Insel-Assay: Eine High-Throughput-Methode zur Bewertung des Drosophila-Lokomotor-Verhaltens

Overview

Dieses Video beschreibt den Inseltest, eine Verhaltensmethode, die verwendet wird, um Drosophila-Fortbewegung zu studieren. Das Beispielprotokoll verfügt über ein Setup für den Test, der mit der halbautomatischen Bildanalyse kompatibel ist.

Protocol

Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Eidhof et al.,High-Throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay, J. Vis. Exp. (2017).

1. Bau der Island Assay Box

1. Bereiten Sie eine Schale aus einem robusten Material, wie Polymethylmethacrylat (PMMA), vor, um eine Wasserschicht(d. h. ein Bad) zu enthalten. Stellen Sie sicher, dass das Material nicht weiß ist.
   HINWEIS: Es werden Abmessungen von 40 x 35 x 2,5 cm³ empfohlen (Abbildung 1A).
2. Bereiten Sie eine Box (42 x 38 x 25 cm³) aus einem robusten, transparenten Material wie PMMA vor, die um das Bad gelegt werden soll, um zu verhindern, dass die Fliegen in den Laborraum entweichen. Legen Sie ein Loch (20 x 30 cm²) auf die Seitenseite, das groß genug ist, damit der Experimentator die Fläschchen mit Fliegen leicht handhaben und auf die Insel fallen lässt (Abbildung 1A).
3. Bereiten Sie eine erhöhte Plattform 10 x 15 x 2,5 cm³ in der Dimension, aus einem undurchlässigen Material (PMMA oder Kunststoff), das wasserdicht ist.
   HINWEIS: Diese Plattform muss über eine einheitliche weiße Oberfläche verfügen, um einen guten Kontrast für die Bildanalyse zu gewährleisten. Die Größe ist nicht unbedingt festgelegt, aber sie sollte groß genug sein, um sicherzustellen, dass alle Fliegen zunächst auf der Plattform landen und die Chance erhalten, darauf zu gehen (Abbildung 1A).
4. Befestigen Sie die Plattform, indem Sie sie entweder in das Bad kleben oder Gewichte oder andere schwere Gegenstände in der Plattformbox platzieren, um Positionsänderungen der Plattform während der Experimentier-/Filmsitzung zu verhindern.

2. Software-Anforderungen und Installation

1. Installation von Bildaufzeichnungssoftware.
   1. Laden Sie Bildaufnahmesoftware herunter, um die Inselbildserie aufzuzeichnen (siehe Tabelle der Materialien) und installieren Sie die Software auf einem Computer.
      HINWEIS: Die in diesem Protokoll beschriebene Imaging-Recording-Software wird nur von Windows unterstützt. Der Tabelle der Materialienwurde eine Alternative für andere Benutzer hinzugefügt.

3. Vorbereitung der Fliegen, die im Inselassay getestet werden sollen

1. Sammeln Sie inszenierte Fliegen für jeden Versuchszustand unter Kalt- oder Kohlendioxid_(CO2)Anästhesie, wie zuvor beschrieben (über einen Zeitraum von 1 - 2 Tagen).
   1. Bereiten Sie mindestens 3 Probenfläschchen pro Versuchszustand vor, die jeweils etwa 15 inszenierte Fliegen enthalten. Verwenden Sie nur Fliegen mit intakten Flügeln und die von ähnlichem Alter und Geschlecht sind.
      HINWEIS: Für die hier beschriebenen Experimente, 5 Probenfläschchen mit 15 männlichen Fliegen der Genotypen w^{- ;} Actin-Gal4/+ (Steuerung) und w^-; Actin-Gal4/GD11950 (tefu RNAi) wurden am Tag der Eclosion gesammelt, 4 Tage alt, und wurden verwendet, um die Insel Assay durchzuführen. RNAi, Kontrollstämme und der Actin-gal4-Treiber wurden aus einer kommerziellen Quelle bezogen (siehe Tabelle der Materialien).
2. Lassen Sie die Fliegen erholen, um Auswirkungen von den Anästhetika zu vermeiden (mindestens 1 Tag bei Verwendung von CO₂) vor dem Testen der gesammelten Fliegen in der Insel Assay im Alter von Interesse.

4. Experimentelle Einrichtung

HINWEIS: Siehe Abbildung 1B.

1. Fügen Sie kaltes Wasser mit einer kleinen Menge Seife in das Bad Tablett und positionieren Sie die Plattform in der Mitte.
   HINWEIS: Die Seife verringert die Oberflächenspannung des Wassers; Fliegen, die das Wasser berühren, werden ertrinken. Dies verhindert, dass während des Verlaufs der Versuchssitzung immer mehr Fliegen in der Box fliegen.
2. Legen Sie die transparente Box auf das Tablett und beleuchten Sie die Plattform von oben mit einer Lampe.
   HINWEIS: Die Beleuchtung der Plattform ist hauptsächlich erforderlich, um einen korrekten Videokontrast zu gewährleisten. Hierfür ist ein gewöhnliches 12-V-LED-Licht geeignet.
3. Positionieren Sie die Webcam direkt über der Plattform (außerhalb des Kastens) und verbinden Sie sie mit einem Computer.
4. Erstellen Sie neue Ordner auf dem Computer, um die verschiedenen experimentellen Daten vor den Experimenten zu speichern.
   1. Folgen Sie der Struktur des in Abbildung 2A dargestellten Beispiels, um die Ordner zu erstellen. Wenn der Versuchsentwurf beispielsweise das Testen von zwei Genotypen mit jeweils fünf Replikationen erfordert, erstellen Sie zunächst einen Hauptordner, der das Datum des Experiments enthält. Erstellen Sie im Hauptordner zwei Unterordner (einen pro Genotyp). Erstellen Sie in den Genotypordnern fünf neue Unterordner, einen pro Replikation.
      HINWEIS: Für die weitere Analyse ist es wichtig, dass die den einzelnen Experimenten entsprechenden Bildreihen in Ordnern mit eindeutigen Namen gespeichert werden.

5. Einrichtung der Videoeinstellungen im Abschnitt "Capture Device" der Schnittstelle

1. Öffnen Sie die Bildaufnahmesoftware und klicken Sie unter der Registerkarte "Capture" auf "Zeitrafferbilder..." und wählen Sie die entsprechende Webcam als "Capture Device" aus.
2. Legen Sie eine tote Fliege auf der Insel; die Videoeinstellungen anpassen, indem Sie auf das Feld "Videoeinstellungen" klicken. Blättern Sie durch die Werkzeugleisten, passen Sie Helligkeit, Kontrast und Farbe so an, dass die tote Fliege schwarz auf weißem Hintergrund erscheint (Abbildung 2B). Wenn die Anpassungen abgeschlossen sind, klicken Sie auf "Ok".

6. Aufnahme- und Videospeichereinstellungen Setup im Abschnitt "Zeitraffer" der Schnittstelle

1. Passen Sie die Einstellungen im "Time-Lapse Movie Setup" an, um das Experiment als .avi Datei zu speichern. Klicken Sie auf "Durchsuchen...", wählen Sie das Verzeichnis aus, in dem der Film gespeichert wird, definieren Sie den Namen des Videos und drücken Sie "Speichern".
   HINWEIS: Die Videodatei wird nicht für die Quantifizierung von Daten verwendet; Es kann jedoch nützlich sein, sich ein Bild vom Experiment zu machen.
2. Passen Sie die Einstellungen im Abschnitt "Time-Lapse Movie Setup" an.
   1. Wählen Sie in der Komprimierungsbox "Intel IYUV-Code" für die Videokomprimierung und wählen Sie "Alle 0,1 Sekunden einen Frame nehmen", mit der "Wiedergaberate (Bilder pro Sekunde):" bei 10.
   2. Speichern Sie die Experiment-Zeitreihen als .bmp Frames, indem Sie auf "Erweitert..." klicken. Wählen Sie "Erstellen eines .bmp Bild für jeden erfassten Frame". Klicken Sie auf "Durchsuchen". Wählen Sie das gleiche Verzeichnis im Fenster "Während der AVI-Filmaufnahme" (wie in Schritt 6.1 ausgewählt), klicken Sie auf "Öffnen" und drücken Sie "Ok".
      HINWEIS: Beachten Sie, dass die Frames während des Experiments als .bmp Dateien gespeichert werden (erforderlich für die Datenanalyse). Das Programm benennt die Frames als "A" gefolgt von der Zahl, die der Frame-Capture-Sequenz entspricht (z.B."A_number.bmp") (Abbildung 2C). Speichern Sie die Bilder, die zu verschiedenen Experimenten gehören, immer in einem neuen Ordner, um sicherzustellen, dass zuvor aufgezeichnete Bildserien nicht überschrieben werden. Beachten Sie, dass die Bilder nicht automatisch im selben Ordner wie die Videodatei gespeichert werden, es sei denn, dieser Ordner ist unter "Durchsuchen..." ausgewählt. wenn Sie auf das Feld "Erweitert" klicken.

7. Insel-Assay und Datensammlung

1. Drücken Sie die Starttaste in der Zeitraffer-Bildschnittstelle der Bildaufnahmesoftware, um die Aufnahme zu starten.
2. Tippen Sie 2-3 Mal auf die experimentelle Durchstechflasche mit Fliegen (Schritt 3) 2-3 Mal, um sicherzustellen, dass sich die Fliegen am Boden der Durchstechflasche befinden. Entfernen Sie schnell den Stecker der Durchstechflasche und tippen Sie mit einer kräftigen Bewegung auf die Durchstechflasche auf der Plattform, so dass alle Fliegen gleichzeitig auf die Plattform fallen (Abbildung 1C).
3. Nach ca. 30 s drücken Sie die "Stop"-Taste, um die Aufnahme zu beenden.
   HINWEIS: Wenn alle Fliegen von der Plattform verschwinden, kann die Aufnahme früher gestoppt werden.
4. Entfernen Sie die Fliegen, die für 30 s auf der Plattform bleiben, von Hand, nachdem Sie die Bildaufnahme beendet haben.
5. Bevor Sie mit der Aufzeichnung des nächsten Experiments fortfahren, ändern Sie das Zielverzeichnis für die .bmp Dateien und Filmen (siehe Abschnitt 6).

Representative Results

Abbildung 1: Flussdiagramm, das die Anforderungen, das experimentelle Verfahren und die Analyse des Inseltestes umreißt. (A) Insel-Assay-Ausrüstung. (B) Versuchsaufbau für den Inseltest. (C) Insel-Assay. (D) Verarbeitung von Insel-Assay-Daten mit dem Makro"Drosophila Island Assay". Das"Drosophila Island Assay"-Makro besteht aus 3 Submakros: 1) Stapel und Projektion, 2) Plattform definieren und 3) Analyse. (E) Verarbeitung und statistische Auswertung von Daten mit dem Skript "Insel-Assay-Analyse". Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Beispiele für verschiedene Anpassungen, die während des Protokolls erforderlich sind. (A) Die erforderliche Verzeichnisstruktur, in der Inselassayexperimente für die Datenverarbeitung und -analyse gespeichert werden müssen. (B) Beim Anpassen der Videoeinstellungen müssen Fliegen auf weißem Hintergrund schwarz erscheinen. (C) Bildrahmenausgabedateien, wie sie von der in diesem Manuskript beschriebenen Bildaufnahmesoftware gespeichert werden. (D) Der gelbe Umriss zeigt die Plattformauswahl. Die gespeicherte Plattformauswahl im "ROI Manager" ist blau hervorgehoben. (E) Fliegen werden bei der Einstellung der Einstellung "Minimum fly size" als weiße Punkte dargestellt. Das Ergebnisfenster zeigt den Bereich der Fliegen in Pixeln an. (F) Beispiel eines einzelnen aufgezeichneten Bildrahmens (links) und des entsprechenden Frames im resultierenden Bildstapel, erhalten mit dem Makro"Drosophila Island Assay" (rechts). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
25 x 95 mm Drosophila vials	Flystuff	32-116SB	-
Logitech C525 HD Webcam	Logitech	-	Any webcam with USB connection is suitable.
Stand to hold webcam	-	-	-
Lamp	-	-	12 V LED lights are appropriate
Pounding pad	-	-	Any mouse pad works
Island Assay box	-	-	Dimensions 40x35x2.5 cm. Hole 20x30 cm. Transparent.
Island Assay bath	-	-	Dimensions 42x38x25 cm. Non white.
Island/platform	-	-	Dimensions 42x38x25 cm. Uniform white.
Soap	-	-	Standard dishwashing detergent is suitable.
Computer	-	-	Scripts run both on Windows and Mac
Image-recording software: HandiAvi®	AZcendant®	-	HandyAvi is only compatible with Windows and has been described throughout the manuscript. It can be downloaded from: http://www.azcendant.com/DownloadHandyAvi.html (version 5.0)
Image-recording software: WebcamCapture	-	-	Fiji/ImageJ plugin that can be used on Mac alternative to HandyAvi for image-recordings and can be downloaded from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/webcam-capture/ When using this method, the user has to use the same folder setup and image-recording settings indicated in this manuscript, with the exception that for each experimental replicate, the captured image stack should be exported as Stack.tiff to the corresponding experimental replicate folder. Upon running the "Drosophila Island Assay" macro on this data, no text should be present in the "First frame identifier" setting.