德罗索菲拉梅拉诺加斯特的寿命协议： 生成生存曲线， 以识别飞行寿命的差异

Overview

科学家使用 Drosophila 寿命协议来测量不同的实验条件如何影响苍蝇的寿命，并在这个过程中产生生存曲线，以量化实验结果。样本协议的特点是应用检测来研究从接触不同浓度的内分泌干扰化学物质或EDC（如17-α乙二乙二醇（EE2）对寿命的影响。

Protocol

本协议摘自Bovier等人的摘录， 方法测试内分泌破坏在 德罗索菲拉梅拉诺加斯特 ，J.Vis.Exp.（2019 年）。

1. 食物准备

1. 对于库存维护和幼虫生长，使用含有 3% 粉末酵母、10% 蔗糖、9% 预煮玉米粉、0.4% agar 的玉米粉介质，其后称为玉米粉介质 （CM）。
   1. 将 30 克酵母放入 100 mL 的自来水中，煮沸，煮沸 15 分钟。
   2. 另外，将90克预煮玉米粉、100克糖和4克阿加混合到900mL的自来水中。
   3. 将溶液煮沸，降低热量，连续煮5分钟搅拌。
   4. 5分钟后，加入热酵母溶液，再煮15分钟。
   5. 关闭热源，让溶液冷却到约 60 °C。
   6. 在乙醇中加入5毫升/升的10%甲基4-羟基苯甲酸酯，彻底混合，让它坐10分钟。
      注： 小心甲基4-羟基苯甲酸酯的含量，因为高浓度的杀菌剂对幼虫可能致命。
   7. 将介质放入小瓶/瓶中：将介质放入每个飞瓶（25 mm x 95 mm），将 3 mL 放入每个飞瓶（22 mm x 63 mm），将 60 mL 放入每个飞瓶（250 mL）。
   8. 用奶酪布盖住小瓶，使其在储存前在室温下干燥 24 小时。
   9. 通过修改使用的 agar 量和/或冷却/干燥时间来校准 CM 的实验正确一致性和水化。
      注意： 拔下插头、盒装和包裹的瓶在 4 °C 下稳定约 15 天。
2. 对于德罗索菲拉成人，使用含有10%粉末酵母，10%蔗糖，2%agar的介质，然后称为成人介质（AM）。
   1. 将 10 克粉末酵母、10 克蔗糖、2 克 agar 混合到 100 mL 蒸馏水中。
   2. 将这种混合物煮沸两次，间隔3分钟，或使用微波炉溶解直到agar溶解。
   3. 一旦溶液冷却到 60 °C，在乙醇中加入 5 mL/L 的 10% 甲基 4-羟基苯甲酸酯，彻底混合并配以小瓶（每瓶 10 毫升）。
   4. 用奶酪布盖住小瓶，在储存前在RT干燥24小时。
      注意： 拔下插头、盒装和包裹的瓶在 4 °C 下稳定约 15 天。

2. 德罗索菲拉 EDC 多辛

1. 准备适当的库存解决方案，在适当的溶剂中溶解选定的 EDC。对于EE2（分子重量296.403），溶解1.48克10mL的100%乙醇，使0.5 M库存溶液和存储在-80°C。
   注意事项： EDC 被视为环境污染物，在处理时应采取预防措施。
2. 将 EE2 库存溶液稀释到水中 10% 乙醇（v/v），以获得 100 mM 解决方案。在CM食品中进行下一次稀释（0.1m、0.5m 和 1 mM），从最低浓度开始，并使用每个治疗组相同的溶剂最终浓度。对于控制小瓶，仅使用相同体积的溶剂。
   注意： 建议尽可能降低溶剂的最终浓度，同时注意乙醇在飞行食品中的最终浓度不应超过2%。
3. 在凝固前将含有所选 EDC 的正确稀释的溶液添加到基于玉米粉的食物中，与食品加工机彻底混合，将 10 mL 放入小瓶中，用棉纱布盖住，并在 RT 上晾干 16 小时，然后再使用。
   注意： 在准备后立即使用此介质。
4. 对于成人饲养，在水中的 10% 乙醇 （v/v） 和 100 μL 层中，在 AM 表面准备不同的 EE2 解决方案（分别为 10 mM、50 mM 和 100 mM），以获得 EE2（0.1 mM、0.5 mM 和 1 mM）的预期浓度。对于控制，仅使用相同体积的溶剂。
   注： 或者，将包含所选 EDC 正确稀释的溶液添加到 50 mL 圆锥管中的少量 AM 中，彻底漩涡，并将其中 1 mL 分层到 AM 小瓶表面。
   1. 用棉纱盖住小瓶，在轻柔的搅拌下在RT干燥12-16小时，并立即使用。
      注意： 干燥过程应进行实验性调整，因为取决于环境湿度。

3. 饲养苍蝇

1. 使用强大的同源菌株，如俄勒冈R，由几代在实验室中维护。
2. 将苍蝇保存在潮湿、温度控制的孵化器中，具有自然的 12 h 光：在含有 CM 食物的瓶中，在 25 °C 的 25 °C 下保持 12 h 的暗光。
3. 在每次检测中，在 RT 中使用小瓶。

4. 寿命议定书

1. 设置 20 瓶苍蝇与 8 个女性和 4 个雄性和房子在 25 °C 在 CM （每个 10 mL）.
2. 4天后丢弃苍蝇，将小瓶放回孵化器中。
   注意： 这些苍蝇可以用来重新开始，以获得其他年龄同步的苍蝇群。
3. 在9日傍晚，从小瓶中取出所有新关闭的苍蝇，并将小瓶返回孵化器。
   注意： 一些成年人应该早在第九天就开始关闭：丢弃这些苍蝇可以收集最多数量的同步苍蝇，避免粗心选择早期紧急。
4. 16-24小时后，将两性成年苍蝇（1天大）转移到四组250 mL瓶中，其中含有AM食物，辅以三种不同的EDC浓度，一组仅含溶剂。如果需要，第二天再收集一批。
5. 将苍蝇保持在 25 °C 的 2-3 天，以便它们交配。
   注： 转入 AM 食品瓶的当天与成年后的第一天相对应。
6. 两三天后，在轻CO₂ 麻醉下，按性别将每组苍蝇分成两组。随机将每个性别细分为五个小瓶，每次治疗密度为每小瓶20人，直到每个治疗每种性别有3个5个平行小瓶的复制品。
   注： 与小群苍蝇合作，以防止由于长时间_{接触二氧化碳}而可能长期出现的健康问题。
7. 准备一个寿命电子表格，其中死苍蝇的数量从幸存苍蝇的数量减去到以前的转移，以便自动获得每次转移的幸存者人数。
8. 转移苍蝇进入新的小瓶含有相应的食物，每3天在同一时间，并检查死亡。
   注： 转移必须进行，没有麻醉，可能会对飞行寿命产生长期负面影响。
   1. 每次转移时，记录苍蝇的年龄和死苍蝇的数量。
      注意： 幸存苍蝇的数量在电子表格中自动计算，但建议直观地检查。不应考虑在转移过程中意外逃跑或死亡的苍蝇。小心不要数两次死苍蝇携带到新的小瓶报告此说明在电子表格中。
   2. 重复步骤 4.8 和 4.8.1，直到所有苍蝇死亡。
9. 对于每个治疗组，创建 图 1中所示的生存曲线，以便在任何特定时间显示苍蝇的生存概率。
10. 每个实验使用100只新封闭的苍蝇，为每组苍蝇进行三次独立的实验。
11. 准备一张表格，报告平均寿命（每组苍蝇的平均生存天数）、一半死亡时间（达到 50% 死亡率所需的天数）和最大寿命（达到 90% 死亡率所需的最大天数）。
12. 计算每个治疗组与对照组之间的百分比差异。
13. 执行统计分析以比较不同的治疗组。

Representative Results

图1：寿命曲线。 在左边，报告了一个代表表，其中每3天记录一次死苍蝇的数量，包括治疗组（中等+EDC[0.05 mM EE2]）和对照组（中等+溶剂），整个实验期间。使用 MATRIX SUM 计算了每个组的平均寿命 。产品：与对照组相比，治疗组缩短了平均寿命。在右边，典型的生存曲线显示雄性苍蝇喂养含有EE2（0.05 mM）或只有乙醇的中等控制。与对照组相比，经过处理的苍蝇的存活曲线下降得更快，下降点较早。 请单击此处查看此图的更大版本。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
17α-Ethinylestradiol	Sigma	E4876-1G
Agar for Drosophila medium	BIOSIGMA	789148
Cornmeal	CA' BIANCA
Drosophila Vials	BIOSIGMA	789008	25 mm x 95 mm
Drosophila Vials	BIOSIGMA	789009	29 mm x 95 mm
Drosophila Vials	Kaltek	187	22 mm x 63 mm
Ethanol	FLUKA	2860
Glass Bottle			250 mL Bottles
Glass Vials	Microtech	ST 10024	Flat bottom tube 100 x 24
Instant Success yeast	ESKA		Powdered yeast
Methyl4-hydroxybenzoate	SIGMA	H5501
Stereomicroscope with LED lights	Leica		S4E
Sucrose	HIMEDIA	MB025
Hand blender Pimmy	Ariete		food processor