निकालें और एडिपोजेनिक रखरखाव माध्यम के 0.3 एमएल जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 पर 3 दिनों के लिए एडिपोजेनिक रखरखाव माध्यम में कोशिकाओं को संस्कृति करना जारी रखें।
  5. दोहराएँ कदम 6.3 और 6.4 2-3 बार adipocyte भेदभाव और परिपक्वता तक.
  6. माध्यम निकालें और एक बार डीपीबीएस से धो लें।
  7. 4% पीएफए के 0.3 एमएल जोड़ें और 10 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं। पीएफए निकालें और डीपीबीएस के साथ 2 बार कुल्ला।
  8. निर्माता के निर्देश के अनुसार ओली रेड ओ दाग लागू करें और एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के नीचे लिपिड बूंदों का निरीक्षण करें।

7. hiPSC ड्राइविंग MSCs के Chondrogenic भेदभाव

नोट: एचआईपीएससी-ड्राइविंग एमएससी में चोंड्रोजेनिक भेदभाव क्षमता (चित्रा 3ई, एफ) होती है। चोंड्रोजेनिक भेदभाव के लिए प्रोटोकॉल नीचे दिया गया है.

  1. 10% FBS, 100 एनएम डेक्सामेथासोन, 1% इंसुलिन-ट्रांसफरिन-सेलेनियम (ITS), 10 माइक्रोन एस्कॉर्बिक एसिड, 1 एमएम सोडियम पाइरूवेट, 50 माइक्रोग्राम / एमएल प्रोलाइन, 0.02 एनएम ट्रांसफॉर्मिंग ग्रोथ फैक्टर β3 (TGFβ3), और 0.5 μg/mL हड्डी मॉर्फोजेनेटिक प्रोटीन 6 (BMP-6) के साथ α-एमईएम को पूरक करके चोंड्रोब्लास्ट इंडक्शन माध्यम तैयार करें।
  2. 2.5 x 105 hiPSC ड्राइविंग MSCs लीजिए और 5 मिनट के लिए 150 x ग्राम पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र, तो सतह पर तैरनेवाला हटा दें. α-एमईएम के 1 एमएल में कोशिकाओं को निलंबित करें और फिर 5 मिन के लिए 150 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र करें।
  3. सतह पर तैरनेवाला निकालें और चोंड्रोजेनिक प्रेरण माध्यम के 0.5 एमएल में कोशिकाओं को निलंबित करें। 5 मिनट के लिए 150 x ग्राम पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र.
  4. सीधे ढक्कन और संस्कृति के लिए खोल 21 chondrogenic प्रेरण मीडिया परिवर्तन के साथ हर 3 दिन में 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2. चोंड्रोजेनिक भेदभाव के दौरान हर दिन चोंड्रोजेनिक छर्रों (चोंड्रोजेनिक छर्रों को नष्ट किए बिना) को निलंबित करने के लिए अपकेंद्रित्र ट्यूब को धीरे से झटका दें।
  5. सतह पर तैरनेवाला निकालें और दो बार पीबीएस के 0.5 एमएल के साथ धो लें।
  6. 4% पीएफए के 0.3 एमएल जोड़ें और 24 घंटे के लिए तय करें।
  7. पैराफिन चोंड्रोजेनिक छर्रों को एम्बेड करता है, और फिर उन्हें अनुभाग (3 माइक्रोन)। 30 मिनट के लिए टोल्यूइडीन ब्लू (1%) में वर्गों को दागें।
  8. एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत बाह्य चोंड्रोसाइट मैट्रिक्स का निरीक्षण करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

प्रोटोकॉल (चित्रा 1 ए) के बाद, एचआईपीएससी को ईबी गठन और मोनोलेयर संस्कृति विधियों के माध्यम से एमएससी में विभेदित किया गया था। भेदभाव के दौरान, कोशिकाओं ने विभिन्न प्रतिनिधि आकारिकी (चित्रा 1बी, सी) दिखाई।

जैसा कि चित्रा 1 बी में दिखाया गया है, एचआईपीएससी कालोनियों कसकर पैक कोशिकाओं से बना एक स्पष्ट सीमा के साथ भेदभाव से पहले ठेठ कॉम्पैक्ट आकारिकी प्रदर्शित करते हैं। हिपीएससी के बाद गठित वर्दी गोलाकार ईबीएस शेकर पर 24 घंटे के लिए अलग और संवर्धन करते हैं। एमएससी भेदभाव माध्यम में संस्कृति के दिन 1 से दिन 7 के दौरान, ईबी का चिकना किनारा खुरदरा हो गया, और ईबी की मात्रा बड़ी हो गई। दिन 8 से दिन 17 तक, ईबीएस को जीएफआर-बाह्य मैट्रिक्स जेल-लेपित 6-अच्छी प्लेट में स्थानांतरित करने के बाद, ईबीएस धीरे-धीरे प्लेट का पालन करते थे, और कई पक्षपाती मोनोलेयर कोशिकाएं ईबीएस के चारों ओर फैल जाती थीं। जब कोशिकाओं 18 दिन पर 90% संगम तक पहुंच गया, कोशिकाओं को पचा रहे थे और एक जिलेटिन-लेपित संस्कृति प्लेट पर वरीयता प्राप्त थे. 19 वें दिन, कोशिका ने पालन किया और एक बहुभुज आकार दिखाया। लगातार, कोशिकाओं को दो बार पारित किया गया था जब वे 90% संगम थे। व्युत्पन्न MSCs धीरे-धीरे परिपक्व हो गए और एक विशिष्ट धुरी का आकार दिखाया, और कॉलोनी एक भंवर में बढ़ी।

जैसा कि चित्रा 1 सी में दिखाया गया है, कोशिकाओं की मात्रा में वृद्धि हुई और 24 घंटे के लिए एमएससी रखरखाव माध्यम के साथ आईपीएससी रखरखाव माध्यम की जगह के बाद कॉलोनी के चारों ओर फैल गया। जबकि एक एमएससी रखरखाव माध्यम में सुसंस्कृत, कोशिकाओं ने धीरे-धीरे प्रसार किया और बहुपरत पक्षपाती कोशिकाओं का गठन किया। 14 दिन, कोशिकाओं को पचा और एक जिलेटिन लेपित संस्कृति प्लेट पर वरीयता प्राप्त थे. 15 दिन, कोशिका ने पालन किया और एक बहुभुज आकार दिखाया। लगातार, कोशिकाओं को 6 बार पारित किया गया था जब वे 90% संगम थे। व्युत्पन्न MSCs धीरे-धीरे परिपक्व हो गए और एक विशिष्ट धुरी का आकार दिखाया, और कॉलोनी एक भंवर में बढ़ी।

हिपीएससी और एचआईपीएससी-ड्राइविंग एमएससी की सतह एंटीजन का विश्लेषण प्रवाह साइटोमेट्री(चित्रा 2)द्वारा किया गया था। जैसा कि चित्र 2C में दिखाया गया है, hiPSCs CD90 के लिए सकारात्मक थे और CD34, CD45, CD73 और CD105 के लिए नकारात्मक थे। दोनों तरीकों के माध्यम से एमएससी में एचआईपीएससी को अलग करने के बाद, ड्राइविंग एमएससी सीडी 90, सीडी 73 और सीडी 105 के लिए सकारात्मक थे, और सीडी 34 के लिए नकारात्मक, और सीडी 45 (चित्रा 2 ए, बी)।

हिपीएससी-ड्राइविंग एमएससी की भेदभाव क्षमता की जांच ओस्टियोजेनिक, एडिपोजेनिक और चोंड्रोजेनिक भेदभाव द्वारा की गई थी। जैसा कि चित्रा 3 में दिखाया गया है, दो तरीकों के दोनों हिपीएससी-ड्राइविंग एमएससी ओस्टियोब्लास्ट, एडिपोसाइट और चोंड्रोसाइट में विभेदित हैं। मोनोलेयर विधि के हिपीएससी-ड्राइविंग एमएससी ने ईबी विधि(चित्रा 3बी)की तुलना में अधिक कैल्शियम जमा का गठन किया। दो तरीकों में एडिपोजेनिक भेदभाव और चोंड्रोजेनिक भेदभाव क्षमता(चित्रा 3डी,एफ)में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था।

हिपीएससी-ड्राइविंग एमएससी की प्रसार क्षमता की जांच निरंतर मार्ग संस्कृति द्वारा की गई थी। जैसा कि चित्रा 3 जी में दिखाया गया है, दोनों तरीकों के एचआईपीएससी-ड्राइविंग एमएससी को 20 से अधिक मार्ग के लिए पारित किया जा सकता है और अभी भी तेजी से प्रसार क्षमता बनाए रख सकता है।

तालिका 1 में दिखाए गए दो दृष्टिकोणों के बीच तुलना भेदभाव समय, लागत, सेल प्रसार क्षमता, एमएससी मार्करों की अभिव्यक्ति और इन विट्रो में उनकी भेदभाव क्षमता पर आधारित है।

Figure 1
चित्रा 1: ईबी गठन विधि और मोनोलेयर संस्कृति विधि के माध्यम से एमएससी में एचआईपीएससी को अलग करना। (ए) ईबी गठन और मोनोलेयर संस्कृति के माध्यम से एमएससी में एचआईपीएससी के भेदभाव को दिखाने वाला योजनाबद्ध। एमएससी के दौरान प्रमुख फेज में कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व आकृति विज्ञान (बी) ईबी गठन और (सी) मोनोलेयर संस्कृति के माध्यम से एचआईपीएससी से व्युत्पन्न। स्केल बार: 300 माइक्रोन और 50 माइक्रोन। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा एचआईपीएससी-ड्राइविंग एमएससी सतह एंटीजन विश्लेषण। आईपीएससी-ड्राइविंग एमएससी में एमएससी सतह एंटीजन की अभिव्यक्ति प्रतिशत (ए) ईबी गठन और (बी) मोनोलेयर संस्कृति के माध्यम से। (सी) एचआईपीएससी का उपयोग नकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया गया था। एमएससी नकारात्मक मार्कर: सीडी 34, सीडी 45; MSCs सकारात्मक मार्कर: CD73, CD90 और CD105। hiPSCs नकारात्मक मार्कर: CD34, CD45, CD73 और CD105; hiPSCs सकारात्मक मार्कर: CD90. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: एचआईपीएससी-ड्राइविंग एमएससी की तीन-लाइन भेदभाव और प्रसार क्षमता। (ए) 2 सप्ताह के लिए ओस्टोजेनिक भेदभाव माध्यम में एचआईपीएससी-ड्राइविंग एमएससी के कैल्शियम जमा के एलिज़रीन लाल धुंधला। स्केल बार: 300 माइक्रोन। (बी) ImageJ विश्लेषण द्वारा Alizarin लाल एस धुंधला की मात्रा का ठहराव. (सी) 2 सप्ताह के लिए एडिपोजेनिक भेदभाव माध्यम में एचआईपीएससी-ड्राइविंग एमएससी की लिपिड बूंदों का ओली लाल ओ धुंधला। स्केल बार: 300 माइक्रोन। (डी) ImageJ विश्लेषण द्वारा ओली रेड ओ धुंधला की मात्रा का ठहराव. (ई) बाह्य चोंड्रोसाइट मैट्रिक्स के टोलुइडीन नीले धुंधला। स्केल बार: 300 माइक्रोन और 150 माइक्रोन। (एफ) ImageJ विश्लेषण द्वारा toluidine नीले धुंधला की मात्रा का ठहराव. (जी) hiPSC-ड्राइविंग MSCs जनसंख्या दोहरीकरण समय गणना। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तुलनात्‍मक मूल्‍यांकन EB गठन विधि मोनोलेयर संस्कृतियों विधि
विभेदन समय 27 दिन 35 दिन
क़ीमत उच्च संख्‍या आदि
प्रसार की गति तेज तेज
प्रसार क्षमता ≥20 मार्ग ≥20 मार्ग
एमएससी मार्करों की अभिव्यक्ति सीडी 73/सीडी 90/सीडी 105 पॉजिटिव, सीडी 34/सीडी 45 नागेटिव सीडी 73/सीडी 90/सीडी 105 पॉजिटिव, सीडी 34/सीडी 45 नागेटिव
विभेदन की क्षमता एडिपोजेनिक भेदभाव, चोंड्रोजेनिक भेदभाव और ओस्टोजेनिक भेदभाव क्षमता एडिपोजेनिक भेदभाव, चोंड्रोजेनिक भेदभाव और मजबूत ओस्टोजेनिक भेदभाव क्षमता
परिचालन जटिल सरल

तालिका 1: एमएससी में hiPSCs भेद के लिए दो तरीकों के लक्षण.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

इस प्रोटोकॉल में, एमएससी में एचआईपीएससी को अलग करने के दो प्रतिनिधि तरीकों की जांच 20,21,22,23,24,25,26,27,28,30 की गई। दोनों विधियां एचआईपीएससी से एमएससी प्राप्त करने में सक्षम थीं। हिपीएससी-व्युत्पन्न एमएससी की पुष्टि सेल आकारिकी (चित्रा 1), सतह एंटीजन(चित्रा 2)और अंतर करने की उनकी क्षमता(चित्रा 3)द्वारा की गई थी।

दोनों विधियों ने एक ही एमएससी रखरखाव माध्यम साझा किया, जबकि ईबी विधि को टीजीएफ -β और एफजीएफ 2 के साथ एमएससी भेदभाव माध्यम की भी आवश्यकता थी। इसके अलावा, ईबी विधि को 6 अच्छी तरह से प्लेटों के कम लगाव और एक विशेष प्रकार के बरतन की आवश्यकता होती है जिसे कार्बन डाइऑक्साइड इनक्यूबेटर में रखा जा सकता है। इसलिए, ईबी विधि की लागत मोनोलेयर विधि18,20 की तुलना में अधिक थी। ईबी विधि मोनोलेयर विधि की तुलना में अधिक जटिल लग रही थी। हालांकि, ईबी विधि का भेदभाव समय कम था, जिसने एमएससी को समृद्ध करने के लिए कई मार्गों से परहेज किया।

हमने पाया कि ईबी विधि की परिवेश स्थितियों के प्रति सहिष्णुता मोनोलेयर विधि की तुलना में अधिक मजबूत थी। दोनों तरीकों आईपीएससी स्थिति से प्रभावित थे, मानव हस्तक्षेप, और संस्कृति पर्यावरण11,20. हालांकि, हमने पाया कि ईबी विधि का सफलता अनुपात मोनोलेयर विधि की तुलना में बहुत अधिक था। EB पद्धति का प्रमुख चरण दिन 1 से दिन 7 तक EB भेदभाव चरण था। 1-7 दिनों के दौरान, यदि ईबीएस धीरे-धीरे छोटे हो जाते हैं या संस्कृति माध्यम में बहुत सारी अस्थायी मृत कोशिकाओं के साथ टूट जाते हैं या वैक्यूम ईबी बनाते हैं, तो इन अयोग्य ईबीएस को जिलेटिन प्लेट का पालन करने में कठिनाई होती है और थोड़ा, यदि कोई हो, ईबीएस से बाहर रेंगने वाली पक्षपाती कोशिकाएं। दिन 1 से दिन 7 तक, योग्य ईबी एक समान थे और थोड़ा बढ़े हुए होंगे, जिनमें से चिकनी किनारे धीरे-धीरे कोशिकाओं के साथ खुरदरे हो जाते हैं। जिलेटिन प्लेट में स्थानांतरित होने के बाद, ईबीएस ने प्लेट का जल्दी से पालन किया, और कई आसन्न मोनोलेयर कोशिकाएं ईबीएस के चारों ओर फैल गईं। यदि ईबी 1-7 दिनों के दौरान योग्य हैं, तो बाद में भेदभाव प्राप्त करना आसान है। इसके विपरीत, मोनोलेयर विधि किसी भी स्तर पर विफल हो सकती है। दिन 1 से दिन 14 तक, पक्षपाती कोशिकाएं पैच में गिर सकती हैं, जो भेदभाव की विफलता का संकेत देती हैं। आम तौर पर, पक्षपाती कोशिकाएं बहुपरत पक्षपाती कोशिकाओं का प्रसार और निर्माण करती हैं। 14 दिन के बाद, मोनोलेयर विधि अभी भी विफल हो जाएगी क्योंकि कुछ कोशिकाएं डिश से जुड़ी होती हैं। मोनोलेयर विधि के 0-13 दिनों के दौरान, हमने डिश में विभिन्न सेल आकृति विज्ञान का अवलोकन किया। हालांकि, 8-17 दिनों पर ईबी विधि की कोशिका आकृति विज्ञान सजातीय था। मोनोलेयर विधि की तुलना में, हमें संदेह है कि ईबी विधि भ्रूण विकास प्रक्रिया के समान है और एक अधिक नियंत्रणीय क्रमादेशित भेदभाव विधि है।

दोनों तरीकों 20 से अधिक मार्ग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और अभी भी एक तेजी से प्रसार क्षमता11 बनाए रखने. मोनोलेयर विधि में ओस्टोजेनिक भेदभाव के कैल्शियम जमा ईबी विधि की तुलना में अधिक थे। भेदभाव पर सीरम में साइटोकिन्स के प्रभाव से बचने के लिए स्टेम सेल-विशिष्ट सीरम का उपयोग किया जाना चाहिए। हमने देखा कि यदि कोशिका घनत्व बहुत कम था तो कोशिकाएं प्रसार करना बंद कर देंगी। तो, संगम तक पहुँचने के बाद, कोशिकाओं को 1: 3 विभाजन अनुपात में पारित किया जाना चाहिए। भेदभाव के दौरान कोई एंटीबायोटिक दवाओं का उपयोग नहीं किया गया था; इसलिए, इस प्रयोगात्मक सेटअप के लिए अच्छी प्रयोगशाला प्रथाओं (जीएलपी) का सख्त पालन अनिवार्य है।

अंत में, इस प्रोटोकॉल में परीक्षण की गई प्रत्येक विधि के लिए फायदे और नुकसान थे। दोनों विधियां एचआईपीएससी से एमएससी उत्पन्न कर सकती हैं, चुनाव उपयोगकर्ता की आवश्यकताओं पर आधारित है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम दिलचस्प चर्चाओं और परियोजना में महान योगदान के लिए माओ और हू लैब के सभी सदस्यों, अतीत और वर्तमान के लिए बहुत आभारी हैं। हम महान समर्थन के लिए बाल स्वास्थ्य के लिए राष्ट्रीय नैदानिक अनुसंधान केंद्र के आभारी हैं। इस अध्ययन को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (जियानहुआ माओ के U20A20351, लिदान हू के 82200784), चीन के झेजियांग प्रांत के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (सं। LQ22C070004 लिडान हू को)।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alizarin red staining kit Beyotime Biotechnology C0148S
Anti-human-CD105 (PE) Biolegend 323206
Anti-human-CD34 (FITC) Biolegend 343503
Anti-human-CD45 (APC) Biolegend 304011
Anti-human-CD73( APC) Biolegend 344006
Anti-human-CD90 (FITC) Biolegend 328108
Ascorbic acid Solarbio A8100
BMP-6 Novoprotein C012
Carbon dioxide level shaker Crystal CO-06UC6
Compensation Beads BioLegend 424601
CryoStor CS10 STEMCELL Technology 07959
Dexamethasone Beyotime Biotechnology ST1254
DMEM/F12  medium Servicebio G4610
Fetal bovine serum HAKATA HS-FBS-500
FGF2 Stemcell 78003.1
Gelatin Sigma-Aldrich G2500-100G
GlutaMAX Gibco 35050061
human IgG1 isotype control APC BioLegend 403505
human IgG1 isotype control FITC BioLegend 403507
human IgG1 isotype control PE BioLegend 403503
Human TGF-β1 Stemcell 78067
Human TruStain FcX  BioLegend 422301
IBMX Beyotime Biotechnology ST1398
Indomethacin Solarbio SI9020
Insulin Beyotime Biotechnology P3376
iPSC maintenance medium STEMCELL Technology 85850
ITS Media Supplement Beyotime Biotechnology C0341-10mL
Matrigel, growth factor reduced BD Corning 354230
Oli Red O staining kit Beyotime Biotechnology C0158S
Proline Solarbio P0011
Sodium pyruvate ThermoFisher 11360-070
TGFβ3 Novoprotein CJ44
Toluidine blue staining kit Solarbio G2543
TrypLE Express Enzyme(1x)  Gibco 12604013
Ultra-Low Attachment 6 Well Plate Costar 3471
Versene Gibco 15040-66
Y-27632 Stemcell 72304
α-MEM Hyclone SH30265
β-glycerophosphate Solarbio G8100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Weng, Z., et al. Mesenchymal stem/stromal cell senescence: Hallmarks, mechanisms, and combating strategies. Stem Cells Translational Medicine. 11 (4), 356-371 (2022).
  2. Soliman, H., et al. Multipotent stromal cells: One name, multiple identities. Cell Stem Cell. 28 (10), 1690-1707 (2021).
  3. Friedenstein, A. J., Chailakhyan, R. K., Gerasimov, U. V. Bone marrow osteogenic stem cells: in vitro cultivation and transplantation in diffusion chambers. Cell and Tissue Kinetics. 20 (3), 263-272 (1987).
  4. Friedenstein, A. J., et al. Precursors for fibroblasts in different populations of hematopoietic cells as detected by the in vitro colony assay method. Experimental Hematology. 2 (2), 83-92 (1974).
  5. Friedenstein, A. J., Gorskaja, J. F., Kulagina, N. N. Fibroblast precursors in normal and irradiated mouse hematopoietic organs. Experimental Hematology. 4 (5), 267-274 (1976).
  6. El Agha, E., et al. Mesenchymal stem cells in fibrotic disease. Cell Stem Cell. 21 (2), 166-177 (2017).
  7. Mushahary, D., Spittler, A., Kasper, C., Weber, V., Charwat, V. Isolation, cultivation, and characterization of human mesenchymal stem cells. Cytometry A. 93 (1), 19-31 (2018).
  8. Ullah, M., Liu, D. D., Thakor, A. S. Mesenchymal stromal cell homing: Mechanisms and strategies for improvement. iScience. 15, 421-438 (2019).
  9. Regmi, S., et al. Enhanced viability and function of mesenchymal stromal cell spheroids is mediated via autophagy induction. Autophagy. 17 (10), 2991-3010 (2021).
  10. Hoang, D. M., et al. Stem cell-based therapy for human diseases. Signal Transduction and Targeted Therapy. 7 (1), 272 (2022).
  11. Jiang, B., et al. Concise review: Mesenchymal stem cells derived from human pluripotent cells, an unlimited and quality-controllable source for therapeutic applications. Stem Cells. 37 (5), 572-581 (2019).
  12. Soontararak, S., et al. Mesenchymal stem cells (MSC) derived from induced pluripotent stem cells (iPSC) equivalent to adipose-derived MSC in promoting intestinal healing and microbiome normalization in mouse inflammatory bowel disease model. Stem Cells Translational Medicine. 7 (6), 456-467 (2018).
  13. Di Baldassarre, A., Cimetta, E., Bollini, S., Gaggi, G., Ghinassi, B. Human-induced pluripotent stem cell technology and cardiomyocyte generation: Progress and clinical applications. Cells. 7 (6), 48 (2018).
  14. Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress. Nature Reviews. Drug Discovery. 16 (2), 115-130 (2017).
  15. Levy, O., et al. Shattering barriers toward clinically meaningful MSC therapies. Science Advances. 6 (30), eaba6884 (2020).
  16. Zhao, C., Ikeya, M. Generation and applications of induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells International. 2018, 9601623 (2018).
  17. Path, G., Perakakis, N., Mantzoros, C. S., Seufert, J. Stem cells in the treatment of diabetes mellitus - Focus on mesenchymal stem cells. Metabolism. 90, 1-15 (2019).
  18. Zhou, Y., et al. One-step derivation of functional mesenchymal stem cells from human pluripotent stem cells. Bio-Protocol. 8 (22), e3080 (2018).
  19. Hua, Z., et al. Low-intensity pulsed ultrasound promotes osteogenic potential of iPSC-derived MSCs but fails to simplify the iPSC-EB-MSC differentiation process. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 841778 (2022).
  20. Dupuis, V., Oltra, E. Methods to produce induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells: Mesenchymal stem cells from induced pluripotent stem cells. World Journal of Stem Cells. 13 (8), 1094-1111 (2021).
  21. Zhang, W., et al. Aging stem cells. A Werner syndrome stem cell model unveils heterochromatin alterations as a driver of human aging. Science. 348 (6239), 1160-1163 (2015).
  22. Liu, G. H., et al. Modelling Fanconi anemia pathogenesis and therapeutics using integration-free patient-derived iPSCs. Nature Communications. 5, 4330 (2014).
  23. Kubben, N., et al. Repression of the antioxidant NRF2 pathway in premature aging. Cell. 165 (6), 1361-1374 (2016).
  24. Duan, S., et al. PTEN deficiency reprogrammes human neural stem cells towards a glioblastoma stem cell-like phenotype. Nature Communications. 6, 10068 (2015).
  25. Zhang, J., et al. Exosomes released from human induced pluripotent stem cells-derived MSCs facilitate cutaneous wound healing by promoting collagen synthesis and angiogenesis. Journal of Translational Medicine. 13, 49 (2015).
  26. Hu, G. W., et al. Exosomes secreted by human-induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells attenuate limb ischemia by promoting angiogenesis in mice. Stem Cell Research & Therapy. 6 (1), 10 (2015).
  27. Kang, R., et al. Mesenchymal stem cells derived from human induced pluripotent stem cells retain adequate osteogenicity and chondrogenicity but less adipogenicity. Stem Cell Research & Therapy. 6 (1), 144 (2015).
  28. Wang, L. T., et al. Differentiation of mesenchymal stem cells from human induced pluripotent stem cells results in downregulation of c-Myc and DNA replication pathways with immunomodulation toward CD4 and CD8 cells. Stem Cells. 36 (6), 903-914 (2018).
  29. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  30. Kim, S., Kim, T. M. Generation of mesenchymal stem-like cells for producing extracellular vesicles. World Journal of Stem Cells. 11 (5), 270-280 (2019).

Tags

मेसेनकाइमल स्ट्रोमल सेल एमएससी पुनर्योजी चिकित्सा मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल एचआईपीएससी भेदभाव संस्कृति पद्धतियां भ्रूण निकाय मोनोलेयर संस्कृति फायदे नुकसान समय की खपत लागत सेल प्रसार क्षमता एमएससी मार्कर इन विट्रो में भेदभाव की क्षमता परिपक्व एमएससी
मेसेनकाइमल स्ट्रोमल कोशिकाओं में मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं के भेदभाव के लिए दो प्रतिनिधि तरीकों की तुलना
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, F., Gao, L., Fu, X., Yan, Q.,… More

Wang, F., Gao, L., Fu, X., Yan, Q., Hu, L., Mao, J. Comparison of Two Representative Methods for Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells into Mesenchymal Stromal Cells. J. Vis. Exp. (200), e65729, doi:10.3791/65729 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter