Eilandtest: een methode met hoge doorvoer om drosophila-locomotorisch gedrag te evalueren

Overview

Deze video beschrijft de eilandtest, een gedragsmethode die wordt gebruikt om drosophila-voortbeweging te bestuderen. Het voorbeeldprotocol bevat een installatie voor de test die compatibel is met semi-geautomatiseerde beeldanalyse.

Protocol

Dit protocol is een fragment uit Eidhof et al., High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay, J. Vis. Exp. (2017).

1. Bouw van de Island Assay Box

1. Bereid een dienblad van een robuust materiaal, zoals polymethylmethacylaat (PMMA), voor op een laag water(d.w.z. een bad). Zorg ervoor dat het materiaal niet wit is.
   OPMERKING: Afmetingen van 40 x 35 x 2,5 cm³ worden aanbevolen (figuur 1A).
2. Maak een doos (42 x 38 x 25 cm³) van een robuust, transparant materiaal, zoals PMMA, klaar om rond het bad te worden geplaatst om te voorkomen dat de vliegen in de laboratoriumruimte ontsnappen. Plaats een gat (20 x 30 cm²) aan de zijkant dat groot genoeg is voor de experimenteerder om de flesjes gemakkelijk met vliegen te hanteren en op het eiland te laten vallen (figuur 1A).
3. Maak een verhoogd platform van 10 x 15 x 2,5 cm³ in afmeting, gemaakt van een ondoordringbaar materiaal (PMMA of plastic) dat waterdicht is.
   OPMERKING: Dit platform moet een uniform wit oppervlak hebben om een goed contrast voor beeldanalyse te garanderen. De grootte is niet noodzakelijkerwijs vast, maar het moet groot genoeg zijn om ervoor te zorgen dat alle vliegen in eerste instantie op het platform landen en de kans krijgen om erop te lopen (figuur 1A).
4. Bevestig het platform door het in het bad te lijmen of gewichten of andere zware voorwerpen in de platformbox te plaatsen om positieveranderingen van het platform tijdens de experimentele / filmsessie te voorkomen.

2. Softwarevereisten en installatie

1. Installatie van beeldopnamesoftware.
   1. Download beeldopnamesoftware om de eilandbeeldserie op te nemen (zie de tabel met materialen)en installeer de software op een computer.
      OPMERKING: De imaging-opnamesoftware die in dit protocol wordt beschreven, wordt alleen ondersteund door Windows. Er is een alternatief voor andere gebruikers toegevoegd aan de tabel met materialen.

3. Voorbereiding van de vliegen die moeten worden getest in de eilandtest

1. Verzamel geënsceneerde vliegen voor elke experimentele toestand onder koude of kooldioxide (CO₂) anesthesie, zoals eerder beschreven (over een periode van 1 - 2 dagen).
   1. Bereid minimaal 3 monsterflacons per experimentele conditie, elk met ongeveer 15 geënsceneerde vliegen. Gebruik alleen vliegen met intacte vleugels en die van vergelijkbare leeftijd en geslacht zijn.
      OPMERKING: Voor de hier beschreven experimenten bevatten 5 monsterflacons met 15 mannelijke vliegen van de genotypen w^-; Actin-Gal4/+ (controle) en w^-; Actin-Gal4/GD11950 (tefu RNAi) werden verzameld op de dag van eclosie, 4 dagen oud, en werden gebruikt om de eilandtest uit te voeren. RNAi, controlestammen en de Actin-gal4 driver werden verkregen uit een commerciële bron (zie de tabel met materialen).
2. Laat de vliegen herstellen om effecten van de verdoving te voorkomen (ten minste 1 dag bij gebruik van CO₂₎voordat de verzamelde vliegen in de eilandtest worden getest op de leeftijd van interesse.

4. Experimentele opstelling

OPMERKING: Zie figuur 1B.

1. Voeg koud water met een kleine hoeveelheid zeep toe aan de badbak en plaats het platform in het midden.
   OPMERKING: De zeep vermindert de oppervlaktespanning van het water; vliegen die het water raken, zullen verdrinken. Dit voorkomt toenemende hoeveelheden vliegen die in de doos vliegen tijdens de voortgang van de experimentele sessie.
2. Plaats de transparante doos bovenop de lade en verlicht het platform van bovenaf met behulp van een lamp.
   OPMERKING: Verlichting van het platform is voornamelijk nodig om een goed videocontrast te garanderen. Hiervoor is een gewone 12-V LED lamp geschikt.
3. Plaats de webcam direct boven het platform (buiten de doos) en sluit deze aan op een computer.
4. Maak nieuwe mappen op de computer om de verschillende experimentele gegevens vóór de experimenten op te slaan.
   1. Volg de structuur van het voorbeeld in figuur 2A om de mappen te maken. Als het experimentele ontwerp bijvoorbeeld twee genotypen met elk vijf replica's vereist, maakt u eerst een hoofdmap met de datum van het experiment. Maak in de hoofdmap twee submappen (één per genotype). Maak in de genotypemappen vijf nieuwe submappen, één per replica.
      OPMERKING: Voor verdere analyse is het essentieel dat de afbeeldingsreeksen die overeenkomen met individuele experimenten worden opgeslagen in mappen met unieke namen.

5. Video-instellingen instellen in het gedeelte "Opnameapparaat" van de interface

1. Open de beeldopnamesoftware en klik onder het tabblad "Vastleggen" op "Time-Lapse Images..." en selecteer de juiste webcam als het "Capture Device".
2. Plaats een dode vlieg op het eiland; pas de video-instellingen aan door op het vak "Video-instellingen" te klikken. Blader door de gereedschapsbalken en pas de helderheid, het contrast en de kleur zo aan dat de dode vlieg zwart lijkt op een witte achtergrond (afbeelding 2B). Wanneer de aanpassingen zijn voltooid, klikt u op "Ok".

6. Instellingen voor opname en video opslaan Instellen in het gedeelte "Time-lapse" van de interface

1. Pas de instellingen in de "Time-Lapse Movie Setup" aan om het experiment op te slaan als een .avi bestand. Klik op "Bladeren...", selecteer de map waar de film wordt opgeslagen, definieer de naam van de video en druk op "opslaan".
   OPMERKING: Het videobestand wordt niet gebruikt voor de kwantificering van gegevens; het kan echter nuttig zijn om een algemeen idee te krijgen van het experiment.
2. Pas de instellingen aan in het gedeelte "Time-Lapse Movie Setup".
   1. Selecteer in het compressievak "Intel IYUV-code" voor videocompressie en kies "Neem elke 0,1 seconden één frame", met de "Afspeelsnelheid (afbeeldingen per seconde):" op 10.
   2. Sla de experimenttijdreeks op als .bmp frames door op "Geavanceerd..." te klikken Selecteer "Maak een .bmp afbeelding voor elk vastgelegd frame". Klik op "Bladeren". Selecteer dezelfde map in het venster "Tijdens AVI-filmopname" (zoals gekozen in stap 6.1), klik op "Openen" en druk op "Ok".
      OPMERKING: Merk op dat tijdens het experiment de frames worden opgeslagen als .bmp bestanden (vereist voor gegevensanalyse). Het programma benoemt de frames als "A" gevolgd door het nummer dat overeenkomt met de frame capture-reeks (bijv."A_number.bmp") (Figuur 2C). Sla de afbeeldingen van verschillende experimenten altijd op in een nieuwe map om ervoor te zorgen dat eerder opgenomen beeldreeksen niet worden overschreven. Houd er rekening mee dat de afbeeldingen niet automatisch worden opgeslagen in dezelfde map als het videobestand, tenzij deze map is geselecteerd onder "Bladeren..." wanneer u op het vak "Geavanceerd" klikt.

7. Eilandtest en gegevensverzameling

1. Druk op de startknop in de time-lapse beeldinterface van de beeldopnamesoftware om de opname te starten.
2. Tik 2-3 keer op de experimentele flacon met vliegen (stap 3) om ervoor te zorgen dat vliegen zich op de bodem van de flacon bevinden. Verwijder snel de stekker van de flacon en tik met een krachtige beweging op de flacon op het platform, zodat alle vliegen tegelijkertijd op het platform vallen (figuur 1C).
3. Druk na ongeveer 30 s op de knop "Stop" om de opname te stoppen.
   OPMERKING: Als alle vliegen van het platform verdwijnen, kan de opname eerder worden gestopt.
4. Verwijder de vliegen die 30 s op het platform achterblijven met de hand na het stoppen van de beeldopname.
5. Voordat u doorgaat met het opnemen van het volgende experiment, wijzigt u de doelmap voor de .bmp bestanden en films (zie sectie 6).

Representative Results

Figuur 1: Stroomdiagram met de vereisten, experimentele procedure en analyse van de eilandtest. (A) Eilandtestapparatuur. (B) Experimentele opstelling voor de eilandtest. (C) Eilandtest. (D) Verwerking van eilandtestgegevens met de macro "Drosophila Island Assay". De "Drosophila Island Assay" macro bestaat uit 3 submacro's: 1) stapel en projectie maken, 2) platform definiëren en 3) analyse. (E) Verwerking en statistische evaluatie van gegevens met behulp van het "Island Assay Analysis" script. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 2: Voorbeelden van verschillende aanpassingen die nodig zijn tijdens het protocol. (A) De vereiste directorystructuur waarin eilandtestexperimenten moeten worden opgeslagen voor gegevensverwerking en -analyse. (B) Bij het aanpassen van de video-instellingen moeten vliegen zwart op een witte achtergrond verschijnen. (C) Image frame output bestanden zoals opgeslagen door de image-recording software beschreven in dit manuscript. (D) De gele omtrek toont de platformselectie. De opgeslagen platformselectie in de "ROI Manager" is blauw gemarkeerd. (E) Vliegen worden weergegeven als witte stippen tijdens de aanpassing van de instelling "Minimale vlieggrootte.". Het resultatenvenster toont het gebied van de vliegen in pixels. (F) Voorbeeld van een enkel opgenomen beeldframe (links) en het bijbehorende frame in de resulterende beeldstapel, verkregen met de macro "Drosophila Island Assay" (rechts). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
25 x 95 mm Drosophila vials	Flystuff	32-116SB	-
Logitech C525 HD Webcam	Logitech	-	Any webcam with USB connection is suitable.
Stand to hold webcam	-	-	-
Lamp	-	-	12 V LED lights are appropriate
Pounding pad	-	-	Any mouse pad works
Island Assay box	-	-	Dimensions 40x35x2.5 cm. Hole 20x30 cm. Transparent.
Island Assay bath	-	-	Dimensions 42x38x25 cm. Non white.
Island/platform	-	-	Dimensions 42x38x25 cm. Uniform white.
Soap	-	-	Standard dishwashing detergent is suitable.
Computer	-	-	Scripts run both on Windows and Mac
Image-recording software: HandiAvi®	AZcendant®	-	HandyAvi is only compatible with Windows and has been described throughout the manuscript. It can be downloaded from: http://www.azcendant.com/DownloadHandyAvi.html (version 5.0)
Image-recording software: WebcamCapture	-	-	Fiji/ImageJ plugin that can be used on Mac alternative to HandyAvi for image-recordings and can be downloaded from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/webcam-capture/ When using this method, the user has to use the same folder setup and image-recording settings indicated in this manuscript, with the exception that for each experimental replicate, the captured image stack should be exported as Stack.tiff to the corresponding experimental replicate folder. Upon running the "Drosophila Island Assay" macro on this data, no text should be present in the "First frame identifier" setting.