Levetidsprotokoll for Drosophila melanogaster: Genererer overlevelseskurver for å identifisere forskjeller i flylevetid

Overview

Forskere bruker Drosophila levetidsprotokoll for å måle hvordan forskjellige eksperimentelle forhold påvirker fluenes levetid og genererer overlevelseskurver i prosessen for å kvantifisere de eksperimentelle resultatene. Utvalgsprotokollen inneholder analysen som brukes til å studere effektene på lang levetid fra eksponering til varierende konsentrasjoner av endokrine disruptorkjemikalier, eller EDCer, for eksempel 17-α-etinyløstradiol (EE2).

Protocol

Denne protokollen er et utdrag fra Bovier et al., Metoder for å teste endokrine forstyrrelser i Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2019).

1. Matlaging

1. For lagervedlikehold og for larvevekst, bruk et maismelmedium som inneholder 3% pulverisert gjær, 10% sukrose, 9% forkokt maismel, 0,4% agar, deretter kalt Cornmeal medium (CM).
   1. Sett 30 g gjær i 100 ml vann fra springen, kok opp og la det koke i 15 min.
   2. Bland godt 90 g forkokt maismel, 100 g sukker og 4 g agar i 900 ml vann fra springen.
   3. Kok opp løsningen, senk varmen og kok i 5 minutter omrøring kontinuerlig.
   4. Etter 5 minutter, tilsett den varme gjærløsningen og kok i ytterligere 15 minutter.
   5. Slå av varmekilden og la oppløsningen avkjøles til ca. 60 °C.
   6. Tilsett 5 ml/l 10 % metyl 4-hydroksybenzoat i etanol, bland grundig og la det sitte i 10 min.
      MERK: Vær forsiktig med mengden metyl 4-hydroksybenzoat, gitt at en høy konsentrasjon av soppdrepende midler kan være dødelig for larver.
   7. Del ut mediet i hetteglass/flasker: 8 ml i hvert flueflaske (25 mm x 95 mm), 3 ml i hvert flueflaske (22 mm x 63 mm) og 60 ml i hver flueflaske (250 ml).
   8. Dekk hetteglass med osteklær og la dem tørke ved romtemperatur (RT) i 24 timer før lagring.
   9. Kalibrer eksperimentelt riktig konsistens og hydrering av CM ved å endre enten mengden agar som brukes og/eller kjøle-/tørketidene.
      MERK: Hetteglassene med koblede, innkatter og innpakkede hetteglass er stabile i ca. 15 dager ved 4 °C.
2. For Drosophila voksne, bruk et medium som inneholder 10% pulverisert gjær, 10% sukrose, 2% agar, deretter kalt voksen medium (AM).
   1. Bland 10 g pulverisert gjær, 10 g sukrose, 2 g agar i 100 ml destillert vann.
   2. Kok opp denne blandingen to ganger, med et intervall på 3 minutter, eller til agaren er oppløst, ved hjelp av en mikrobølgeovn.
   3. Når oppløsningen er avkjølt til 60 °C, tilsett 5 ml/l 10 % metyl 4-hydroksybenzoat i etanol, bland grundig og dispenser i hetteglass (10 ml per hetteglass).
   4. Dekk hetteglass med osteklær og la dem tørke i RT i 24 timer før lagring.
      MERK: Hetteglassene med koblede, innkatter og innpakkede hetteglass er stabile i ca. 15 dager ved 4 °C.

2. Drosophila EDC Dosering

1. Forbered en passende lagerløsning som oppløser den valgte EDC i det aktuelle løsningsmidlet. For EE2 (molekylvekt 296.403), oppløs 1,48 g i 10 ml 100% etanol for å lage en 0,5 M lagerløsning og lagre ved -80 °C.
   FORSIKTIG: EDCer regnes som miljøgifter og forholdsregler bør tas i håndteringen av dem.
2. Fortynn EE2-lagerløsningen i 10% etanol i vann (v / v) for å oppnå en 100 mM løsning. Lag neste fortynning (0,1 mM, 0,5 mM og 1 mM) i CM-mat, start med laveste konsentrasjon og bruk samme endelige konsentrasjon av løsningsmiddel for hver behandlingsgruppe. For kontroll hetteglassene bruk samme volum av løsningsmidlet alene.
   MERK: Det anbefales å holde den endelige konsentrasjonen av løsningsmidlet så lav som mulig, med tanke på at den endelige konsentrasjonen av etanol ikke bør overstige 2% i flymat.
3. Tilsett oppløsningen som inneholder riktig fortynning av den valgte EDC til maismelbasert mat før størkning, bland grundig med en matprosessor, dispenser 10 ml i hetteglass, dekk med bomullsgass og la tørke ved RT i 16 timer før bruk.
   MERK: Bruk dette mediet umiddelbart etter tilberedningen.
4. For oppdrett av voksne, forbered forskjellige fungerende EE2-løsninger (henholdsvis 10 mM, 50 mM og 100 mM) i 10% etanol i vann (v / v) og lag 100 μL av hver på overflaten av AM, for å oppnå ønsket konsentrasjon av EE2 (0,1 mM, 0,5 mM og 1 mM). For kontrollen bruk samme volum av løsningsmidlet alene.
   MERK: Alternativt kan du legge til oppløsningen som inneholder riktig fortynning av den valgte EDC til en liten mengde AM i et 50 ml konisk rør, virvel grundig og stratifisere 1 ml av det på overflaten av AM-hetteglassene.
   1. Dekk hetteglass med bomullsgass, la tørking på RT i 12-16 timer under mild agitasjon og bruk dem umiddelbart.
      MERK: Tørkeprosessen bør justeres eksperimentelt fordi det avhenger av omgivelsesfuktigheten.

3. Oppdrett fluer

1. Bruk en robust isogen stamme, for eksempel Oregon R, vedlikeholdt av flere generasjoner i laboratoriet.
2. Hold fluer i en fuktet, temperaturkontrollert inkubator, med et naturlig 12-timers lys: 12 timers mørk fotoperiod ved 25 °C i hetteglass som inneholder CM-mat.
3. Bruk hetteglassene ved RT i hver analyse.

4. Levetidsprotokoll

1. Sett opp 20 hetteglass med fluer med 8 kvinner og 4 menn og hus ved 25 °C i CM (10 ml hver).
2. Etter 4 dager kast fluer og legg hetteglassene tilbake i inkubatoren.
   MERK: Disse fluene kan brukes til å starte på nytt for å få andre alderssynkroniserte kohorter av fluene.
3. På sen ettermiddag på dag 9, fjern alle nylig lukkede fluer fra hetteglassene og returner hetteglassene til inkubatoren.
   MERK: noen voksne bør begynne å eclose så tidlig som den niende dagen; å kaste disse fluene gjør det mulig å samle et maksimalt antall synkroniserte fluer, og unngå uforsiktig utvalg av tidlig fremvoksende.
4. 16-24 timer senere, overfør de voksne fluene (1 dag gamle) av begge kjønn til fire grupper på 250 ml flasker som inneholder AM-mat supplert med tre forskjellige EDC-konsentrasjoner og en med løsningsmidlet alene. Samle om nødvendig en ny bunke neste dag.
5. Opprettholde fluer ved 25 °C i 2-3 dager slik at de kan parre seg.
   MERK: Overføringsdagen til AM-hetteglass tilsvarer den første dagen i voksen alder.
6. Etter to-tre dager sorterer du hver kohort av fluer etter kjønn i to grupper under lett CO_{2-bedøvelse.} Del hvert kjønn tilfeldig inn i fem hetteglass per behandling med en tetthet på 20 personer per hetteglass, til det er tre replikeringer av 5 parallelle hetteglass for hvert kjønn per behandling.
   MERK: Arbeid med små grupper av fluer for å forhindre mulige langvarige helseproblemer på grunn av lang eksponeringstid for CO₂.
7. Forbered et levetidsregneark der antall døde fluer trekkes fra antall overlevende fluer til forrige overføring, på en slik måte at man automatisk får antall overlevende ved hver overføring.
8. Overfør fluer til nye hetteglass som inneholder tilsvarende mat hver tredje dag samtidig og se etter død.
   MERK: Overføringen må skje uten anestesi som kan ha en langsiktig negativ effekt på flylevetiden.
   1. Ved hver overføring registrerer du fluenes alder og antall døde fluer.
      MERK: Antall overlevende fluer beregnes automatisk i regnearket, men det anbefales å sjekke det visuelt. Fluer som ved et uhell både unnslipper eller dør under overføringen, bør ikke vurderes. Vær forsiktig så du ikke teller to ganger døde fluer som bæres til det nye hetteglasset som rapporterer dette notatet i regnearket.
   2. Gjenta trinn 4.8 og 4.8.1 til alle fluer dør.
9. For hver behandlingsgruppe oppretter du en overlevelseskurve som vist i figur 1, for å vise overlevelsessannsynligheten for en flue på et bestemt tidspunkt.
10. Utfør tre uavhengige eksperimenter for hver behandlingsgruppe av fluer, ved å bruke 100 nylig lukkede fluer for hvert eksperiment.
11. Forbered en tabell der du kan rapportere gjennomsnittlig levetid (gjennomsnittlige overlevelsesdager for alle fluer for hver gruppe), halv dødstid (tidsperiode i dager som kreves for å nå 50% dødelighet) og maksimal levetid (maksimal mengde dager som trengs for å nå 90% dødelighet).
12. Beregne forskjeller i prosent mellom hver behandlingsgruppe i forhold til kontrollgruppen.
13. Utføre statistisk analyse for å sammenligne de ulike behandlingsgruppene.

Representative Results

Figur 1: Levetidskurver. Til venstre rapporteres det om et representativt bord der antall døde fluer er registrert hver tredje dag, både for behandlingsgruppen (medium + EDC [0,05 mM EE2]) og for kontrollgruppen (medium + løsningsmiddel), gjennom hele eksperimentell periode. Gjennomsnittlig levetid for hver gruppe er beregnet ved hjelp av MATRIX SUM. PRODUKT; den behandlede gruppen forkortet gjennomsnittlig levetid sammenlignet med kontrollgruppen. Til høyre vises en typisk overlevelseskurve av mannlige fluer matet med medium som inneholder EE2 (0,05 mM) eller bare etanol for kontrollen. Overlevelseskurven gikk raskere ned for behandlede fluer enn for kontrollgruppen, med et tidligere vendepunkt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
17α-Ethinylestradiol	Sigma	E4876-1G
Agar for Drosophila medium	BIOSIGMA	789148
Cornmeal	CA' BIANCA
Drosophila Vials	BIOSIGMA	789008	25 mm x 95 mm
Drosophila Vials	BIOSIGMA	789009	29 mm x 95 mm
Drosophila Vials	Kaltek	187	22 mm x 63 mm
Ethanol	FLUKA	2860
Glass Bottle			250 mL Bottles
Glass Vials	Microtech	ST 10024	Flat bottom tube 100 x 24
Instant Success yeast	ESKA		Powdered yeast
Methyl4-hydroxybenzoate	SIGMA	H5501
Stereomicroscope with LED lights	Leica		S4E
Sucrose	HIMEDIA	MB025
Hand blender Pimmy	Ariete		food processor