Protocolo de vida para Drosophila melanogaster: Gerando Curvas de Sobrevivência para identificar diferenças na longevidade da mosca

Overview

Os cientistas usam o protocolo de vida de Drosophila para medir como diferentes condições experimentais afetam a longevidade das moscas e geram curvas de sobrevivência no processo para quantificar os resultados experimentais. O protocolo amostral apresenta o ensaio que está sendo aplicado para estudar os efeitos sobre a longevidade desde a exposição a concentrações variadas de produtos químicos disruptores endócrinos, ou EDCs, como 17-α-ethinylestradiol (EE2).

Protocol

Este protocolo é um trecho de Bovier et al., Métodos para Testar a Interrupção Endócrina em Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2019).

1. Preparação de alimentos

1. Para manutenção do estoque e para crescimento larval, utilize um meio de fubá contendo 3% de levedura em pó, 10% sacarose, 9% de fubá pré-cozido, 0,4% ágar, posteriormente chamado de meio de fubá (CM).
   1. Coloque 30 g de levedura em 100 mL de água da torneira, deixe ferver e deixe ferver por 15 minutos.
   2. Separadamente, misture bem 90 g de farinha de milho pré-cozida, 100 g de açúcar e 4 g de ágar em 900 mL de água da torneira.
   3. Leve a solução para ferver, abaixe o fogo e cozinhe por 5 minutos mexendo continuamente.
   4. Depois de 5 minutos, adicione a solução de levedura quente e deixe ferver por mais 15 minutos.
   5. Desligue a fonte de calor e deixe a solução esfriar a cerca de 60 °C.
   6. Adicione 5 mL/L de 10% de metila 4-hidroxibenzoato no etanol, misture bem e deixe descansar por 10 minutos.
      NOTA: Tenha cuidado com a quantidade de metila 4-hidroxibenzoato, dado que uma alta concentração de fungicida pode ser letal para larvas.
   7. Distribua o meio em frascos/garrafas: 8 mL em cada frasco de mosca (25 mm x 95 mm), 3 mL em cada frasco de mosca (22 mm x 63 mm) e 60 mL em cada garrafa de mosca (250 mL).
   8. Cubra frascos com pano de queijo e deixe-os secar à temperatura ambiente (RT) por 24 horas antes do armazenamento.
   9. Calibrar a consistência e hidratação experimentalmente corretas do CM modificando a quantidade de ágar utilizado e/ou os tempos de resfriamento/secagem.
      NOTA: os frascos desconectados, encaixotados e embrulhados ficam estáveis por cerca de 15 dias a 4 °C.
2. Para adultos Drosophila, utilize um meio contendo levedura 10% em pó, 10% sacarose, 2% ágar, posteriormente chamado de meio adulto (AM).
   1. Misture 10 g de levedura em pó, 10 g de sacarose, 2 g de ágar em 100 mL de água destilada.
   2. Leve essa mistura para ferver duas vezes, com um intervalo de 3 minutos, ou até que o ágar seja dissolvido, usando um micro-ondas.
   3. Uma vez que a solução esfrie a 60 °C, adicione 5 mL/L de 10% de metila 4-hidroxibenzoato no etanol, misture bem e dispense em frascos (10 mL por frasco).
   4. Cubra frascos com pano de queijo e deixe-os secar no RT por 24 horas antes de armazenar.
      NOTA: os frascos desconectados, encaixotados e embrulhados ficam estáveis por cerca de 15 dias a 4 °C.

2. Dosagem EDC Drosophila

1. Prepare uma solução de estoque adequada dissolvendo o EDC selecionado no solvente adequado. Para o EE2 (peso molecular 296.403), dissolva 1,48 g em 10 mL de 100% etanol para fazer uma solução de estoque de 0,5 M e armazenar a -80 °C.
   ATENÇÃO: Os EDCs são considerados poluentes ambientais e devem ser tomadas precauções para manuseá-los.
2. Diluir a solução de estoque EE2 em 10% de etanol em água (v/v) a fim de obter uma solução de 100 mM. Faça as próximas diluições (0,1 mM, 0,5 mM e 1 mM) em alimentos CM, começando com menor concentração e utilizando a mesma concentração final de solvente para cada grupo de tratamento. Para os frascos de controle use o mesmo volume do solvente sozinho.
   NOTA: recomenda-se manter a concentração final do solvente o mais baixa possível, tendo em vista que a concentração final de etanol não deve exceder 2% em alimentos de mosca.
3. Adicione a solução contendo a diluição correta do EDC selecionado ao alimento à base de farinha de milho antes da solidificação, misture bem com um processador de alimentos, distribua 10 mL em frascos, cubra com gaze de algodão e deixe secar na RT por 16 h antes de usar.
   NOTA: use este meio imediatamente após sua preparação.
4. Para a criação adulta, prepare diferentes soluções EE2 de trabalho (10 mM, 50 mM e 100 mM, respectivamente) em 10% de etanol em água (v/v) e camada 100 μL de cada uma na superfície do AM, a fim de obter a concentração desejada do EE2 (0,1 mM, 0,5 mM e 1 mM). Para o controle use o mesmo volume do solvente sozinho.
   NOTA: alternativamente, adicione a solução contendo a diluição correta do EDC selecionado a uma pequena quantidade de AM em um tubo cônico de 50 mL, vórtice completamente e estratificação 1 mL dele sobre a superfície dos frascos AM.
   1. Cubra frascos com gaze de algodão, deixe secar em RT por 12-16 h sob agitação suave e use-os imediatamente.
      NOTA: o processo de secagem deve ser ajustado experimentalmente porque depende da umidade ambiente.

3. Moscas de criação

1. Use uma cepa isogênica robusta, como oregon r, mantida por várias gerações em laboratório.
2. Mantenha as moscas em uma incubadora umidificada e controlada pela temperatura, com uma luz natural de 12 h: 12 h fotoperíodo escuro a 25 °C em frascos contendo alimentos CM.
3. Em cada ensaio, use frascos na RT.

4. Protocolo lifespan

1. Montou 20 frascos de moscas com 8 fêmeas e 4 machos e casa a 25 °C em CM (10 mL cada).
2. Depois de 4 dias descarte moscas e coloque frascos de volta na incubadora.
   NOTA: estas moscas podem ser usadas para começar novamente para obter outras coortes sincronizadas por idade das moscas.
3. No final da tarde do dia 9, remova todas as moscas recém-eclodidas dos frascos e devolva frascos para a incubadora.
   NOTA: alguns adultos devem começar a se escoar já no nono dia; descartar essas moscas permite coletar um número máximo de moscas sincronizadas, evitando a seleção descuidada de emergentes precoces.
4. 16-24 h depois, transfira as moscas adultas (1 dia de idade) de ambos os sexos para quatro grupos de garrafas de 250 mL contendo alimentos AM complementados com três concentrações diferentes de EDC e um com o solvente sozinho. Se necessário, recolha outro lote no dia seguinte.
5. Mantenha as moscas a 25 °C por 2-3 dias para permitir que elas acasalem.
   NOTA: o dia da transferência para os frascos de alimentos am corresponde ao primeiro dia da vida adulta.
6. Depois de dois ou três dias, classifique cada coorte de moscas por sexo em dois grupos sob leve anestesia de CO_2. Subdividir aleatoriamente cada sexo em cinco frascos por tratamento a uma densidade de 20 indivíduos por frasco, até que haja três réplicas de 5 frascos paralelos para cada sexo por cada tratamento.
   NOTA: Trabalhe com pequenos grupos de moscas a fim de prevenir possíveis problemas de saúde duradouros devido ao longo tempo de exposição ao CO₂.
7. Prepare uma planilha de vida útil na qual o número de moscas mortas é subtraído do número de moscas sobreviventes para a transferência anterior, de forma a obter automaticamente o número de sobreviventes em cada transferência.
8. A transferência voa para novos frascos contendo a comida correspondente a cada 3 dias ao mesmo tempo e verifique se há morte.
   NOTA: a transferência deve ocorrer sem anestesia que possa ter um efeito negativo a longo prazo sobre a longevidade da mosca.
   1. A cada transferência, registo a idade das moscas e o número de moscas mortas.
      NOTA: o número de moscas sobreviventes é calculado automaticamente na planilha, mas é recomendável verificar visualmente. Moscas que acidentalmente escapam ou morrem durante a transferência não devem ser consideradas. Tenha cuidado para não contar duas moscas mortas levadas para o novo frasco relatando esta nota na planilha.
   2. Repita os passos 4.8 e 4.8.1 até que todas as moscas morram.
9. Para cada grupo de tratamento, crie uma curva de sobrevivência como mostrado na Figura 1,a fim de mostrar a probabilidade de sobrevivência de uma mosca em qualquer momento específico.
10. Realize três experimentos independentes para cada grupo de tratamento de moscas, usando 100 moscas recém-eclosadas para cada experimento.
11. Prepare uma tabela para relatar a expectativa de vida média (dias médios de sobrevivência de todas as moscas para cada grupo), o tempo de meia morte (período de tempo em dias necessários para atingir 50% de mortalidade) e a vida máxima (quantidade máxima de dias necessários para atingir 90% de mortalidade).
12. Calcule as diferenças percentuais entre cada grupo de tratamento em relação ao grupo controle.
13. Realizar análise estatística para comparar os diferentes grupos de tratamento.

Representative Results

Figura 1: Curvas de vida útil. À esquerda, é relatada uma tabela representativa na qual o número de moscas mortas tem sido registrado a cada 3 dias, tanto para o grupo de tratamento (médio + EDC [0,05 mM EE2]) quanto para o grupo controle (médio + solvente), durante todo o período experimental. A expectativa de vida média de cada grupo foi calculada utilizando-se a SOMA MATRIX. PRODUTO; o grupo tratado encurtou a expectativa de vida média em relação ao grupo controle. À direita, uma curva de sobrevivência típica é mostrada de moscas machos alimentadas com média contendo EE2 (0,05 mM) ou apenas etanol para o controle. A curva de sobrevivência diminuiu mais rapidamente para moscas tratadas do que para o grupo controle, com um ponto de queda de virada mais cedo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
17α-Ethinylestradiol	Sigma	E4876-1G
Agar for Drosophila medium	BIOSIGMA	789148
Cornmeal	CA' BIANCA
Drosophila Vials	BIOSIGMA	789008	25 mm x 95 mm
Drosophila Vials	BIOSIGMA	789009	29 mm x 95 mm
Drosophila Vials	Kaltek	187	22 mm x 63 mm
Ethanol	FLUKA	2860
Glass Bottle			250 mL Bottles
Glass Vials	Microtech	ST 10024	Flat bottom tube 100 x 24
Instant Success yeast	ESKA		Powdered yeast
Methyl4-hydroxybenzoate	SIGMA	H5501
Stereomicroscope with LED lights	Leica		S4E
Sucrose	HIMEDIA	MB025
Hand blender Pimmy	Ariete		food processor