פרוטוקול תוחלת חיים עבור drosophila מלנוגאסטר: יצירת עקומות הישרדות כדי לזהות הבדלים אריכות ימים לטוס

Overview

מדענים משתמשים בפרוטוקול תוחלת החיים של דרוזופילה כדי למדוד כיצד תנאי ניסוי שונים משפיעים על תוחלת החיים של זבובים וליצור עקומות הישרדות בתהליך כדי לכמת את התוצאות הניסיוניות. פרוטוקול המדגם כולל את ההסתעפות המיושמת כדי לחקור את ההשפעות על אריכות ימים מחשיפה לריכוזים שונים של כימיקלים משבשים אנדוקריניים, או EDCs, כגון 17-α-ethinylestradiol (EE2).

Protocol

פרוטוקול זה הוא קטע מתוך Bovier ואח ', שיטות לבדיקת הפרעה אנדוקרינית ב Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2019).

1. הכנת מזון

1. לתחזוקת מלאי ולצמיחת זחל, השתמשו במדיום קמח תירס המכיל 3% אבקת שמרים, 10% סוכרוז, 9% קמח תירס מבושל מראש, 0.4% אגר, ולאחר מכן נקרא בינוני קמח תירס (CM).
   1. שים 30 גרם של שמרים לתוך 100 מ"ל של מי ברז, להביא אותו לרתיחה ולתת לו לרתיחה במשך 15 דקות.
   2. בנפרד, מערבבים היטב 90 גרם של קמח תירס מבושל מראש, 100 גרם סוכר, ו 4 גרם של אגר לתוך 900 מ"ל של מי ברז.
   3. מביאים את הפתרון לרתיחה, מנמיכים את החום ומבשלים במשך 5 דקות תוך ערבוב רצוף.
   4. לאחר 5 דקות, מוסיפים את תמיסת השמרים החמים ומבשלים עוד 15 דקות.
   5. לכבות את מקור החום ולאפשר את הפתרון להתקרר על 60 מעלות צלזיוס.
   6. מוסיפים 5 מ"ל/ל' של 10% מתיל 4-הידרוקסיבנזואט באתנול, מערבבים היטב ומניחים לו לשבת במשך 10 דקות.
      שים לב: היזהר עם כמות מתיל 4-hydroxybenzoate, בהתחשב בכך ריכוז גבוה של קוטל פטריות יכול להיות קטלני עבור זחלים.
   7. מחלקים את המדיום לבקבוקונים/בקבוקונים: 8 מ"ל לכל בקבוקון זבוב (25 מ"מ x 95 מ"מ), 3 מ"ל לכל בקבוקון זבוב (22 מ"מ x 63 מ"מ) ו-60 מ"ל לכל בקבוק זבוב (250 מ"ל).
   8. מכסים בקבוקונים במטלית גבינה ומאפשרים להם להתייבש בטמפרטורת החדר (RT) למשך 24 שעות לפני האחסון.
   9. כייל עקביות והידרציה נכונה ניסיונית של CM על ידי שינוי כמות אגר בשימוש ו / או את זמני הקירור / ייבוש.
      הערה: בקבוקונים מנותקים, ארוזים ועטופים יציבים במשך כ -15 ימים ב 4 מעלות צלזיוס.
2. למבוגרים דרוזופילים, יש להשתמש במדיום המכיל 10% אבקת שמרים, 10% סוכרוז, 2% אגר, ולאחר מכן נקרא בינוני למבוגרים (AM).
   1. מערבבים 10 גרם של אבקת שמרים, 10 גרם סוכרוז, 2 גרם אגר לתוך 100 מ"ל של מים מזוקקים.
   2. מביאים את התערובת לרתיחה פעמיים, במרווח של 3 דקות, או עד שהאגר מתמוסס, באמצעות מיקרוגל.
   3. לאחר שהפתרון מתקרר ל 60 °C (60 °F), להוסיף 5 מ"ל / ליטר של 10% מתיל 4-hydroxybenzoate באתנול, לערבב ביסודיות לוותר על בקבוקונים (10 מ"ל לכל בקבוקון).
   4. מכסים בקבוקונים במטלית גבינה ומניחים להם להתייבש ב- RT במשך 24 שעות לפני האחסון.
      הערה: בקבוקונים מנותקים, ארוזים ועטופים יציבים במשך כ -15 ימים ב 4 מעלות צלזיוס.

2. מינון דרוזופילה EDC

1. הכן פתרון מלאי מתאים המסת EDC שנבחר בממס המתאים. עבור EE2 (משקל מולקולרי 296.403), להמיס 1.48 גרם ב 10 מ"ל של 100% אתנול לעשות פתרון 0.5 M מלאי ולאחסן ב -80 °C (60 °F).
   אזהרה: EDCs נחשבים מזהמים סביבתיים ויש לנקוט אמצעי זהירות בטיפול בהם.
2. לדלל את פתרון המניה EE2 ב 10% אתנול במים (v / v) על מנת לקבל פתרון 100 מ"מ. בצע את הדילולים הבאים (0.1 מ"מ, 0.5 מ"מ ו 1 מ"מ) במזון CM, החל בריכוז הנמוך ביותר ושימוש באותו ריכוז סופי של ממס עבור כל קבוצת טיפול. עבור בקבוקוני הבקרה להשתמש באותו נפח של הממס לבד.
   הערה: מומלץ לשמור על הריכוז הסופי של הממס נמוך ככל האפשר, תוך התחשבות כי הריכוז הסופי של אתנול לא יעלה על 2% במזון לטוס.
3. מוסיפים את הפתרון המכיל את הדילול הנכון של EDC שנבחר למזון המבוסס על קמח תירס לפני התגבשות, מערבבים ביסודיות עם מעבד מזון, מחלקים 10 מ"ל לבקבוקונים, מכסים עם גזה כותנה ומניחים להתייבש ב- RT במשך 16 שעות לפני השימוש.
   הערה: השתמש במדיום זה מיד לאחר הכנתו.
4. לגידול מבוגרים, הכינו פתרונות EE2 עובדים שונים (10 מ"מ, 50 מ"מ ו-100 מ"מ, בהתאמה) ב-10% אתנול במים (v/v) ושכבה של 100 מיקרו-ל' מכל אחד על פני השטח של AM, על מנת להשיג את הריכוז הרצוי של ה-EE2 (0.1 מ"מ, 0.5 מ"מ ו-1 מ"מ). עבור הבקרה להשתמש באותו נפח של הממס לבד.
   הערה: לחלופין, להוסיף את הפתרון המכיל את הדילול הנכון של EDC שנבחר לכמות קטנה של AM בצינור חרוט 50 מ"ל, מערבולת ביסודיות ריבוד 1 מ"ל של זה על פני השטח של בקבוקונים AM.
   1. מכסים בקבוקונים עם גזה כותנה, לאפשר ייבוש ב RT עבור 12-16 שעות תחת תסיסה עדינה ולהשתמש בהם מיד.
      הערה: יש להתאים את תהליך הייבוש באופן ניסיוני מכיוון שהוא תלוי בלחות הסביבה.

3. גידול זבובים

1. השתמש בזן איזוגני חזק, כגון אורגון R, המתוחזק על ידי מספר דורות במעבדה.
2. שמור זבובים באינקובטור לח, מבוקר טמפרטורה, עם אור טבעי 12 שעות: 12 שעות פוטופריוד כהה ב 25 מעלות צלזיוס בבקבוקונים המכילים מזון CM.
3. בכל מבחנים, השתמשו בבקבוקונים בכתובת RT.

4. פרוטוקול תוחלת חיים

1. הגדר 20 בקבוקונים של זבובים עם 8 נקבות ו 4 זכרים ובית ב 25 °C (70 °F) ב CM (10 מ"ל כל אחד).
2. לאחר 4 ימים להשליך זבובים ומניחים בקבוקונים בחזרה באינקובטור.
   הערה: זבובים אלה יכולים לשמש כדי להתחיל שוב כדי להשיג קבוצות מסונכרנות גיל אחרות של הזבובים.
3. בשעות אחר הצהריים המאוחרות של היום 9, להסיר את כל הזבובים eclosed החדש מן הבקבוקונים ולהחזיר בקבוקונים לאינקובטור.
   הערה: כמה מבוגרים צריכים להתחיל eclose כבר ביום התשיעי; השלכת זבובים אלה מאפשרת לאסוף מספר מרבי של זבובים מסונכרנים, הימנעות הבחירה הרשלנית של המתעוררים מוקדם.
4. 16-24 שעות מאוחר יותר, להעביר את הזבובים הבוגרים (1 יום אחד) של שני המינים לארבע קבוצות של בקבוקי 250 מ"ל המכילים מזון AM בתוספת שלושה ריכוזי EDC שונים ואחד עם הממס לבד. במידת הצורך, לאסוף אצווה אחרת למחרת.
5. לשמור על זבובים ב 25 מעלות צלזיוס במשך 2-3 ימים כדי לאפשר להם להזדווג.
   הערה: יום ההעברה לבקבוקוני מזון AM מתאים ליום הראשון של הבגרות.
6. לאחר יומיים-שלושה, למיין כל קבוצה של זבובים על ידי מין לשתי קבוצות תחת אור CO₂ המרדים. באופן אקראי לחלק כל מין לחמישה בקבוקונים לכל טיפול בצפיפות של 20 אנשים לכל בקבוקון, עד שיש שלושה שכפולים של 5 בקבוקונים מקבילים לכל מין לכל טיפול.
   שים לב: לעבוד עם קבוצות קטנות של זבובים על מנת למנוע בעיות בריאותיות אפשריות לאורך זמן עקב זמן חשיפה ארוך ל CO₂.
7. הכינו גיליון אלקטרוני של תוחלת חיים שבו מספר הזבובים המתים מנוכה ממספר הזבובים ששרדו להעברה הקודמת, באופן שיקבל באופן אוטומטי את מספר הניצולים בכל העברה.
8. העברה טסה לבקבוקונים חדשים המכילים את המזון המתאים כל 3 ימים בו זמנית ולבדוק אם יש מוות.
   הערה: ההעברה חייבת להתבצע ללא הרדמה שיכולה להיות השפעה שלילית ארוכת טווח על אריכות ימים לטוס.
   1. בכל העברה, רשום את גיל הזבובים ואת מספר הזבובים המתים.
      הערה: מספר הזבובים ששרדו מחושב באופן אוטומטי בגיליון האלקטרוני, אך מומלץ לבדוק אותו באופן חזותי. זבובים שבטעות גם לברוח או למות במהלך ההעברה לא צריך להיחשב. היזהר לא לספור פעמיים זבובים מתים נישא אל הבקבוקון החדש דיווח הערה זו בגיליון האלקטרוני.
   2. חזור על שלבים 4.8 ו- 4.8.1 עד שכל הזבובים ימותו.
9. עבור כל קבוצת טיפול, צור עקומת הישרדות כפי שמוצג באיור 1, כדי להציג את הסתברות ההישרדות של זבוב בכל זמן נתון.
10. בצע שלושה ניסויים עצמאיים עבור כל קבוצת טיפול של זבובים, באמצעות 100 זבובים חדשים eclosed עבור כל ניסוי.
11. הכינו טבלה שבה ניתן לדווח על תוחלת החיים הממוצעת (ממוצע ימי ההישרדות של כל הזבובים לכל קבוצה), על זמן מחצית המוות (פרק זמן בימים הנדרשים כדי להגיע ל-50% תמותה) ועל תוחלת החיים המרבית (כמות הימים המרבית הדרושה כדי להגיע ל-90% תמותה).
12. חשב את ההבדלים באחוזים בין כל קבוצת טיפול ביחס לקבוצת הביקורת.
13. בצע ניתוח סטטיסטי כדי להשוות בין קבוצות הטיפול השונות.

Representative Results

איור 1: עקומות תוחלת חיים. משמאל, מדווחת טבלה מייצגת שבה נרשם מספר הזבובים המתים כל 3 ימים, הן עבור קבוצת הטיפול (בינוני + EDC [0.05 mM EE2]) והן עבור קבוצת הביקורת (בינוני + ממס), לאורך כל תקופת הניסוי. תוחלת החיים הממוצעת של כל קבוצה חושבה באמצעות הסכום MATRIX. מוצר; הקבוצה המטופלת קיצרה את תוחלת החיים הממוצעת בהשוואה לקבוצת הביקורת. בצד ימין, עקומת הישרדות טיפוסית מוצגת של זבובים זכרים המוזנים במדיום המכיל EE2 (0.05 מ"מ) או רק אתנול לבקרה. עקומת ההישרדות ירדה במהירות רבה יותר עבור זבובים מטופלים מאשר עבור קבוצת הביקורת, עם נקודת מפנה מוקדמת יותר. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
17α-Ethinylestradiol	Sigma	E4876-1G
Agar for Drosophila medium	BIOSIGMA	789148
Cornmeal	CA' BIANCA
Drosophila Vials	BIOSIGMA	789008	25 mm x 95 mm
Drosophila Vials	BIOSIGMA	789009	29 mm x 95 mm
Drosophila Vials	Kaltek	187	22 mm x 63 mm
Ethanol	FLUKA	2860
Glass Bottle			250 mL Bottles
Glass Vials	Microtech	ST 10024	Flat bottom tube 100 x 24
Instant Success yeast	ESKA		Powdered yeast
Methyl4-hydroxybenzoate	SIGMA	H5501
Stereomicroscope with LED lights	Leica		S4E
Sucrose	HIMEDIA	MB025
Hand blender Pimmy	Ariete		food processor