Ensayo isleño: un método de alto rendimiento para evaluar el comportamiento locomotor de Drosophila

Overview

Este video describe el ensayo de la isla, un método conductual utilizado para estudiar la locomoción de Drosophila. El protocolo de ejemplo cuenta con una configuración para el ensayo compatible con el análisis de imágenes semiautomático.

Protocol

Este protocolo es un extracto de Eidhof et al., High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay, J. Vis. Exp. (2017).

1. Construcción de la caja de ensayo de la isla

1. Prepare una bandeja hecha de un material robusto, como el metacrilato de polimetilo (PMMA), para contener una capa de agua(es decir, un baño). Asegúrese de que el material no sea blanco.
   NOTA: Se recomiendan dimensiones de 40 x 35 x 2,5 cm³ (Figura 1A).
2. Prepare una caja (42 x 38 x 25 cm³⁾hecha de un material robusto y transparente, como PMMA, que se colocará alrededor del baño para evitar que las moscas escapen al espacio de laboratorio. Coloque un agujero (20 x 30 cm²⁾en el lado lateral que sea lo suficientemente grande como para que el experimentador maneje fácilmente los viales con moscas y los deje caer en la isla (Figura 1A).
3. Preparar una plataforma elevada de 10 x 15 x 2,5 cm³ de dimensión, hecha de un material impermeable (PMMA o plástico) estanco.
   NOTA: Esta plataforma es necesaria para tener una superficie blanca uniforme para garantizar un buen contraste para el análisis de imágenes. El tamaño no es necesariamente fijo, pero debe ser lo suficientemente grande como para asegurarse de que todas las moscas aterrizan inicialmente en la plataforma y tienen la oportunidad de caminar sobre ella (Figura 1A).
4. Corrija la plataforma pegándola en el baño o colocando pesas u otros objetos pesados dentro del cuadro de la plataforma para evitar cambios posicionales de la plataforma durante la sesión experimental/de filmación.

2. Requisitos de software e instalación

1. Instalación de software de grabación de imágenes.
   1. Descargue el software de grabación de imágenes para grabar la serie de imágenes de la isla (consulte la Tabla de materiales)e instale el software en un ordenador.
      NOTA: Windows solo admite el software de grabación por imágenes descrito en este protocolo. Se ha añadido una alternativa para otros usuarios a la Tabla de Materiales.

3. Preparación de las moscas que se probarán en el ensayo de la isla

1. Recoger moscas escenificadas para cada condición experimental bajo anestesia de dióxido de frío o carbono (CO_2),como se describió anteriormente (durante un período de 1 a 2 días).
   1. Prepare un mínimo de 3 viales de muestra por condición experimental, cada uno con aproximadamente 15 moscas escenificadas. Utilice únicamente moscas con alas intactas y que sean de edad y sexo similares.
      NOTA: Para los experimentos descritos aquí, 5 viales de muestra que contienen 15 moscas macho de los genotipos con^-; Actin-Gal4/+ (control) y w^-; Actin-Gal4/GD11950 (tefu RNAi) fueron recogidos el día del eclosión, envejecido durante 4 días, y se utilizaron para realizar el ensayo de la isla. RNAi, cepas de control, y el conductor Actin-gal4 se obtuvieron de una fuente comercial (véase la Tabla de Materiales).
2. Deje que las moscas se recuperen para evitar efectos de los anestésicos (al menos 1 día cuando se utiliza CO₂₎antes de probar las moscas recogidas en el ensayo de la isla a la edad de interés.

4. Configuración experimental

NOTA: Véase la Figura 1B.

1. Agregue agua fría con una pequeña cantidad de jabón a la bandeja de baño y coloque la plataforma en el medio.
   NOTA: El jabón disminuye la tensión superficial del agua; moscas que tocan el agua se ahogarán. Esto evita el aumento de las cantidades de moscas que vuelan en la caja durante la progresión de la sesión experimental.
2. Coloque la caja transparente en la parte superior de la bandeja e ilumine la plataforma desde arriba con una lámpara.
   NOTA: La iluminación de la plataforma es necesaria principalmente para garantizar un contraste de vídeo adecuado. Una luz LED ordinaria de 12 V es apropiada para esto.
3. Coloque la cámara web directamente encima de la plataforma (fuera de la caja) y conéctelo a un ordenador.
4. Cree nuevas carpetas en el equipo para almacenar los diferentes datos experimentales antes de los experimentos.
   1. Siga la estructura del ejemplo ilustrado en la Figura 2A para crear las carpetas. Por ejemplo, si el diseño experimental requiere probar dos genotipos con cinco réplicas cada uno, cree primero una carpeta principal que contenga la fecha del experimento. Dentro de la carpeta principal, cree dos subcarpetas (una por genotipo). Dentro de las carpetas de genotipo, cree cinco subcarpetas nuevas, una por réplica.
      NOTA: Para su posterior análisis, es esencial que la serie de imágenes correspondiente a experimentos individuales se guarde en carpetas con nombres únicos.

5. Configuración de configuración de vídeo en la sección "Capturar dispositivo" de la interfaz

1. Abra el software de grabación de imágenes y, en la pestaña "Capturar", haga clic en "Imágenes de lapso de tiempo..." y seleccione la cámara web adecuada como el "Dispositivo de captura".
2. Coloque una mosca muerta en la isla; ajuste la configuración del vídeo haciendo clic en el cuadro "Configuración de vídeo". Desplázate por las barras de herramientas, ajustando el brillo, el contraste y el color de una manera que la mosca muerta aparezca negra sobre un fondo blanco (Figura 2B). Cuando se completen los ajustes, haga clic en "Aceptar".

6. Configuración de grabación y guardado de vídeo en la sección "Time-lapse" de la interfaz

1. Ajuste la configuración de la "Configuración de película de lapso de tiempo" para guardar el experimento como un archivo .avi. Haga clic en "Examinar...", seleccione el directorio donde se almacenará la película, defina el nombre del vídeo y pulse "guardar".
   NOTA: El archivo de vídeo no se utiliza para la cuantificación de datos; sin embargo, podría ser útil tener una idea general sobre el experimento.
2. Ajuste la configuración en la sección "Configuración de película de lapso de tiempo".
   1. En el cuadro de compresión, seleccione "Código Intel IYUV" para la compresión de vídeo y elija "Tomar un fotograma cada 0,1 segundos", con la "Tasa de reproducción (imágenes por segundo):" a 10.
   2. Guarde la serie temporal del experimento como .bmp fotogramas haciendo clic en "Avanzado..." Seleccione "Crear una imagen .bmp para cada fotograma capturado". Haga clic en "Examinar". Seleccione el mismo directorio en la ventana "Durante la captura de película AVI" (como se eligió en el paso 6.1), haga clic en "Abrir" y pulse "Ok".
      NOTA: Tenga en cuenta que, durante el experimento, los fotogramas se almacenan como .bmp archivos (necesarios para el análisis de datos). El programa nombra los fotogramas como "A" seguido del número correspondiente a la secuencia de captura de fotogramas (por ejemplo,"A_number.bmp") (Figura 2C). Guarde siempre las imágenes que pertenecen a diferentes experimentos en una nueva carpeta para asegurarse de que las series de imágenes grabadas previamente no se sobrescribirán. Tenga en cuenta que las imágenes no se guardan automáticamente en la misma carpeta que el archivo de vídeo a menos que esta carpeta esté seleccionada en "Examinar..." al hacer clic en el cuadro "Avanzado".

7. Ensayo insular y recopilación de datos

1. Pulse el botón de inicio en la interfaz de imagen time-lapse del software de grabación de imágenes para iniciar la grabación.
2. Toque el vial experimental que contiene moscas (paso 3) 2-3 veces para asegurarse de que las moscas están en la parte inferior del vial. Retire rápidamente el tapón del vial y, con un movimiento vigoroso, toque el vial en la plataforma para que todas las moscas caigan sobre la plataforma al mismo tiempo(Figura 1C).
3. Después de aproximadamente 30 s, pulse el botón "Detener" para detener la grabación.
   NOTA: Si todas las moscas desaparecen de la plataforma, la grabación se puede detener antes.
4. Retire las moscas que permanecen durante 30 s en la plataforma a mano después de detener la grabación de la imagen.
5. Antes de continuar con la grabación del siguiente experimento, cambie el directorio de destino de los archivos y películas .bmp (consulte la sección 6).

Representative Results

Figura 1: Diagrama de flujo que describe los requisitos, el procedimiento experimental y el análisis del ensayo de la isla. (A) Equipo de ensayo de la isla. (B) Configuración experimental para el ensayo de la isla. (C) Ensayo de la isla. (D) Procesamiento de datos de ensayos insulares con la macro "Ensayo de la islade Drosophila". La macro"Drosophila Island Assay" se compone de 3 sub macros: 1) hacer pila y proyección, 2) definir plataforma, y 3) análisis. (E) Procesamiento y evaluación estadística de datos utilizando el script "Análisis de ensayo insular". Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Ejemplos de diferentes ajustes necesarios durante el protocolo. (A) La estructura de directorios necesaria en la que se deben almacenar experimentos de ensayo de isla para el procesamiento y análisis de datos. (B) Al ajustar la configuración de vídeo, las moscas deben aparecer negras sobre un fondo blanco. (C) Archivos de salida de fotogramas de imagen guardados por el software de grabación de imágenes descrito en este manuscrito. (D) El contorno amarillo muestra la selección de la plataforma. La selección de la plataforma almacenada en el "ROI Manager" se resalta en azul. (E) Las moscas se representan como puntos blancos durante el ajuste del "Ajuste mínimo del tamaño de la mosca." La ventana de resultados muestra el área de las moscas en píxeles. (F) Ejemplo de un único fotograma de imagen grabado (a la izquierda) y el fotograma correspondiente en la pila de imágenes resultante, obtenido con la macro "Ensayo de la islade Drosophila" (a la derecha). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
25 x 95 mm Drosophila vials	Flystuff	32-116SB	-
Logitech C525 HD Webcam	Logitech	-	Any webcam with USB connection is suitable.
Stand to hold webcam	-	-	-
Lamp	-	-	12 V LED lights are appropriate
Pounding pad	-	-	Any mouse pad works
Island Assay box	-	-	Dimensions 40x35x2.5 cm. Hole 20x30 cm. Transparent.
Island Assay bath	-	-	Dimensions 42x38x25 cm. Non white.
Island/platform	-	-	Dimensions 42x38x25 cm. Uniform white.
Soap	-	-	Standard dishwashing detergent is suitable.
Computer	-	-	Scripts run both on Windows and Mac
Image-recording software: HandiAvi®	AZcendant®	-	HandyAvi is only compatible with Windows and has been described throughout the manuscript. It can be downloaded from: http://www.azcendant.com/DownloadHandyAvi.html (version 5.0)
Image-recording software: WebcamCapture	-	-	Fiji/ImageJ plugin that can be used on Mac alternative to HandyAvi for image-recordings and can be downloaded from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/webcam-capture/ When using this method, the user has to use the same folder setup and image-recording settings indicated in this manuscript, with the exception that for each experimental replicate, the captured image stack should be exported as Stack.tiff to the corresponding experimental replicate folder. Upon running the "Drosophila Island Assay" macro on this data, no text should be present in the "First frame identifier" setting.