ショ ウジョウバエメラノガスターの寿命プロトコル : 生存曲線を生成して、フライ長寿の違いを特定する

Overview

科学者たちは 、ショウジョウバエ の寿命プロトコルを使用して、異なる実験条件がハエの長寿にどのような影響を与えるかを測定し、実験結果を定量化する過程で生存曲線を生成します。サンプルプロトコルは、17-α-エチニルエストラジオール(EE2)などの内分泌破壊物質化学物質、またはEDCの様々な濃度への暴露からの長寿への影響を研究するために適用されるアッセイを特徴としています。

Protocol

このプロトコルは、ショウジョウバエメラノガスター、J.Vis.Exp.(2019)における内分泌破壊を試験する方法であるBovierらからの抜粋である。 

1. 食品の準備

1. 在庫維持および幼虫の成長のために、3%粉末酵母、10%スクロース、9%予め調理されたコーンミール、0.4%寒天、その後コーンミール培地(CM)を含むコーンミール培地を使用してください。
   1. 30gの酵母を水道水100mLに入れ、沸騰させ、15分間沸騰させます。
   2. 別に、調理済みのコーンミール90g、砂糖100g、寒天4gを900mLの水道水に混ぜます。
   3. 溶液を沸騰させ、火を弱め、連続的にかき混ぜて5分間煮ます。
   4. 5分後、ホットイースト溶液を加え、さらに15分間煮ます。
   5. 熱源をオフにし、溶液を約60°Cに冷却させます。
   6. 5 mL/Lのメチル4-ヒドロキシ安息香酸をエタノールに加え、十分に混ぜて10分間座らせます。
      注: 高濃度の殺菌剤が幼虫にとって致死的である可能性があることを考えると、メチル4-ヒドロキシ安息香酸メチルの量に注意してください。
   7. ミディアムをバイアル/ボトルに分配する:各フライバイアル(25mm x 95 mm)に8mL、各フライバイアル(22mm x 63 mm)に3mL、各フライボトル(250 mL)に60 mL。
   8. バイアルにチーズクロスを覆い、保管する前に室温(RT)で24時間乾燥させます。
   9. 使用される寒天の量および/または冷却/乾燥時間を変更することによって、CMの実験的に正しい一貫性と水分補給を較正します。
      注意: 取り外し、箱入り、ラップされたバイアルは、4°Cで約15日間安定しています。
2. ショウジョウバエ成人の場合、10%粉末酵母、10%スクロース、2%寒天、その後成人培地(AM)を含む培地を使用する。
   1. 粉末酵母10g、スクロース10g、寒天2gを100mLの蒸留水に混ぜます。
   2. この混合物を電子レンジで3分間隔、または寒天が溶けるまで2回沸騰させます。
   3. 溶液が60°Cに冷却されたら、エタノールに10%メチル4-ヒドロキシ安息香酸の5 mL/Lを加え、十分に混合し、バイアル(バイアルあたり10 mL)で分配します。
   4. バイアルにチーズクロスをかぶり、RTで24時間乾燥させてから保管します。
      注意: 取り外し、箱入り、ラップされたバイアルは、4°Cで約15日間安定しています。

2. ショウジョウバエ EDC のドージング

1. 選択したEDCを適切な溶媒に溶解する適切なストック溶液を調製する。EE2(分子量296.403)の場合、10mLの100%エタノールに1.48gを溶解し、0.5Mストック溶液を作り、-80°Cで保存します。
   注意: EDCは環境汚染物質とみなされ、それらを処理する際に予防措置を講じる必要があります。
2. 100 mM溶液を得るために、EE2ストック溶液を水中の10%エタノール(v/v)で希釈します。次の希釈液(0.1 mM、0.5 mM、1 mM)をCM食品で、最低濃度から始めて、各処理群に対して同じ最終濃度の溶媒を使用します。制御バイアルのために単独で溶媒の同じ体積を使用します。
   注: エタノールの最終的な濃度がフライ食品で2%を超えてはならないことを念頭に置いて、溶媒の最終濃度をできるだけ低くしておくことをお勧めします。
3. 選択したEDCの右希釈液を含む溶液を固化前にコーンミールベースの食品に加え、フードプロセッサーと十分に混ぜ合わせ、バイアルに10mLを分配し、綿ガーゼで覆い、RTで16時間乾燥してから使用します。
   注: この媒体は、準備の直後に使用してください。
4. 成体飼育のために、異なる働くEE2溶液(それぞれ10mM、50mMおよび100 mM)を水中の10%エタノール(v/v)および層100μLでAMの表面に準備し、EE2の所望の濃度(0.1mM、0.5mMおよび1mM)を得る。制御のためには、単独で同じ体積の溶媒を使用する。
   注: または、選択したEDCの右希釈液を含む溶液を50 mL円錐管内の少量のAMに加え、渦を徹底的に加え、その1mLをAMバイアルの表面に層状にします。
   1. 綿ガーゼでバイアルを覆い、穏やかな攪拌の下で12〜16時間RTで乾燥させ、すぐにそれらを使用してください。
      注: 乾燥プロセスは、周囲の湿度に依存するため、実験的に調整する必要があります。

3. ハエの飼育

1. オレゴンRのような堅牢な同一性株を使用し、実験室で数世代によって維持される。
2. CM食品を含むバイアルで25°Cで12時間暗光周期:湿気のある温度制御インキュベーターにハエを保ちます。
3. 各アッセイでは、RTでバイアルを使用してください。

4. ライフスパンプロトコル

1. 25°CのCM(各10 mL)で8人の女性と4人の男性と家とハエの20バイアルを設定します。
2. 4日後にハエを捨て、バイアルをインキュベーターに戻します。
   注: これらのハエは、ハエの他の年齢同期コホートを取得するために再び開始するために使用することができます。
3. 9日目の午後遅く、バイアルから新しく閉じたハエをすべて取り除き、バイアルをインキュベーターに戻します。
   注: 数人の大人は早くも9日目に閉鎖を開始する必要があります。これらのハエを廃棄すると、早期の緊急の不注意な選択を避け、同期ハエの最大数を収集することができます。
4. 16-24時間後、両性の成体ハエ(1日齢)を、3つの異なるEDC濃度と溶媒だけで補ったAM食品を含む250mLボトルの4つのグループに移す。必要に応じて、次の日に別のバッチを収集します。
5. ハエを2〜3日間25°Cで維持し、交尾できるようにします。
   注:AM フードバイアルへの転送日は、成人の初日に対応しています。
6. 2〜3日後、ハエの各コホートを軽い_CO2 麻酔下の2つのグループに2つのグループに分類する。各性別を1回のバイアルあたり20個の密度で、各性別を無作為に5つのバイアルに細分化し、各治療ごとに性別ごとに5つの平行バイアルの複製があるまで。
   注:CO2への長時間の暴露による健康問題の可能性を防ぐために、ハエの小さなグループと協力してください。
7. 死んだハエの数を生き残ったハエの数から以前の転送に差し引く寿命スプレッドシートを準備し、各転送時に生存者の数を自動的に取得します。
8. 移動ハエは、同時に3日ごとに対応する食品を含む新しいバイアルにハエを転送し、死亡をチェックします。
   注: 転送は、飛行の長寿に長期的な悪影響を及ぼす可能性のある麻酔なしで行われなければなりません。
   1. 各転送時に、ハエの年齢と死んだハエの数を記録します。
      注: 残ったハエの数はスプレッドシートで自動的に計算されますが、視覚的に確認することをお勧めします。誤って脱出または転送中に死ぬハエは考慮されるべきではありません。スプレッドシートでこのメモを報告する新しいバイアルに運ばれた死んだハエを2回数えないように注意してください。
   2. すべてのハエが死ぬまで、ステップ4.8と4.8.1を繰り返します。
9. 各治療群について、特定の時点でのハエの生存確率を表示するために 、図1に示すように生存曲線を作成する。
10. 各実験に100個の新たに閉じたハエを使用して、ハエの各治療群に対して3つの独立した実験を行う。
11. 平均寿命(各グループのすべてのハエの生存日数の平均)、半死時間(死亡率50%に達するために必要な日数)、最大寿命(死亡率90%に達するために必要な最大日数)を報告するテーブルを用意します。
12. 対照群に対する各治療群間の割合の差を算出する。
13. 統計分析を実行して、異なる処理グループを比較します。

Representative Results

図1:寿命曲線 左側には、試験期間全体を通して、治療群(培地+EDC[0.05 mM EE2])と対照群(培地+溶媒)の両方について、死んだハエの数が3日ごとに記録されている代表的な表が報告されている。各グループの平均寿命は、MATRIX SUMを使用して計算されています 。製品;治療されたグループは、対照群と比較して平均寿命を短縮した。右側には、典型的な生存曲線は、EE2(0.05 mM)またはコントロールのためのエタノールのみを含む培地を供給する雄のハエの典型的な生存曲線を示しています。生存曲線は、コントロールグループよりも治療されたハエの方が急速に減少し、以前の転換点となった。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
17α-Ethinylestradiol	Sigma	E4876-1G
Agar for Drosophila medium	BIOSIGMA	789148
Cornmeal	CA' BIANCA
Drosophila Vials	BIOSIGMA	789008	25 mm x 95 mm
Drosophila Vials	BIOSIGMA	789009	29 mm x 95 mm
Drosophila Vials	Kaltek	187	22 mm x 63 mm
Ethanol	FLUKA	2860
Glass Bottle			250 mL Bottles
Glass Vials	Microtech	ST 10024	Flat bottom tube 100 x 24
Instant Success yeast	ESKA		Powdered yeast
Methyl4-hydroxybenzoate	SIGMA	H5501
Stereomicroscope with LED lights	Leica		S4E
Sucrose	HIMEDIA	MB025
Hand blender Pimmy	Ariete		food processor