Summary
이 프로토콜은 hiPSC를 중간엽 기질 세포(MSC)로 분화하기 위한 두 가지 대표적인 방법을 설명하고 비교합니다. 단층 방법은 비용이 저렴하고 작동이 간단하며 골형성 분화가 더 쉬운 것이 특징입니다. 배아체(EB) 방법은 시간 소비가 적은 것이 특징입니다.
Abstract
중간엽 기질 세포(MSC)는 재생 의학에서 널리 사용되어 온 성체 만능 줄기세포입니다. 체세포 유래 MSC는 제한된 기증, 품질 변화 및 생물학적 안전성으로 인해 제한됨에 따라 지난 10년 동안 인간 유도 만능 줄기세포(hiPSC)에서 MSC를 생성하려는 노력이 크게 증가했습니다. hiPSC를 MSC로 분화하기 위한 과거와 최근의 노력은 (1) 배아체(EB)의 형성과 (2) 단층 배양의 사용이라는 두 가지 배양 방법론을 중심으로 이루어졌습니다. 이 프로토콜은 hiPSC에서 MSC를 유도하는 두 가지 대표적인 방법을 설명합니다. 각 방법은 시간, 비용, 세포 증식 능력, MSC 마커의 발현, 체외 분화 능력 등 장단점을 나타냅니다. 이 프로토콜은 두 방법 모두 hiPSC에서 성숙하고 기능적인 MSC를 도출할 수 있음을 보여줍니다. 단층 방법은 비용이 저렴하고 작동이 간단하며 골형성 분화가 용이한 것이 특징인 반면 EB 방법은 시간 소비가 적은 것이 특징입니다.
Introduction
중간엽 기질 세포(Mesenchymal stromal cell, MSCs)는 중배엽 유래 성체 만능 줄기세포이다1. MSC는 거의 모든 결합 조직에 존재한다2. MSC가 1970년대에 처음 발견되고 1987년 Friedenstein et al.3,4,5에 의해 골수에서 성공적으로 분리된 이래, 다양한 인간 체세포(태아 및 성인 포함) 조직이 뼈, 연골, 힘줄, 근육, 지방 조직 및 조혈 지지 기질과 같은 MSC를 분리하는 데 사용되었습니다 1,2,6,7 . MSC는 많은 체세포 계통으로 분화할 수 있는 높은 증식 능력과 가소성을 보여주며 손상되고 염증이 있는 조직으로 이동할 수 있습니다 2,8,9. 이러한 특성으로 인해 MSC는 재생 의학의 잠재적 후보가 될 수 있다10. 그러나, 체세포 조직 유래 MSC(st-MSCs)는 제한된 기증, 제한된 세포 증식 능력, 품질 변화 및 기증자로부터 병원체의 전염 가능성에 대한 생물학적 안전성 우려에 의해 제한된다11,12.
인간 유도만능줄기세포(Human induced pluripotent stem cell, hiPSCs)는 전사인자(transcription factor)(Oct4, Sox2, Klf4 및 c-Myc)로 재프로그래밍하는 성체 세포에서 유래하며, 이는 배아 줄기세포(embryonic stem cell)와 유사한 기능을 갖는다13,14. 그들은 자가 재생이 가능하며 MSC를 포함한 모든 유형의 체세포로 분화할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. st-MSC와 비교하여 iPSC-MSC는 무제한 공급, 저렴한 비용, 더 높은 순도, 품질 관리의 편리성, 규모 생산 및 유전자 변형이 용이하다는 장점이 있습니다 15,16,17.
iPSC-MSC의 이러한 장점으로 인해 iPSC에서 MSC를 구동하는 다양한 방법이 보고되었습니다. 이러한 분화 방법은 두 가지 배양 방법론, 즉 (1) 배아체(EB)의 형성과 (2) 단층 배양(monolayer cultures)의 사용(11,18,19,20)을 중심으로 이루어졌다. 여기에서, 두 가지 방법론 각각에 대한 대표적인 접근법을 특징지었다. 또한, 시간, 비용, 증식 능력, MSC 바이오마커 발현 및 체외 분화 능력에 기반한 두 가지 대표적인 접근법 간의 비교도 이루어졌습니다.
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Protocol
1. hiPSC 유지 보수
- hiPSC의 해동
- 액체 질소에서 세포를 꺼내고 37°C 수조에서 세포를 빠르게 해동합니다. 해동 셀을 3mL의 iPSC 유지 배지로 준비한 15mL 튜브로 옮깁니다(재료 표). 매체를 부드럽게 섞는다.
- 300 x g 에서 5분 동안 원심분리기 상층액을 제거하고 10μM Y-27632를 사용하여 1mL의 iPSC 유지 배지에 세포를 부드럽게 재현탁시킵니다(세포를 위아래로 2-3회 피펫팅).
- 세포 현탁액을 GFR(growth factor reduction)-세포외 기질 겔(1:100)과 10μM Y-27632가 미리 첨가된 2mL의 iPSC 유지 배지로 코팅된 6웰 조직 배양 플레이트에 옮깁니다(약 4 x 104 cells/cm2).
- 매일 iPSC 유지 배지를 교체하여 37°C, 5% CO2 에서 5-6일(80%-90% 합류) 동안 세포를 배양합니다.
- hiPSC의 통과
- 6웰 플레이트에서 iPSC 유지 관리 매체를 제거합니다. DPBS로 hiPSC를 한 번 씻으십시오.
- 700-800 μL의 0.48 mM EDTA 용액을 첨가하고 실온(RT)에서 1분 동안 배양한 다음 분해 용액을 제거합니다. 37°C 온도에서 3-5분 동안 계속 배양합니다.
- 세포가 시트로 분해될 때(세포를 단일 세포로 분해하지 않음) 10μM Y-27632와 함께 1mL의 iPSC 유지 배지를 추가하여 분해를 종료합니다. 세포를 위아래로 2-3회 조심스럽게 피펫팅합니다.
- 세포 현탁액을 성장 인자 감소(GFR)-세포외 기질 겔(1:100)과 10μM Y-27632가 미리 첨가된 2mL의 iPSC 유지 배지로 코팅된 6웰 조직 배양 플레이트에 옮깁니다.
참고: 통과 비율은 1:6에서 1:20(약 4 x 104 cells/cm2)이며 평균 응집 크기는 약 50-200μm입니다. - 매일 iPSC 유지 배지를 교체하여 37°C, 5% CO2 에서 80%-90% 밀도(5-6일)까지 세포를 배양합니다.
2. EB 형성을 통한 hiPSC와 MSC의 분화
참고: 이 방법은 이전 문헌 21,22,23,24에서 파생되었습니다. 이 방법의 개요는 그림 1에 나와 있습니다. 이 방법의 특징은 표 1에 요약되어 있다.
- 배지의 제조
- α-MEM에 1%(v/v) GlutaMAX, 10%(v/v) FBS, 10ng/mL FGF2 및 5ng/mL TGFβ를 보충하여 MSC 분화 배지를 준비합니다.
- α-MEM에 1%(v/v) GlutMAX, 10%(v/v) FBS 및 1ng/mL FGF2를 보충하여 MSC 유지 배지를 준비합니다.
- hiPSC의 준비
- 37°C, 80%-90% 밀도까지 5% CO2 까지 성장 인자 감소(GFR)-세포외 기질 겔(1:100)로 코팅된 6웰 조직 배양 플레이트의 iPSC 유지 배지에서 hiPSC 라인(해동 후 최소 2-3회 통과).
- 0일차: EB 형성
- 6웰 플레이트에서 iPSC 유지 관리 매체를 제거합니다. DPBS로 hiPSC를 한 번 씻으십시오.
- 700-800 μL의 0.48 mM EDTA 용액을 첨가하고 RT에서 1분 동안 배양한 다음 분해 용액을 제거합니다. 37°C 온도에서 3-5분 동안 계속 배양합니다.
- 세포가 시트로 분해되면(세포를 단일 세포로 분해하지 않음) 2mL의 iPSC 유지 배지(10μM 암석 억제제 및 1:100 GFR- 세포외 기질 겔 포함)를 추가하여 분해를 종료합니다.
- 세포를 6웰 낮은 부착 플레이트로 옮깁니다. 조직 배양 플레이트 2웰과 낮은 부착 플레이트 1웰의 비율로 세포를 파종합니다. 세포를 37°C, 5%CO2 의 셰이커(60rpm/분)에서 24시간 동안 배양하여 구형 EB를 형성합니다.
- 1일차-7일차: EB 감별
- 파스퇴르 피펫을 사용하여 EB를 원심 분리기 튜브로 옮기고 (EB를 파괴하지 않고) EB가 RT에서 5-10 분 동안 자연적으로 침전되도록합니다. 그런 다음 상층액을 제거합니다.
- EB를 2mL의 MSC 분화 배지가 있는 6웰 로우 부착 플레이트로 옮깁니다. 37 ° C, 5 % CO2 에서 7 일 동안 셰이커에서 EB를 배양하고 배지를 한 번 변경하십시오.
- 8일차-17일차: EB 접종
- 파스퇴르 피펫을 사용하여 EB를 원심 분리 튜브로 옮기고(EB를 파괴하지 않고) EB가 5-10분 동안 자연적으로 침전되도록 합니다. 그런 다음 상층액을 제거합니다.
- EB를 2mL의 MSC 유지 배지가 있는 GFR-세포외 기질 겔 코팅된 6웰 플레이트로 옮깁니다. 세포 접착 후 정기적인 배지 교체로 90% 밀도(~10일)까지 배양합니다.
- 18일차-27일차: MSC의 성숙 및 확장
- EB 유래 배양액을 37°C에서 해리 용액으로 5-10분 동안 처리합니다(세포 유형에 따라 분해 시간이 달라짐).
- 세포의 일부가 단일 세포로 분해되면 MSC 유지 배지 2mL를 추가하여 분해를 종료하고 세포 현탁액을 원심분리 튜브로 옮깁니다. 소화되지 않은 나머지 세포를 DPBS로 한 번 씻고 다시 소화합니다. 모든 세포가 단일 세포로 분해될 때까지 여러 번 반복합니다. 셀 현탁액을 250 x g 에서 5분 동안 원심분리한 다음 상층액을 제거합니다.
- 젤라틴 코팅 배양 플레이트(약 2 x 105 cells/cm2)에 세포를 파종합니다. MSC 유지 배지에서 90% 밀도가 될 때까지 배양하고 배지를 정기적으로 교체합니다. 이 시점에서 이 세대의 세포를 통로 0(P0)으로 지정합니다.
- MSC를 순수하고 성숙하게 만들기 위해 약 6일 동안 1:3 분할 비율로 세포를 두 번 계속 통과시킵니다. 대부분의 세포는 섬유아세포와 같은 형태(방추형)를 나타냅니다.
3. 단층 배양을 통한 MSC와 hiPSC의 차별화
참고: 이 방법은 이전 문헌 25,26,27,28에서 파생되었습니다. 이 방법의 개요는 그림 1에 나와 있습니다. 이 방법의 특징은 표 1에 요약되어 있다.
- 배지의 제조
- α-MEM을 1%(v/v) GlutMAX, 10%(v/v) FBS 및 1ng/mL FGF2로 보충하여 MSC 유지 배지를 준비합니다.
- hiPSC의 준비
- 37°C에서 5% CO2 가 50%-60% 밀도가 될 때까지 성장 인자 감소(GFR)-세포외 기질 겔(1:100)로 코팅된 6웰 조직 배양 플레이트의 iPSC 유지 배지에서 hiPSC 라인(해동 후 최소 2-3회 통과).
- 0일차-13일차: 직접 단층 배양에 의한 분화
- 6웰 플레이트에서 iPSC 유지 관리 매체를 제거합니다.
- MSC 유지 배지 2mL를 직접 첨가하고 37°C, 5%CO2 에서 14일 동안 배양하고 배지를 매일 교체합니다.
- 14일차-35일차: 반복 통과에 의한 MSC 성숙
- 단층 배양액을 37°C에서 해리 용액으로 5-10분 동안 처리합니다(세포 유형에 따라 분해 시간이 달라짐).
- 세포가 단일 세포로 분해되면 2mL의 MSC 유지 배지를 추가하여 분해를 종료하고 세포 현탁액을 원심분리 튜브로 옮깁니다. 소화되지 않은 나머지 세포를 DPBS로 한 번 씻고 다시 소화합니다. 모든 세포가 단일 세포로 분해될 때까지 여러 번 반복합니다. 셀 현탁액을 250 x g 에서 5분 동안 원심분리한 다음 상층액을 제거합니다.
- 젤라틴으로 코팅된 배양 접시(약 2 x 105 cells/cm2)에 세포를 파종합니다. MSC 유지 관리 배지에서 90%의 밀도가 될 때까지 배양하고 배지를 정기적으로 교체합니다. 이 시점에서 이 세대의 세포를 통로 0(P0)으로 지정합니다.
- MSC를 순수하고 성숙하게 만들기 위해 약 18일 동안 1:3 분할 비율로 세포를 6회 계속 통과시킵니다. 대부분의 세포는 섬유아세포와 같은 형태(방추형)를 나타냅니다.
4. 유세포 분석에 의한 hiPSC 유도 MSC의 표면 항원 분석
참고: 골수 유래 MSC의 표면 항원과 유사하게, hiPSC를 유도하는 MSC는 CD105, CD73 및 CD90을 발현하지만, CD45, CD34는 발현하지 않는다29. 또한 hiPSC를 음성 대조 세포로 사용할 수 있습니다. 유세포 분석에 의한 hiPSC 유도 MSC 및 hiPSC의 표면 항원 분석은 그림 2에 나와 있습니다.
- hiPSC 구동 MSC를 37°C에서 해리 용액으로 2-3분 동안 처리합니다. hiPSC를 0.48mM EDTA 해리 시약으로 처리하고 RT에서 1분 동안 배양한 다음 해리 시약을 제거합니다. 37°C 온도에서 3-5분 동안 계속 배양합니다.
- 세포가 단일 세포로 분해되면 배지(MSC에 MSC 유지 배지, iPSC에 iPSC 유지 배지)를 추가하여 분해를 종료합니다.
- 셀 현탁액을 350 x g 에서 5분 동안 원심분리한 다음 상층액을 제거합니다.
- 차가운 DPBS로 세포를 한 번 세척하고 350 x g 에서 5분 동안 원심분리한 다음 상층액을 제거합니다.
- 10 x 106 cells/mL의 차가운 10% FBS-DPBS(v/v) 용액에서 세포를 계수하고 재현탁시키고 100μL/튜브의 세포 현탁액(1 x 106 세포/튜브)을 1.5mL 원심분리 튜브에 분배합니다.
- 5μL의 인간 Fc 수용체 차단 용액을 100μL의 세포 현탁액에 추가합니다. 비특이적 차단을 수행하기 위해 RT에서 5-10분 동안 배양합니다.
- 350 x g 에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 제거합니다. 차가운 2% FBS-DPBS(v/v) 용액으로 세포를 두 번 세척합니다.
- 2% FBS-DPBS(v/v) 용액의 차가운 100μL에 세포를 재현탁시킵니다.
- 100μL 세포에 5μL(1 테스트)의 anti-CD34-FITC와 5μL의 anti-CD45-APC를 추가합니다.
서스펜션. 다른 100μL 세포 현탁 튜브에 5μL(1 테스트)의 anti-CD73-APC, 5μL의 anti-CD90-FITC의 90 μL(1 테스트) 및 5 μL의 anti-CD105-PE를 추가합니다. 5μL의 인간 IgG1 동형 대조군 FITC, 인간 IgG1 동형 대조군 PE 및 인간 IgG1 동형 대조군 APC를 세 번째 100μL 세포 현탁 튜브에 추가합니다. 어둠 속에서 얼음 위에서 15-20분 동안 배양합니다. 한편, 단일 염색 구슬을 준비합니다. - 차가운 2% FBS-DPBS(v/v) 용액으로 세포를 두 번 세척합니다.
- 300μL의 차가운 2% FBS-DPBS(v/v) 용액을 추가하여 세포를 재현탁시키고 200 메쉬 스크린 필터를 통해 필터링합니다.
- 유세포 분석을 사용하여 샘플을 분석합니다. isotype control 항체로 염색된 세포 현탁액을 분석하고 게이트를 설정합니다. 그런 다음 표적 항체로 염색된 세포 현탁액을 분석합니다.
5. hiPSC 유도 MSC의 골형성 분화
참고: hiPSC를 구동하는 MSC는 골형성 분화 전위가 있습니다(그림 3A, B). 골형성 분화를 위한 프로토콜은 다음과 같습니다.
- α-MEM에 10% FBS, 100nM 덱사메타손, 10mM 베타-글리세로포스페이트 및 100μM 아스코르브산을 보충하여 골형성 유도 배지를 준비합니다.
- 1 x 105 MSC를 젤라틴으로 코팅된 48웰 플레이트에 파종하고 60%-70%가 합류할 때까지 배양합니다.
- 배지를 제거하고 0.3mL의 골형성 유도 배지를 추가합니다. 37 °C, 5 % CO2 에서 14 일 동안 골형성 유도 배지에서 세포를 3 일마다 배지를 교체하여 배양합니다.
- 배지를 제거하고 DPBS로 한 번 씻으십시오.
- 4% PFA 0.3mL를 첨가하고 실온에서 30분 동안 배양합니다.
- PFA를 제거합니다. RT에서 10분 동안 0.3mL의 DPBS로 세포를 헹구고 3회 반복합니다.
- DPBS를 제거하고 Alizarin red 염색액 0.2mL를 첨가하고 RT에서 30분 동안 배양합니다.
- 염색액을 제거하고 0.3mL DPBS로 세포를 상온에서 10분 동안 헹구고 3회 반복합니다.
- 광학 현미경으로 칼슘 침착의 염색을 관찰합니다.
6. hiPSC 구동 MSC의 지방 분화
참고: hiPSC 구동 MSC는 지방 분화 전위를 가지고 있습니다(그림 3C, D). 지방 분화를 위한 프로토콜은 다음과 같습니다.
- α-MEM에 10% FBS, 1μM 덱사메타손, 1μM IBMX, 10μg/mL 인슐린 및 100μM 인도메타신을 보충하여 지방 생성 유도 배지를 준비합니다. α-MEM에 10% FBS와 10μg/mL 인슐린을 보충하여 지방 생성 유지 배지를 준비합니다.
- 젤라틴으로 코팅된 48웰 플레이트에 1 x 105 MSC를 파종하고 세포 밀도가 90%에 도달할 때까지 배양합니다.
- 배지를 제거하고 0.3mL의 지방 유도 배지를 추가합니다. 지방 유도 배지에서 세포를 37 ° C, 5 % CO2 에서 4 일 동안 계속 배양합니다.
- 배지를 제거하고 0.3mL의 지방 유지 배지를 추가합니다. 지방 생성 유지 배지에서 세포를 37 ° C, 5 % CO2 에서 3 일 동안 계속 배양합니다.
- 지방 세포 분화 및 성숙이 이루어질 때까지 6.3 및 6.4 단계를 2-3회 반복합니다.
- 배지를 제거하고 DPBS로 한 번 씻으십시오.
- 4% PFA 0.3mL를 첨가하고 실온에서 10분 동안 배양합니다. PFA를 제거하고 DPBS로 2회 헹굽니다.
- 제조업체의 지침에 따라 Oli Red O 염색제를 바르고 광학 현미경으로 지질 방울을 관찰합니다.
7. hiPSC 구동 MSC의 연골 분화
참고: hiPSC 구동 MSC는 연골 분화 전위를 가지고 있습니다(그림 3E, F). 연골 분화에 대한 프로토콜은 다음과 같습니다.
- α-MEM에 10% FBS, 100nM 덱사메타손, 1% 인슐린-트랜스페린-셀레늄(ITS), 10μM 아스코르브산, 1mM 피루브산나트륨, 50μg/mL 프롤린, 0.02nM 형질전환 성장 인자 β3(TGFβ3) 및 0.5μg/mL 골 형태 형성 단백질 6(BMP-6)을 보충하여 연골아세포 유도 배지를 준비합니다.
- 2.5 x 105 hiPSC 구동 MSC를 수집하고 세포를 150 x g 에서 5분 동안 원심분리한 다음 상층액을 제거합니다. 세포를 1mL의 α-MEM에 현탁시킨 다음 150 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다.
- 상층액을 제거하고 0.5mL의 연골 유도 배지에 세포를 현탁시킵니다. 세포를 150 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다.
- 뚜껑의 나사를 직접 풀고 37 ° C, 5 % CO2에서 3 일마다 연골 유도 배지를 교체하여 21 일 동안 배양합니다. 원심분리기 튜브를 부드럽게 튕겨 연골 분화 중에 매일 연골 펠릿(연골 펠릿을 파괴하지 않고)을 부유시킵니다.
- 상층액을 제거하고 PBS 0.5mL로 두 번 세척합니다.
- 4% PFA 0.3mL를 넣고 24시간 동안 고정합니다.
- 파라핀은 연골 펠릿을 내장한 다음 절편합니다(3μm). 톨루이딘 블루(1%) 섹션을 30분 동안 염색합니다.
- 광학 현미경으로 세포외 연골세포 기질을 관찰합니다.
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Representative Results
프로토콜(그림 1A)에 따라 hiPSC는 EB 형성 및 단층 배양 방법을 통해 MSC로 분화되었습니다. 분화 과정에서 세포는 서로 다른 대표 형태를 보였습니다(그림 1B,C).
그림 1B에서 볼 수 있듯이 hiPSC 콜로니는 분화 전에 촘촘하게 채워진 세포로 구성된 명확한 경계로 전형적인 조밀한 형태를 나타냅니다. hiPSC가 shaker에서 24시간 동안 해리 및 배양된 후 균일한 구형 EB가 형성되었습니다. MSC의 분화 배지에서 배양 1일차부터 7일차까지 EB의 부드러운 가장자리가 거칠어지고 EB의 부피가 커졌습니다. 8일째부터 17일째까지, EB를 GFR-세포외 기질 겔 코팅된 6-웰 플레이트로 옮긴 후, EB는 점차적으로 플레이트에 부착되었고, 많은 부착성 단층 세포가 EB 주위에 퍼졌습니다. 세포가 18일째에 90%의 밀도에 도달했을 때, 세포를 분해하여 젤라틴으로 코팅된 배양 플레이트에 파종했습니다. 19일째 되던 날, 세포가 부착되어 다각형 모양을 보였다. 연속적으로, 세포는 90 % 합류 할 때 두 번 통과되었습니다. 파생된 MSC는 점차적으로 성숙하여 전형적인 방추 모양을 보였고 콜로니는 소용돌이 속에서 성장했습니다.
그림 1C에 나타난 바와 같이, 세포의 부피는 24시간 동안 iPSC 유지 배지를 MSC 유지 배지로 교체한 후 증가하여 콜로니 주위로 퍼졌습니다. MSC 유지 배지에서 배양하는 동안 세포는 점차적으로 증식하여 다층 부착 세포를 형성했습니다. 14일째에, 세포를 분해하고 젤라틴으로 코팅된 배양 플레이트에 파종하였다. 15일째 되던 날, 세포가 달라붙어 다각형 모양을 보였다. 연속적으로, 세포는 90 % 합류 할 때 6 번 통과되었습니다. 파생된 MSC는 점차적으로 성숙하여 전형적인 방추 모양을 보였고 콜로니는 소용돌이 속에서 성장했습니다.
hiPSC 및 hiPSC 유도 MSC의 표면 항원은 유세포 분석법으로 분석되었습니다(그림 2). 그림 2C에서 볼 수 있듯이 hiPSC는 CD90에 대해 양성이었고 CD34, CD45, CD73 및 CD105에 대해 음성이었습니다. 두 가지 방법을 통해 hiPSC를 MSC로 분화한 후, 구동 MSC는 CD90, CD73 및 CD105에 대해 양성이었고 CD34 및 CD45에 대해 음성이었습니다(그림 2A, B).
hiPSC 유도 MSC의 분화 능력은 골형성, 지방형성 및 연골형성 분화에 의해 조사되었습니다. 그림 3에서 볼 수 있듯이 두 가지 방법의 두 hiPSC 유도 MSC는 조골세포, 지방세포 및 연골세포로 분화되었습니다. 단층 분석법의 hiPSC 유도 MSC는 EB 방법보다 더 많은 칼슘 침전물을 형성했습니다(그림 3B). 두 방법은 지방 분화와 연골 분화 능력에서 유의한 차이가 없었습니다(그림 3D,F).
hiPSC-유도 MSC의 증식 능력은 연속 통로 배양에 의해 조사되었습니다. 그림 3G에서 볼 수 있듯이 두 가지 방법의 hiPSC 구동 MSC는 20개 이상의 통로를 통과할 수 있으며 여전히 빠른 증식 능력을 유지할 수 있습니다.
표 1에 나타낸 두 접근법의 비교는 분화 시간, 비용, 세포 증식 능력, MSC 마커의 발현 및 체외 분화 능력을 기반으로 합니다.
그림 1: EB 형성 방법 및 단층 배양 방법을 통해 hiPSC를 MSC로 분화 . (A) EB 형성 및 단층 배양을 통해 hiPSC를 MSC로 분화시키는 것을 보여주는 개략도. (B) EB 형성 및 (C) 단층 배양을 통해 hiPSC에서 MSC를 유도하는 동안 주요 파지에서 세포의 표현 형태. 스케일 바: 300 μm 및 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 유세포 분석을 통한 hiPSC 유도 MSC 표면 항원 분석. (A) EB 형성 및 (B) 단층 배양을 통한 iPSC 유도 MSC에서 MSC 표면 항원의 발현 비율. (C) hiPSC를 음성 대조군으로 사용하였다. MSC 음성 마커: CD34, CD45; MSC 양성 마커: CD73, CD90 및 CD105. hiPSC 음성 마커: CD34, CD45, CD73 및 CD105; hiPSC 양성 마커: CD90. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: hiPSC 구동 MSC의 3선 분화 및 증식 능력. (A) 2주 동안 골형성 분화 배지에서 hiPSC 유도 MSC의 칼슘 침전물의 Alizarin 적색 염색. 스케일 바: 300 μm. (B) ImageJ 분석에 의한 Alizarin red S 염색의 정량화. (C) 지방 분화 배지에서 2주 동안 hiPSC 유도 MSC의 지질 방울을 Oli red O 염색. 스케일 바: 300 μm. (D) ImageJ 분석에 의한 Oli Red O 염색의 정량화. (E) 세포외 연골세포 기질의 톨루이딘 블루 염색. 스케일 바: 300 μm 및 150 μm. (F) ImageJ 분석을 통한 톨루이딘 블루 염색 정량화. (G) hiPSC 구동 MSC 개체군 배증 시간 계산. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 비교 | EB 형성 방법 | 단층 배양법 |
| 미분 시간 | 27일 | 35일 |
| 비용 | 높다 | 낮다 |
| 증식 속도 | 빠른 | 빠른 |
| 증식 능력 | ≥20 통로 | ≥20 통로 |
| MSC 마커의 발현 | CD73/CD90/CD105 양성,CD34/CD45 nagative | CD73/CD90/CD105 양성,CD34/CD45 nagative |
| 차별화 능력 | Adipogenic differentiation, chondrogenic differentiation 및 osteogenic differentiation capability | 지방 분화, 연골 분화 및 더 강한 골형성 분화 능력 |
| 수술 | 복잡하다 | 간단한 |
표 1: hiPSC를 MSC로 구별하는 두 가지 방법의 특성.
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Discussion
이 프로토콜에서는 hiPSC를 MSC로 분화하는 두 가지 대표적인 방법을 조사하였다 20,21,22,23,24,25,26,27,28,30. 두 방법 모두 hiPSC에서 MSC를 유도할 수 있었습니다. hiPSC 유래 MSC는 세포 형태(그림 1), 표면 항원(그림 2) 및 분화 능력(그림 3)에 의해 확인되었습니다.
두 방법 모두 동일한 MSC 유지 배지를 공유한 반면, EB 분석법에는 TGF-β 및 FGF2가 포함된 MSC 분화 배지도 필요했습니다. 또한 EB 방법은 6웰 플레이트와 이산화탄소 인큐베이터에 넣을 수 있는 특수 셰이커를 낮게 부착해야 했습니다. 따라서 EB 방법의 비용은 단층 방법18,20의 비용보다 높았습니다. EB 방법은 단층 방법보다 더 복잡해 보였습니다. 그러나 EB 방법의 분화 시간이 더 짧아 MSC를 농축하기 위한 여러 통로를 피할 수 있었습니다.
EB 방법의 주변 조건에 대한 내성이 단층 방법보다 강하다는 것을 발견했습니다. 두 방법 모두 iPSC 상태, 인간 간섭 및 배양 환경의 영향을 받았다 11,20. 그러나 EB 방법의 성공률이 단층 방법보다 훨씬 높다는 것을 발견했습니다. EB 방법의 핵심 단계는 1일차부터 7일차까지의 EB 분화 단계였습니다. 1-7일 동안 배양 배지에 떠다니는 죽은 세포가 많아 EB가 점차 작아지거나 부서지거나 진공 EB를 형성하는 경우, 이러한 비정규성 EB는 젤라틴 플레이트에 부착하는 데 어려움을 겪으며 부착 세포가 거의 없거나 EB에서 기어 나옵니다. 1일차부터 7일차까지 적격 EB는 균일하고 약간 확대되어 매끄러운 가장자리가 점차 거칠어지고 세포가 돌출되었습니다. 젤라틴 플레이트로 옮겨진 후 EB는 플레이트에 빠르게 부착되었으며 많은 부착 단층 세포가 EB 주위에 퍼졌습니다. EB가 1-7일 동안 자격을 얻으면 후속 차별화를 쉽게 달성할 수 있습니다. 대조적으로, 단층 방법은 어느 단계에서나 실패할 수 있습니다. 1일째부터 14일째까지 부착 세포가 패치로 떨어질 수 있으며, 이는 분화 실패를 나타냅니다. 일반적으로 부착 세포는 증식하여 다층 부착 세포를 형성합니다. 14일째 이후에도 단층 방법은 접시에 부착된 세포가 거의 없기 때문에 여전히 실패합니다. 단층 방법의 0-13일 동안 접시에서 다양한 세포 형태를 관찰했습니다. 그러나, 8-17일째에 EB 방법의 세포 형태는 균질하였다. 단층 방법과 비교했을 때, EB 방법은 배아 발달 과정과 더 유사하며 더 제어 가능한 프로그래밍된 분화 방법이라고 생각합니다.
두 방법 모두 20개 이상의 통로에 사용될 수 있으며 여전히 빠른 증식 능력을 유지할 수 있다11. 단층 방법에서 골형성 분화의 칼슘 침전물은 EB 방법의 칼슘 침전물보다 많았습니다. 줄기세포 특이적 혈청은 혈청 내 사이토카인이 분화에 미치는 영향을 피하기 위해 사용해야 합니다. 우리는 세포 밀도가 너무 낮으면 세포가 증식을 멈추는 것을 관찰했습니다. 따라서 밀도에 도달한 후 세포는 1:3 분할 비율로 통과해야 합니다. 분화 과정에서 항생제를 사용하지 않았다. 따라서 이 실험 설정에는 GLP(Good Laboratory Practices)를 엄격하게 준수해야 합니다.
결론적으로, 이 프로토콜에서 테스트한 각 방법에는 장점과 단점이 있었습니다. 두 방법 모두 hiPSC에서 MSC를 생성할 수 있으며, 선택은 사용자의 요구 사항을 기반으로 합니다.
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Disclosures
저자는 공개할 것이 없습니다.
Acknowledgments
우리는 과거와 현재의 Mao and Hu Lab의 모든 구성원이 흥미로운 토론과 프로젝트에 큰 기여를 한 것에 대해 매우 감사합니다. 국립아동건강임상연구센터(National Clinical Research Center for Child Health)의 큰 지원에 감사드립니다. 이 연구는 중국 국립자연과학재단(U20A20351 Jianhua Mao, 82200784 Lidan Hu), 중국 저장성 자연과학재단(No. LQ22C070004 Lidan Hu)에게).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alizarin red staining kit | Beyotime Biotechnology | C0148S | |
| Anti-human-CD105 (PE) | Biolegend | 323206 | |
| Anti-human-CD34 (FITC) | Biolegend | 343503 | |
| Anti-human-CD45 (APC) | Biolegend | 304011 | |
| Anti-human-CD73( APC) | Biolegend | 344006 | |
| Anti-human-CD90 (FITC) | Biolegend | 328108 | |
| Ascorbic acid | Solarbio | A8100 | |
| BMP-6 | Novoprotein | C012 | |
| Carbon dioxide level shaker | Crystal | CO-06UC6 | |
| Compensation Beads | BioLegend | 424601 | |
| CryoStor CS10 | STEMCELL Technology | 07959 | |
| Dexamethasone | Beyotime Biotechnology | ST1254 | |
| DMEM/F12 medium | Servicebio | G4610 | |
| Fetal bovine serum | HAKATA | HS-FBS-500 | |
| FGF2 | Stemcell | 78003.1 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G2500-100G | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | |
| human IgG1 isotype control APC | BioLegend | 403505 | |
| human IgG1 isotype control FITC | BioLegend | 403507 | |
| human IgG1 isotype control PE | BioLegend | 403503 | |
| Human TGF-β1 | Stemcell | 78067 | |
| Human TruStain FcX | BioLegend | 422301 | |
| IBMX | Beyotime Biotechnology | ST1398 | |
| Indomethacin | Solarbio | SI9020 | |
| Insulin | Beyotime Biotechnology | P3376 | |
| iPSC maintenance medium | STEMCELL Technology | 85850 | |
| ITS Media Supplement | Beyotime Biotechnology | C0341-10mL | |
| Matrigel, growth factor reduced | BD Corning | 354230 | |
| Oli Red O staining kit | Beyotime Biotechnology | C0158S | |
| Proline | Solarbio | P0011 | |
| Sodium pyruvate | ThermoFisher | 11360-070 | |
| TGFβ3 | Novoprotein | CJ44 | |
| Toluidine blue staining kit | Solarbio | G2543 | |
| TrypLE Express Enzyme(1x) | Gibco | 12604013 | |
| Ultra-Low Attachment 6 Well Plate | Costar | 3471 | |
| Versene | Gibco | 15040-66 | |
| Y-27632 | Stemcell | 72304 | |
| α-MEM | Hyclone | SH30265 | |
| β-glycerophosphate | Solarbio | G8100 |
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