Overview
यह वीडियो उनके बिलिंग और सुरंग क्षमताओं का आकलन करके ड्रोसोफिला लार्वा में हाइपोक्सिया का परीक्षण करने की एक विधि दिखाता है। इस तकनीक का उपयोग शोधकर्ताओं ने विकास की कमी के साथ उन लोगों से ऑक्सीजन अभाव का अनुभव लार्वा भेद कर सकते हैं । उदाहरण प्रोटोकॉल इस परख के लिए सेटअप को दर्शाता है।
Protocol
यह प्रोटोकॉल ड्रोसोफिला मेलनोगास्टर लार्वा, जे विस एक्सप्रेस (2018) में हाइपोक्सिया का पता लगाने के लिए एक बिलिंग/सुरंग परख से एक अंश है।
1. लार्वा की तैयारी
- परख शुरू करने से दो या अधिक दिन पहले, वांछित प्रयोगात्मक और नियंत्रण संयोजनों (न्यूनतम 20 महिलाओं और 10 पुरुषों प्रत्येक) के पार की स्थापना की अंडे में व्यंजन रखना के रूप में Wieschaus और Nusslein-Volhard द्वारा वर्णित है लेकिन ५० मिलीएल पॉलीप्रोपिलीन बीकर्स और ६.० सेमी डिस्पोजेबल पेट्री व्यंजन अंगूर आगार युक्त और बस उपयोग से पहले खमीर पेस्ट के साथ गंदा का उपयोग करें । जरूरत होने तक कमरे के तापमान पर अंधेरे में अंडे-रखना व्यंजन में मक्खियों को रखें।
- अंगूर आगर नुस्खा - 100 मिलीएल जमे हुए 100% अंगूर का रस ध्यान केंद्रित, 350 एमएल डिओइनाइज्ड पानी, 5 एमएल हिमनदों एसिटिक और 13 ग्राम डी मेलनोगास्टर एगर को 1L ग्लास बीकर में मिलाएं। 1-2 मिनट फटने में माइक्रोवेव, फटने के बीच सरगर्मी, जब तक आगर सब भंग हो गया है । कुछ मिनटों के लिए समाधान ठंडा करें फिर 95% इथेनॉल में निपेजेन (मिथाइल-पी-हाइड्रोक्सीबेनजोएट) के 10 मिलियन (w/v) जोड़ें। मिक्स, तो डिस्पोजेबल 6.0 सेमी पेट्री व्यंजन में प्रति प्लेट 7 एमएल पिपेट, जेल और 3-4 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर सूखने की अनुमति देते हैं। प्लास्टिक बैग में 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
- खमीर पेस्ट नुस्खा - 7 ग्राम सूखे खमीर, 10 एमएल डिओनाइज्ड पानी, एक समान स्थिरता तक एक स्पैटुला के साथ मिलाएं।
- प्रयोगात्मक और नियंत्रण लार्वा उत्पन्न करने के लिए समय पर अंडे संग्रह। नए, खमीर-गंदा, अंगूर प्लेटों का उपयोग करना, सुबह के समय के दौरान अंधेरे में 4 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर अंडे इकट्ठा। इन 4 एच कलेक्शन प्लेट्स को हटा दें और फ्रेश प्लेट्स से रिप्लेस करें। अगले दिन की दोपहर तक 25 डिग्री सेल्सियस पर रात भर 4 एच संग्रह प्लेटों को इनक्यूबेट करें, जब अधिकांश लार्वा रची होगी। इन पहले इंस्टार लार्वा को इकट्ठा करें और प्रयोग स्थापित करने के लिए उनका उपयोग करें।
2. परख प्लेटों की स्थापना
- परख प्लेटों की तैयारी। परख के एक रन के लिए, 10 प्रायोगिक लार्वा और 10 नियंत्रण लार्वा की पांच प्लेटों में से प्रत्येक में पांच परख प्लेटें तैयार करें। भोजन के लिए एक छेद बनाने प्रत्येक प्लेट से आगर के एक केंद्रीय कोर को हटाने के लिए एक 1.5 सेमी कॉर्क बोरर का उपयोग करें। छेद में खमीर पेस्ट (0.8 - 0.9 ग्राम) रखो और छेद भरने के लिए एक छेद बनाने के लिए एक स्पैटुला के साथ धीरे से पैट।
- एगर प्लेट तैयारी - 700 एमएल डियोनाइज्ड पानी को 16 ग्राम डी मेलनोगेस्टर एगर के साथ 2L ग्लास बीकर और माइक्रोवेव में 5 मिनट के लिए मिलाएं। माइक्रोवेव से निकालें और समाधान में अविचलित आगर लाने के लिए एक गिलास रॉड के साथ हलचल। 95% इथेनॉल में 10% (w/v) Nipagen के 17.5 एमएल जोड़ें, मिश्रण है, तो 30 s फटने में माइक्रोवेव हीटिंग जारी रखने के बाद सरगर्मी के बाद, जब तक सभी agar पूरी तरह से भंग कर दिया है । एक या दो मिनट के लिए शांत करें, फिर 10 सेमी प्लास्टिक पेट्री व्यंजनों में 15 एमएल एलिकोट्स को पिपेट करें। एगर को जेल जाने दें, प्लेटों को ढक्कन के साथ कवर करें और उन्हें कुछ घंटों या रात भर के लिए कमरे के तापमान पर सूखने दें। 18 डिग्री सेल्सियस पर सील प्लास्टिक बैग में प्लेटें स्टोर करें।
नोट 1: अधिक डेसिकेशन के कारण प्लेटों की सतह पर निपेजन क्रिस्टल के गठन से बचने के लिए, तैयारी के कुछ दिनों के भीतर प्लेटों का उपयोग करें। यदि आवश्यक हो, तो क्रिस्टल को उन पर 95% शराब के कुछ माइक्रोलीटर छोड़कर फिर से भंग किया जा सकता है।
नोट 2: आगर के बैचों में अलग-अलग जेलिंग गुण हो सकते हैं। सूखी जेल प्लेटों को स्पर्श करने के लिए दृढ़ होना चाहिए और पर्याप्त रूप से लचीला होना चाहिए कि खाद्य छेद बनाने के लिए कॉर्क बोरर का उपयोग करते समय आगर के एक स्वच्छ, अक्षुण्ण सर्कल को हटाया जा सकता है (ऊपर देखें)। - परख प्लेटों में लार्वा स्थापित करना। प्लास्टिक माइक्रोस्पाटुला की नोक को कम करने के लिए यांत्रिक दबाव का उपयोग करें और लार्वा को चुनने के लिए "चिपकने वाला" प्रदान करने के लिए खमीर पेस्ट में टिप को डुबोएं। व्यक्तिगत रूप से पहले इंस्टार लार्वा उठाएं और उन्हें भोजन के टीले के करीब आगर प्लेट पर रखें। प्रयोगात्मक और नियंत्रण जीनोटाइप दोनों के लिए 10 लार्वा की कम से कम पांच प्रतिकृति प्लेटें तैयार करें। एक बार पूरा हो जाने के बाद, प्रत्येक प्लेट को कैप और लेबल करें और प्लेटों (ढक्कन साइड अप) को कमरे के तापमान पर एक अंधेरे स्थान में सेट करें (हमारी प्रयोगशाला में यह 22 डिग्री सेल्सियस है)।
3. परख प्लेटों की निगरानी
- एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत दैनिक प्लेटों की जांच करें और भोजन के शीर्ष पर या आगर की सतह पर लार्वा की संख्या रिकॉर्ड करें। किसी भी दिखाई मृत या मरने वाले लार्वा पर ध्यान दें। ध्यान दें कि कब, और यदि, आगर सब्सट्रैटम में सुरंग को लार्वा के रूप में देखा जाता है जो तीसरे इंस्टार में जाता है। नोट तिथियां जिस पर pupae बनाने के लिए शुरू और किसी भी पुपल असामान्यताओं नोट । दैनिक टिप्पणियों को तब तक जारी रखें जब तक कि सभी लार्वा मर न जाते या पिल्ले न हो।
- एक तुला चिढ़ा सुई के साथ थाली से ध्यान से pupae निकालें और एक अंगूर की थाली में स्थानांतरित। यदि वांछित है, तो यह निर्धारित करने के लिए प्यूपा की निगरानी जारी रखें कि वयस्कों के रूप में कितने eclose।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Dehydrated yeast | |||
| Frozen grape juice concentrate | Welch's | Available at most large supermarkets | |
| Glacial acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099 | |
| Drosophila agar | Apex Bioresearch Products | 66-103 | |
| Methyl-para-hydroxybenzoate | Apex Bioresearch Products | 20-658 | |
| EQUIPMENT | |||
| 50 ml polypropylene beakers | |||
| 6.0 cm disposable Petri dishes | Falcon | 08757100B | |
| 10 cm disposable plastic Petri dishes | E+K Scientific | EK-24104 | |
| Plastic microspatulas | Corning Incorporated | 3012 | |
| Bent teasing needle | Nasco | S08848MH | |
| Dissecting microscope | Any microscope with 10-30X magnification |
