جزيرة المقايسة: طريقة عالية الإنتاجية لتقييم السلوك الحركي Drosophila

Overview

يصف هذا الفيديو مقايسة الجزيرة، وهي طريقة سلوكية تستخدم لدراسة حركة دروسوفيلا. يحتوي بروتوكول العينة على إعداد للاختبارات المتوافقة مع تحليل الصورة شبه التلقائي.

Protocol

هذا البروتوكول هو مقتطف من Eidhof وآخرون.، تحليل عالي الإنتاجية للسلوك الحركي في أساي جزيرة دروسوفيلا، J. Vis. Exp. (2017).

1- بناء صندوق اساي الجزيرة

1. إعداد صينية مصنوعة من مادة قوية، مثل ميثيل (PMMA)، لاحتواء طبقة من الماء(أي حمام). تأكد من أن المادة ليست بيضاء.
   ملاحظة: يوصى بأبعاد 40 × 35 × 2.5 سم³ (الشكل 1أ).
2. إعداد مربع (42 × 38 × 25 سم³) مصنوعة من مادة قوية وشفافة ، مثل PMMA ، ليتم وضعها حول الحمام لمنع الذباب من الهروب إلى الفضاء المختبري. ضع حفرة (20 × 30 سم²) على الجانب الجانبي الذي هو كبير بما يكفي للمجرب للتعامل بسهولة مع قوارير الذباب وإسقاطها على الجزيرة (الشكل 1A).
3. إعداد منصة مرتفعة 10 × 15 × 2.5 سم³ في البعد، مصنوعة من مادة منيعة (PMMA أو البلاستيك) التي هي ماء.
   ملاحظة: هذه المنصة مطلوبة للحصول على سطح أبيض موحد لضمان تباين جيد لتحليل الصور. الحجم ليس ثابتا بالضرورة ، ولكن يجب أن يكون كبيرا بما يكفي للتأكد من أن جميع الذباب يهبط في البداية على المنصة والحصول على فرصة للسير عليه(الشكل 1A).
4. إصلاح المنصة إما عن طريق الإلتصاق بها في الحمام أو وضع الأوزان أو غيرها من الأشياء الثقيلة داخل مربع المنصة لمنع التغييرات الموضعية للمنصة خلال الدورة التجريبية / التصوير.

2. متطلبات البرمجيات والتركيب

1. تركيب برامج تسجيل الصور.
   1. قم بتنزيل برنامج تسجيل الصور لتسجيل سلسلة صور الجزيرة (انظر جدول المواد)وتثبيت البرنامج على جهاز كمبيوتر.
      ملاحظة: برنامج تسجيل الصور الموضح في هذا البروتوكول معتمد فقط من قبل Windows. تمت إضافة بديل للمستخدمين الآخرين إلى جدول المواد.

3. إعداد الذباب ليتم اختبارها في جزيرة المقايسة

1. جمع الذباب المرحلي لكل حالة تجريبية تحت التخدير البارد أو ثاني أكسيد الكربون (CO_2)،كما هو موضح سابقا (على مدى فترة 1-2 أيام).
   1. إعداد ما لا يقل عن 3 قنينات عينة لكل حالة تجريبية، تحتوي كل منها على ما يقرب من 15 ذبابة مرحلية. فقط استخدام الذباب مع أجنحة سليمة وتلك هي من نفس العمر والجنس.
      ملاحظة: للتجارب الموصوفة هنا ، 5 قوارير عينة تحتوي على 15 ذباب ذكر من الأنماط الجينية ث^-؛ أكتين-Gal4/+ (التحكم) و ث^-; تم جمع Actin-Gal4/GD11950 (tefu RNAi) في يوم الانهيار ، الذين تتراوح أعمارهم بين 4 أيام ، واستخدمت لإجراء فحص الجزيرة. تم الحصول على RNAi وسلالات التحكم وسائق Actin-gal4 من مصدر تجاري (انظر جدول المواد).
2. دع الذباب يتعافى لتجنب الآثار الناجمة عن التخدير (يوم واحد على الأقل عند استخدام_ثانيأكسيد الكربون) قبل اختبار الذباب الذي تم جمعه في مقايسة الجزيرة في سن الاهتمام.

4. الإعداد التجريبي

ملاحظة: انظر الشكل 1باء.

1. إضافة الماء البارد مع كمية صغيرة من الصابون إلى علبة الحمام ووضع منصة في الوسط.
   ملاحظة: الصابون يقلل من التوتر السطحي للماء. الذباب الذي يلمس الماء سيغرق وهذا يمنع كميات متزايدة من الذباب تحلق في منطقة الجزاء خلال تطور الدورة التجريبية.
2. ضع المربع الشفاف أعلى الدرج وقم بإضاءة المنصة من الأعلى باستخدام مصباح.
   ملاحظة: إن إضاءة المنصة مطلوبة بشكل أساسي لضمان تباين الفيديو المناسب. ضوء LED 12-V العادي مناسب لهذا.
3. ضع كاميرا الويب مباشرة فوق المنصة (خارج الصندوق) واربطها بجهاز كمبيوتر.
4. إنشاء مجلدات جديدة على الكمبيوتر لتخزين البيانات التجريبية المختلفة قبل التجارب.
   1. اتبع بنية المثال الموضح في الشكل 2A لإنشاء المجلدات. على سبيل المثال، إذا كان التصميم التجريبي يتطلب اختبار نوعين جينيين مع خمس نسخ متماثلة لكل منهما، فأنشئ أولا مجلدا رئيسيا يحتوي على تاريخ التجربة. داخل المجلد الرئيسي إنشاء مجلدين فرعيين (واحد لكل النمط الجيني). داخل مجلدات النمط الجيني إنشاء خمسة مجلدات فرعية جديدة واحد لكل تكرار.
      ملاحظة: لمزيد من التحليل، من الضروري أن يتم حفظ سلسلة الصور المقابلة للتجارب الفردية في مجلدات ذات أسماء فريدة.

5. إعداد إعدادات الفيديو في قسم "جهاز الالتقاط" في الواجهة

1. افتح برنامج تسجيل الصور، وتحت علامة التبويب "الالتقاط"، انقر على "صور الفاصل الزمني..." وحدد كاميرا الويب المناسبة ك "جهاز الالتقاط".
2. ضع ذبابة ميتة على الجزيرة. ضبط إعدادات الفيديو عن طريق النقر على "إعدادات الفيديو" مربع. التمرير من خلال أشرطة أداة، وضبط السطوع والتباين، واللون بطريقة بحيث يطير الميت يظهر أسود على خلفيةبيضاء (الشكل 2B). عند اكتمال التعديلات، انقر فوق "موافق".

6. إعداد إعدادات التسجيل وحفظ الفيديو في قسم "الفاصل الزمني" في الواجهة

1. ضبط الإعدادات في "إعداد الفيلم الفاصل الزمني" لحفظ التجربة كملف .avi. انقر على "تصفح..."، حدد الدليل حيث سيتم تخزين الفيلم، وتحديد اسم الفيديو، واضغط على "حفظ".
   ملاحظة: لا يستخدم ملف الفيديو في تحديد كمي للبيانات؛ ومع ذلك ، قد يكون من المفيد الحصول على فكرة عامة عن التجربة.
2. ضبط الإعدادات في قسم "إعداد الفيلم الفاصل الزمني".
   1. في مربع الضغط، حدد "رمز Intel IYUV" لضغط الفيديو واختر "خذ إطارا واحدا كل 0.1 ثانية"، مع "معدل التشغيل الخلفي (الصور في الثانية):" عند 10.
   2. حفظ السلسلة الزمنية التجربة كما .bmp الإطارات بالنقر على "متقدم..." حدد "إنشاء صورة .bmp لكل إطار تم التقاطه". انقر على "تصفح". حدد نفس الدليل في إطار "أثناء التقاط الفيلم AVI" (كما تم اختياره في الخطوة 6.1) ، انقر فوق "فتح" ، ثم اضغط على "موافق".
      ملاحظة: لاحظ أنه أثناء التجربة، يتم تخزين الإطارات كملفات .bmp (مطلوبة لتحليل البيانات). يسمي البرنامج الإطارات على أنها "A" متبوعا بالرقم المقابل لتسلسل التقاط الإطار(على سبيل المثال، "A_number.bmp") (الشكل 2C). احفظ دائما الصور التي تنتمي إلى تجارب مختلفة في مجلد جديد لضمان عدم الكتابة فوق سلسلة الصور المسجلة سابقا. يجب أن تدرك أنه لا يتم حفظ الصور تلقائيا في نفس المجلد كملف الفيديو ما لم يتم تحديد هذا المجلد ضمن "استعراض..." عند النقر على مربع "متقدم".

7. جزيرة المقايسة وجمع البيانات

1. اضغط على زر البدء في واجهة الصورة الفاصل الزمني لبرنامج تسجيل الصور لبدء التسجيل.
2. اضغط على القارورة التجريبية التي تحتوي على الذباب (الخطوة 3) 2-3 مرات للتأكد من أن الذباب في الجزء السفلي من القارورة. بسرعة إزالة المكونات من قارورة و, مع حركة قوية, اضغط على قارورة على المنصة بحيث تسقط جميع الذباب على المنصة في نفس الوقت (الشكل 1C).
3. بعد ما يقرب من 30 ق، اضغط على زر "إيقاف" لوقف التسجيل.
   ملاحظة: إذا اختفت جميع الذباب من المنصة ، يمكن إيقاف التسجيل في وقت سابق.
4. قم بإزالة الذباب المتبقي لمدة 30 ثانية على المنصة باليد بعد إيقاف تسجيل الصورة.
5. قبل المتابعة لتسجيل التجربة التالية، قم بتغيير الدليل الهدف لملفات .bmp والأفلام (راجع القسم 6).

Representative Results

الشكل 1: مخطط انسيابي يحدد المتطلبات، والإجراءات التجريبية، وتحليل مقايسة الجزيرة. (أ) معدات فحص الجزيرة. (ب)الإعداد التجريبي للجزيرة المقايسة. (ج)فحص الجزيرة. (د)تجهيز بيانات فحص الجزيرة مع"Drosophila جزيرة المقايسة" الماكرو. يتكون الماكرو"Drosophila Island Assay" من 3 وحدات ماكرو فرعية: 1) جعل المكدس والإسقاط ، 2) تعريف النظام الأساسي ، و 3) التحليل. (ه)تجهيز البيانات وتقييمها إحصائيا باستخدام نص "تحليل تقييم الجزيرة". يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: أمثلة على التعديلات المختلفة المطلوبة أثناء البروتوكول. (أ)بنية الدليل المطلوبة التي يجب تخزين تجارب فحص الجزيرة فيها لمعالجة البيانات وتحليلها. (ب)عند ضبط إعدادات الفيديو، يجب أن يظهر الذباب أسود اللون على خلفية بيضاء. (ج)ملفات إخراج إطار الصورة كما تم حفظها بواسطة برنامج تسجيل الصور الموضح في هذه المخطوطة. (D) يظهر المخطط الأصفر تحديد النظام الأساسي. يتم تمييز تحديد النظام الأساسي المخزن في "إدارة عائد الاستثمار" باللون الأزرق. (ه)يتم تمثيل الذباب كنقاط بيضاء أثناء تعديل "إعداد الحد الأدنى لحجم الذبابة". تظهر نافذة النتائج مساحة الذباب بالبكسل. (F)مثال على إطار صورة مسجلة واحدة (على اليسار) والإطار المقابل في كومة الصورة الناتجة، التي تم الحصول عليها مع"Drosophila جزيرة المقايسة" الماكرو (على اليمين). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
25 x 95 mm Drosophila vials	Flystuff	32-116SB	-
Logitech C525 HD Webcam	Logitech	-	Any webcam with USB connection is suitable.
Stand to hold webcam	-	-	-
Lamp	-	-	12 V LED lights are appropriate
Pounding pad	-	-	Any mouse pad works
Island Assay box	-	-	Dimensions 40x35x2.5 cm. Hole 20x30 cm. Transparent.
Island Assay bath	-	-	Dimensions 42x38x25 cm. Non white.
Island/platform	-	-	Dimensions 42x38x25 cm. Uniform white.
Soap	-	-	Standard dishwashing detergent is suitable.
Computer	-	-	Scripts run both on Windows and Mac
Image-recording software: HandiAvi®	AZcendant®	-	HandyAvi is only compatible with Windows and has been described throughout the manuscript. It can be downloaded from: http://www.azcendant.com/DownloadHandyAvi.html (version 5.0)
Image-recording software: WebcamCapture	-	-	Fiji/ImageJ plugin that can be used on Mac alternative to HandyAvi for image-recordings and can be downloaded from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/webcam-capture/ When using this method, the user has to use the same folder setup and image-recording settings indicated in this manuscript, with the exception that for each experimental replicate, the captured image stack should be exported as Stack.tiff to the corresponding experimental replicate folder. Upon running the "Drosophila Island Assay" macro on this data, no text should be present in the "First frame identifier" setting.