Levensduurprotocol voor Drosophila melanogaster:overlevingscurven genereren om verschillen in vlieglevensduur te identificeren

Overview

Wetenschappers gebruiken het Drosophila-levensduurprotocol om te meten hoe verschillende experimentele omstandigheden de levensduur van vliegen beïnvloeden en daarbij overlevingscurven te genereren om de experimentele resultaten te kwantificeren. Het monsterprotocol bevat de test die wordt toegepast om de effecten op de levensduur van blootstelling aan verschillende concentraties hormoonontregelende chemicaliën of EDC's, zoals 17-α-ethinylestradiol (EE2) te bestuderen.

Protocol

Dit protocol is een fragment uit Bovier et al., Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2019).

1. Voedselbereiding

1. Gebruik voor voorraadonderhoud en voor larvale groei een maïsmeelmedium dat 3% poedergist, 10% sacharose, 9% voorgekookt maïsmeel, 0,4% agar, daarna Cornmeal medium (CM) wordt genoemd.
   1. Doe 30 g gist in 100 ml kraanwater, breng het aan de kook en laat het 15 minuten koken.
   2. Meng afzonderlijk goed 90 g voorgekookt maïsmeel, 100 g suiker en 4 g agar in 900 ml leidingwater.
   3. Breng de oplossing aan de kook, zet het vuur lager en kook 5 minuten onafgebroken.
   4. Voeg na 5 minuten de hete gistoplossing toe en laat nog 15 minuten sudderen.
   5. Schakel de warmtebron uit en laat de oplossing afkoelen tot ongeveer 60 °C.
   6. Voeg 5 ml/l 10% methyl 4-hydroxybenzoaat toe aan ethanol, meng grondig en laat het 10 minuten zitten.
      OPMERKING: Wees voorzichtig met de hoeveelheid methyl 4-hydroxybenzoaat, gezien het feit dat een hoge concentratie fungicide dodelijk kan zijn voor larven.
   7. Verdeel het medium in flacons/flessen: 8 ml in elke vliegflacon (25 mm x 95 mm), 3 ml in elke vliegflacon (22 mm x 63 mm) en 60 ml in elke vliegfles (250 mL).
   8. Dek flacons af met kaasdoek en laat ze 24 uur drogen bij kamertemperatuur (RT) voordat u ze bewaart.
   9. Kalibreer experimenteel de juiste consistentie en hydratatie van de CM door de gebruikte hoeveelheid agar en/of de koel-/droogtijden te wijzigen.
      OPMERKING: niet-aangesloten, verpakte en verpakte flacons zijn ongeveer 15 dagen stabiel bij 4 °C.
2. Gebruik voor Drosophila-volwassenen een medium dat 10% poedergist, 10% sacharose, 2% agar, daarna volwassen medium (AM) wordt genoemd.
   1. Meng 10 g gepoederde gist, 10 g sacharose, 2 g agar in 100 ml gedestilleerd water.
   2. Breng dit mengsel twee keer aan de kook, met een interval van 3 minuten, of totdat agar is opgelost, met behulp van een magnetron.
   3. Zodra de oplossing is afgekoeld tot 60 °C, voegt u 5 ml/l methyl 4-hydroxybenzoaat toe aan ethanol, mengt u grondig en doseert u het in flacons (10 ml per flacon).
   4. Dek de flacons af met kaasdoek en laat ze 24 uur drogen bij RT voordat je ze opbergt.
      OPMERKING: niet-aangesloten, verpakte en verpakte flacons zijn ongeveer 15 dagen stabiel bij 4 °C.

2. Drosophila EDC Dosering

1. Bereid een geschikte stamoplossing voor die de geselecteerde EDC oplost in het geschikte oplosmiddel. Los voor de EE2 (molecuulgewicht 296.403) 1,48 g op in 10 ml 100% ethanol om een voorraadoplossing van 0,5 M te maken en op te slaan bij -80 °C.
   LET OP: EDC's worden beschouwd als milieuverontreinigende stoffen en er moeten voorzorgsmaatregelen worden genomen bij de behandeling ervan.
2. Verdun de EE2-stamoplossing in 10% ethanol in water (v/v) om een oplossing van 100 mM te verkrijgen. Maak de volgende verdunningen (0,1 mM, 0,5 mM en 1 mM) in CM-voedsel, te beginnen met de laagste concentratie en met dezelfde eindconcentratie oplosmiddel voor elke behandelingsgroep. Gebruik voor de controleflacons hetzelfde volume van het oplosmiddel alleen.
   OPMERKING: het wordt aanbevolen om de uiteindelijke concentratie van het oplosmiddel zo laag mogelijk te houden, rekening houdend met het feit dat de uiteindelijke concentratie ethanol niet hoger mag zijn dan 2% in vliegvoer.
3. Voeg de oplossing met de juiste verdunning van de geselecteerde EDC toe aan het voedsel op basis van maïsmeel vóór de stolling, meng grondig met een keukenmachine, verdeel 10 ml in flacons, dek af met katoenen gaas en laat 16 uur drogen bij RT voordat u het gebruikt.
   OPMERKING: gebruik dit medium onmiddellijk na de bereiding.
4. Bereid voor de volwassen opfok verschillende werkende EE2-oplossingen (respectievelijk 10 mM, 50 mM en 100 mM) in 10% ethanol in water (v/v) en laag 100 μL van elk op het oppervlak van de AM, om de gewenste concentratie van de EE2 (0,1 mM, 0,5 mM en 1 mM) te verkrijgen. Gebruik voor de besturing hetzelfde volume van het oplosmiddel alleen.
   OPMERKING: als alternatief voegt u de oplossing met de juiste verdunning van de geselecteerde EDC toe aan een kleine hoeveelheid AM in een conische buis van 50 ml, vortex grondig en stratificeer u er 1 ml van op het oppervlak van de AM-flacons.
   1. Bedek flacons met katoenen gaas, laat 12-16 uur drogen bij RT onder zachte agitatie en gebruik ze onmiddellijk.
      OPMERKING: het droogproces moet experimenteel worden aangepast, omdat dit afhankelijk is van de omgevingsvochtigheid.

3. Opfokvliegen

1. Gebruik een robuuste isogene stam, zoals Oregon R, die door meerdere generaties in het laboratorium wordt onderhouden.
2. Bewaar vliegen in een bevochtigde, temperatuurgecontroleerde incubator, met een natuurlijk licht van 12 uur: 12 uur donkere fotoperiode bij 25 °C in flacons met CM-voedsel.
3. Gebruik bij elke test flacons bij RT.

4. Levensduur Protocol

1. Zet 20 flesjes vliegen op met 8 vrouwtjes en 4 mannetjes en huisvest bij 25 °C in CM (elk 10 ml).
2. Gooi na 4 dagen vliegen weg en plaats flesjes terug in de incubator.
   OPMERKING: deze vliegen kunnen worden gebruikt om opnieuw te beginnen om andere leeftijdssynchrone cohorten van de vliegen te verkrijgen.
3. In de late namiddag van dag 9, verwijder alle nieuw eclosed vliegen uit de flacons en breng flacons terug naar de incubator.
   OPMERKING: een paar volwassenen moeten al op de negende dag beginnen te sluiten; het weggooien van deze vliegen maakt het mogelijk om een maximaal aantal gesynchroniseerde vliegen te verzamelen, waardoor de onzorgvuldige selectie van vroege emergenten wordt vermeden.
4. 16-24 uur later, breng de volwassen vliegen (1 dag oud) van beide geslachten over in vier groepen van 250 ml flessen met AM-voedsel aangevuld met drie verschillende EDC-concentraties en één met het oplosmiddel alleen. Haal indien nodig de volgende dag nog een batch op.
5. Houd vliegen 2-3 dagen op 25 °C om ze te laten paren.
   OPMERKING: de dag van overdracht naar AM-voedselflacons komt overeen met de eerste dag van volwassenheid.
6. Sorteer na twee-drie dagen elk cohort vliegen op geslacht in twee groepen onder lichte CO 2-anesthesie. Verdeel elk geslacht willekeurig in vijf flacons per behandeling met een dichtheid van 20 personen per flacon, totdat er drie replica's zijn van 5 parallelle flacons voor elk geslacht per behandeling.
   OPMERKING: Werk met kleine groepen vliegen om mogelijke langdurige gezondheidsproblemen als gevolg van lange blootstellingstijd aan CO₂te voorkomen .
7. Maak een levensduur spreadsheet waarin het aantal dode vliegen wordt afgetrokken van het aantal overlevende vliegen naar de vorige overdracht, op een zodanige manier dat automatisch het aantal overlevenden bij elke overdracht wordt verkregen.
8. Breng vliegen om de 3 dagen tegelijkertijd over in nieuwe flacons met het bijbehorende voedsel en controleer op overlijden.
   OPMERKING: de overdracht moet plaatsvinden zonder anesthesie die op lange termijn een negatief effect kan hebben op de levensduur van de vlieg.
   1. Noteer bij elke overdracht de leeftijd van de vliegen en het aantal dode vliegen.
      OPMERKING: het aantal overlevende vliegen wordt automatisch berekend in de spreadsheet, maar het wordt aanbevolen om het visueel te controleren. Vliegen die per ongeluk ontsnappen of sterven tijdens de overdracht moeten niet worden overwogen. Zorg ervoor dat u geen twee dode vliegen telt die naar de nieuwe flacon worden vervoerd en deze notitie in de spreadsheet rapporteren.
   2. Herhaal stap 4.8 en 4.8.1 totdat alle vliegen afsterven.
9. Maak voor elke behandelingsgroep een overlevingscurve zoals weergegeven in figuur 1, om de overlevingskans van een vlieg op een bepaald moment weer te geven.
10. Voer drie onafhankelijke experimenten uit voor elke behandelingsgroep vliegen, door 100 nieuw geëxeverliesde vliegen voor elk experiment te gebruiken.
11. Maak een tabel waarin de gemiddelde levensduur (gemiddelde overlevingsdagen van alle vliegen voor elke groep), de halve sterftetijd (periode in dagen die nodig zijn om 50% sterfte te bereiken) en de maximale levensduur (maximaal aantal dagen nodig om 90% sterfte te bereiken) wordt gemeld.
12. Bereken de verschillen in percentage tussen elke behandelingsgroep met betrekking tot de controlegroep.
13. Statistische analyse uitvoeren om de verschillende behandelingsgroepen te vergelijken.

Representative Results

Figuur 1: Levensduurcurves. Aan de linkerkant wordt een representatieve tabel gerapporteerd waarin het aantal dode vliegen om de 3 dagen is geregistreerd, zowel voor de behandelingsgroep (medium + EDC [0,05 mM EE2]) als voor de controlegroep (medium + oplosmiddel), gedurende de gehele experimentele periode. De gemiddelde levensduur van elke groep is berekend met behulp van de MATRIX SUM. PRODUCT; de behandelde groep verkortte de gemiddelde levensduur in vergelijking met de controlegroep. Aan de rechterkant wordt een typische overlevingscurve getoond van mannelijke vliegen die worden gevoed met een medium dat EE2 (0,05 mM) bevat of alleen ethanol voor de controle. De overlevingscurve daalde sneller voor behandelde vliegen dan voor de controlegroep, met een eerder keerpunt. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
17α-Ethinylestradiol	Sigma	E4876-1G
Agar for Drosophila medium	BIOSIGMA	789148
Cornmeal	CA' BIANCA
Drosophila Vials	BIOSIGMA	789008	25 mm x 95 mm
Drosophila Vials	BIOSIGMA	789009	29 mm x 95 mm
Drosophila Vials	Kaltek	187	22 mm x 63 mm
Ethanol	FLUKA	2860
Glass Bottle			250 mL Bottles
Glass Vials	Microtech	ST 10024	Flat bottom tube 100 x 24
Instant Success yeast	ESKA		Powdered yeast
Methyl4-hydroxybenzoate	SIGMA	H5501
Stereomicroscope with LED lights	Leica		S4E
Sucrose	HIMEDIA	MB025
Hand blender Pimmy	Ariete		food processor